CN112920075A - 一种酰胺类化合物、组合物及其在制备具有抗氧化或抗炎作用的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体公开了一种酰胺类化合物、组合物及其在制备具有抗氧化或抗炎作用的产品中的应用。本发明所述的酰胺类化合物，具有式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构。本发明还提供一种组合物，其包含式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的酰胺类化合物。实验表明本发明所述的酰胺类化合物及其组合物具有优异的抗UVB诱导的皮肤细胞氧化、炎性损伤作用。

Description

一种酰胺类化合物、组合物及其在制备具有抗氧化或抗炎作 用的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种酰胺类化合物、组合物及其在制备具有抗氧化或抗炎作用的产品中的应用。

背景技术

研究认为外界损伤刺激是皮肤老化的重要原因。其中，紫外线B(UVB，波长280-315nm)照射是导致面部皱纹的、皮肤光老化的重要原因之一。据报道， UVB能够影响成纤维细胞的生理功能，UVB辐照会显著促进人角质形成细胞的凋亡。据报道，大多数皮肤疾病，如癌症、光老化、晒伤和色素沉着，都与UVB 暴露密切相关。对人表皮样癌A431细胞的研究表明，UVB辐射会诱导A431细胞自噬。

氧化应激和炎症是UVB诱导皮肤老化的关键病理因素。皮肤光老化的特点是真皮细胞外基质(ECM)周转增加。基质金属蛋白酶(MMPs)负责结缔组织中胶原ECM的降解。MMP-1优先降解原纤维胶原；而MMP-3降解一系列极为广泛的ECM底物，并能激活其它MMP分泌的酶原。紫外线照射体外培养的人真皮成纤维细胞，也可显著诱导MMPs的表达。而紫外线诱导的基质金属蛋白酶的过度降解在很大程度上导致了光老化过程中发生的结缔组织损伤。

NAD(P)H：氧化酶(NOX)是一类可诱导的膜结合酶和胞浆酶，参与活性氧(ROS)的产生。NOX-4是NOX家族的一员，是一种参与癌细胞转化、增殖和迁移的癌蛋白。NOX参与UVB诱导的人角质形成细胞ROS的产生。环氧合酶-2(COX-2)是前列腺素生物合成的限速酶，与光老化有关。COX-2的高表达在UVB照射的小鼠皮肤的氧化应激中已有研究。此外，COX-2的药理抑制对 UVB诱导的小鼠皮肤肿瘤的发生具有保护作用。

因此，开发一种具有抗UV导致皮肤细胞氧化、炎性损伤作用的化合物，对于防止皮肤疾病具有重要的应用价值。

发明内容

鉴于此，本发明首先提供一种全新结构的酰胺类化合物，经进一步研究表明，所述的酰胺类化合物具有抗UV导致皮肤细胞氧化和炎性损伤作用。

本发明的详细技术方案如下：

本发明的第一方面，提供一种酰胺类化合物，其具有式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构：

其中式Ⅰ所示结构的酰胺类化合物在本发明中称为人参酚酰胺-1、式Ⅱ所示结构的酰胺类化合物在本发明中称为酵母菌酚酰胺-2。

人参酚酰胺-1可以通过从人参中分离纯化得到或通过人工合成方法得到。

酵母菌酚酰胺-2可以通过从酵母菌中分离纯化得到或通过人工合成方法得到。

人参酚酰胺-1或酵母菌酚酰胺-2从人参或酵母菌中分离纯化的具体方法为：

将人参或酵母菌提取物与有机溶剂混合，萃取得到水相层，经过真空低温冻干后经色谱法分离及HPLC制备得到所述的人参酚酰胺-1或酵母菌酚酰胺-2。

进一步可选的，所述人参或酵母菌提取物与所述有机溶剂的体积比为1： (2.5-10)。

具体的，可以但不限于为：80g人参(或酵母菌)提取物、500mL乙酸乙酯和4000mL水混合，萃取得水层，并重复3次，经过真空低温冻干后经色谱法分离及HPLC制备即得所述的人参酚酰胺-1或酵母菌酚酰胺-2。

人参酚酰胺-1或酵母菌酚酰胺-2的人工合成方法详见实施例。

本发明的第二方面，提供一种组合物，其包含式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的酰胺类化合物。

优选地，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的酰胺类化合物的质量比为1～3:1～3。

最优选地，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的酰胺类化合物的质量比为1:1。

优选地，所述的组合物还包含载体，其中，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的酰胺类化合物在组合物中的所占的质量分数为10％-85％。

进一步优选地，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的酰胺类化合物在组合物中的所占的质量分数为10％-50％、15％-65％或20％-85％。

优选地，所述的载体包括溶剂、聚合物和脂质体中的至少一种。

进一步优选地，所述溶剂包括但不限于水、生理盐水，以及其它非水性溶剂。

进一步优选地，所述聚合物可以但不限于为聚赖氨酸、聚乙烯亚胺及其改性物、壳聚糖、聚乳酸、明胶。

进一步优选地，所述脂质体可以但不限于为胆固醇、豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂。进一步可选的，所述载体还包括稀释剂和赋形剂中的一种或多种。

本发明的第三方面，提供上述酰胺类化合物或组合物在制备具有抗氧化和/ 或抗炎作用的产品中的应用。

优选地，所述的抗氧化和/或抗炎作用具体是指抗UV导致皮肤细胞氧化和/ 或炎性损伤作用。

优选地，上述酰胺类化合物或组合物在制备具有抗光老化、抗炎、防皱、防晒或防止色素沉着作用的产品中的应用。

优选地，上述酰胺类化合物或组合物在制备具有治疗或预防皮肤晒伤作用的产品中的应用。

优选地，上述酰胺类化合物或组合物在制备具有治疗或预防皮肤癌作用的产品中的应用。

优选地，所述的产品为化妆品、护肤品、食品、保健品或药物。

进一步优选地，所述化妆品或护肤品包括乳液、霜膏、凝胶、水剂、油剂、粉剂或面膜。

进一步优选地，所述食品、保健品或药物的形式包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂。

有益效果：本发明提供了一种全新结构的酰胺类化合物；在本发明中，通过建立体外活性化合物组合抗UVB诱导的H929细胞氧化、炎性损伤的实验模型进行试验，进一步发现本发明所述酰胺类化合物的组合可以通过降低细胞内 UVB诱导的ROS含量降低、基质金属蛋白酶分泌增加，降低细胞凋亡，达到保护目的；实验表明本发明所述的酰胺类化合物及其组合物具有优异的抗UVB诱导的皮肤细胞氧化、炎性损伤活性；由于癌症、光老化、晒伤和色素沉着等皮肤疾病都与UVB诱导的皮肤细胞氧化、炎性损伤活性密切相关；因此，本发明所述的化合物具有可以进一步用于具有防癌、防晒、防止色素沉着或抗光老化作用的化妆品、护肤品、食品、保健品或药物。此外，本发明所述的酰胺类化合物制备工艺简单、操作方便，制得的抗氧化、抗炎酚酰胺小分子化合物纯度高，在推广应用时可以降低生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是人参酚酰胺-1的¹H-NMR谱。

图2是人参酚酰胺-1的¹³C-NMR谱。

图3是酵母菌酚酰胺-2的¹H-NMR谱。

图4是酵母菌酚酰胺-2的¹³C-NMR谱。

图5是RJZ抑制UVB诱导的H929细胞ROS过量分泌实验结果图。

图6是RJZ抑制UVB诱导的H929细胞线粒体膜电位下降实验结果图。

图7是RJZ抑制UVB辐照诱发的H929细胞线粒体细胞色素C减少实验结果。

图8是RJZ抑制UVB辐照导致的H929细胞凋亡实验结果。

图9是RJZ抑制UVB辐照导致的H929细胞MMPs高表达实验结果。

图10是RJZ抑制UVB辐照导致的H929细胞NF-κB信号通路激活实验结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1人参酚酰胺-1和酵母菌酚酰胺-2的合成

称取反应底物2,3,4-三甲氧基苯甲酸(2.12g,10.0mmol)于100mL干净的圆底烧瓶中，放入磁子，加入30mL无水二氯甲烷，搅拌下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.3g,12mmol),1-羟基苯并三唑(1.62g,12mmol) 及N,N-二异丙基乙胺(3.88g,30mmol)。加料结束后，反应体系置于室温下搅 10分钟，接着加入另一底物甘氨酸乙酯盐酸盐(1.54g,11mmol),并于室温下继续反应4小时，TLC监测反应原料消失。停止搅拌，将反应体系减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(200-300目)，纯化得白色固体2.5g，经鉴定为目标产物 (2,3,4-三甲氧基苯甲酰基)甘氨酸乙酯(AZ-1)。

将(2,3,4-三甲氧基苯甲酰基)甘氨酸乙酯(AZ-1)(2.5g,8.41mmol)加入到100毫升圆底烧瓶中，放入磁子，取甲醇：水(4:1)20mL倒入反应瓶中，室温搅拌下加入氢氧化锂(0.61g,25.23mmol),接着在室温下搅3小时直至反应转化完全。将反应体系甲醇减压蒸除，调节PH至6-7，有白色固体析出，过滤干燥得(2,3,4-三甲氧基苯甲酰基)甘氨酸(AZ-2)2.19g。

称取反应原料(2,3,4-三甲氧基苯甲酰基)甘氨酸(2.19g,8.15mmol)于 100mL干净的圆底烧瓶中，放入磁子，加入25mL干燥的二氯甲烷，搅拌下加入 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.87g,9.78mmol),1-羟基苯并三唑 (1.32g,9.78mmol)及N,N-二异丙基乙胺(3.16g,24.5mmol)。加料结束后，反应体系置于室温下搅10分钟，接着加入另一底物苯丙氨酸甲酯盐酸盐(1.93g,8.97 mmol),并于室温下继续反应4小时，TLC监测反应原料消失停止搅拌，将反应体系减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(200-300目)，纯化得白色固体2.98g，经鉴定为酵母菌酚酰胺-2(AZ-3)；其英文命名为：methyl (2,3,4-trimethoxybenzoyl)glycylphenylalaninate。

将酵母菌酚酰胺-2(AZ-3)(1.0g,2.32mmol)加入到100毫升圆底烧瓶中，放入磁子，取甲醇：水(4:1)15mL倒入反应瓶中，室温搅拌下加入氢氧化锂 (168mg,7mmol),接着在室温下搅3小时直至反应转化完全。将反应体系甲醇减压蒸除，调节PH至6-7，析出白色固体，经过滤干燥得(2,3,4-三甲氧基苯甲酰基)甘氨酰苯丙氨酸(AZ-4)946mg.

称取反应原料(2,3,4-三甲氧基苯甲酰基)甘氨酰苯丙氨酸(AZ-4)(500mg,1.2mmol)于100mL干净的圆底烧瓶中，放入磁子，加入10mL干燥的二氯甲烷，搅拌下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(276mg,1.44mmol),1- 羟基苯并三唑(194.5mg,1.44mmol)及N,N-二异丙基乙胺(466mg,3.6mmol)。加料结束后，反应体系置于室温下搅10分钟，接着加入另一底物丝氨酸甲酯盐酸盐(210mg,1.35mmol),并于室温下继续反应4小时，TLC监测反应原料消失停止搅拌，将反应体系减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(200-300目)，纯化得白色固体478mg(yield:77％)，经鉴定为人参酚酰胺-1(AZ-5)；英文名为：methyl(2,3,4-trimethoxybenzoyl)glycylphenylalanylserinate。

人参酚酰胺-1的氢谱及碳谱数据如下：¹H NMR:3.01(1H,t),3.24(4H,m), 3.33(2H,t),3.78(3H,s),3.89(3H,s),3.96(6H,d),4.27(2H,t),4.58(1H,m),6.95 (1H,d),7.25(5H,m),7.76(1H,d)；¹³C NMR:9.23,38.74,44.04,52.64,55.70,56.31, 56.66,61.32,62.51,62.83,108.83,119.37,127.28,127.76,129.44,130.40,138.17, 143.23,154.19,158.48,167.74,171.35,171.96,173.41.

酵母菌酚酰胺-2的氢谱及碳谱数据如下：¹H NMR:3.06(1H,td),3.19(1H, dd),3.75(3H,s),3.89(3H,s),3.99(6H,d),4.17(2H,t),4.81(1H,t),6.96(1H,d), 7.25(5H,m),7.78(1H,d)；¹³C NMR:38.52,52.74,55.12,56.63,61.30,62.47, 108.81,119.41,127.24,127.92,129.52,130.27,137.84,143.23,154.15,158.43, 167.47,171.14,173.23.

实验例

为了评估本发明上述方法制备得到的酰胺类化合物的抗UV导致皮肤细胞氧化、炎性损伤效果，进行如下试验：

永生化角质形成细胞系H929细胞培养于细胞培养箱中，37℃、5％CO₂ (RPMI-1640培养基)。UVB的辐照强度为25mJ/cm²，辐照光源与细胞相距15 cm。辐照时吸去各组培养细胞培养液，PBS冲洗2次，再加入少量覆盖底面避免干燥。培养板于室温水浴下照光以避免辐照后过热。辐照后再弃去PBS，重新加入RPMI-1640培养基或酰胺类化合物(5μM)培养基继续培养24h。CCK8 方法检测细胞活力，收集细胞和培养液。本发明中RJZ表示人参酚酰胺-1和酵母菌酚酰胺-2等质量比的组合物。

实验分为4组：正常对照组；UVB辐照组；10μM组(UVB辐照+RJZ 10μM)； 50μM组(UVB辐照+RJZ 50μM)。每个处理条件3个复孔，重复实验3次。正常对照组不接受UVB辐照，UVB辐照组、RJZ-L组、RJZ-H组则分别接受UVB 辐照。

H929细胞按实验设计处理后，收集细胞培养液；参考试剂盒操作说明书检测ROS的含量及流式细胞术检测线粒体膜电位变化。

H929细胞按实验设计处理后，收集细胞，在室温下于2000g离心3min。细胞在预冷1×PBS中悬浮，2000g离心3min，洗涤细胞。Annexin V-FITC/PI 双染色实验按照制造商的说明进行。流式细胞仪检测细胞凋亡，所有实验至少重复3次。

相关细胞信号通路蛋白表达变化检测方法如下：H929细胞按实验设计处理后，收集细胞，用预冷的PBS洗2次，加入50μL细胞裂解液，4℃静置30min。 10000r/min离心15min，取上清提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上。用5％脱脂奶粉室温封闭2h。随后加入一抗，4℃轻摇过夜，用TBST洗3次，加入相应的二抗，室温孵育1h，漂洗3次。

实验结果如下：

与Control组相比，UVB辐照使H929细胞内ROS含量增加，而RJZ使UVB 辐照诱发的ROS降低。研究显示，线粒体介导的凋亡途径可由多种因素触发，如线粒体功能障碍。ROS水平增加会进一步导致线粒体膜电位(ΔΨm)下降并导致细胞色素c(Cyt c)从线粒体释放到细胞质中。本实验中，与Control组相比，UVB辐照使细胞ΔΨm下降增加；线粒体Cyt c含量减少，而胞浆中Cyt c 含量增加，说明UVB辐照导致H929细胞氧化损伤。而RJZ抑制了UVB辐照诱发的ΔΨm下降及线粒体Cyt c的释放。该实验结果见图5、图6和图7。

UVB辐照可诱发DNA损伤及氧化应激进而导致角质细胞凋亡，最终，加重皮肤损伤。UVB辐照使H929细胞凋亡增加。经RJZ处理后H929细胞凋亡率明显下降。RJZ可通过减轻UVB辐照诱发的H929细胞凋亡以减轻其对皮肤造成的损伤。该实验结果见图8。

UVB激活MMPs的分泌是皮肤受损、老化的标志之一。为了研究RJZ对 UVB诱导的MMPs表达的影响，我们检测了RJZ对UVB诱导的MMPs分泌的影响。结果显示，UVB辐照使H929细胞MMP-1、MMP-3表达均显著增加，而RJZ可抑制UVB诱导的MMP-1和MMP-3表达。ELISA结果与Western blotting 结果类似，UVB辐照H929细胞后，MMP-1和-3分泌增加。而RJZ降低UVB辐照诱导的H929细胞MMP-1和-3分泌。该实验结果见图9。

ROS水平增加会进一步导致H929细胞氧化损伤、凋亡，线粒体介导的凋亡途径可由多种因素触发，包括NF-κB信号通路的激活，而NF-κB信号通路的激活会进一步导致炎症加重。在本研究中，UVB辐照可显著上调p65、p50及Iκbα的表达，而RJZ处理显著抑制了p65、p50及Iκbα的表达，表明RJZ通过抑制 NF-κB信号通路的激活来抑制UVB辐照导致的炎症反应，这些结果进一步提示 UVB通过NF-κB信号通路的激活诱发炎症反应并进一步导致H929细胞凋亡，而RJZ可阻断这一过程。该实验结果见图10。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种酰胺类化合物，其特征在于，具有式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构：

2.一种组合物，其特征在于，包含式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的酰胺类化合物。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的酰胺类化合物的质量比为1～3:1～3；最优选地，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的酰胺类化合物的质量比为1:1。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还包含载体，其中，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的酰胺类化合物在组合物中的所占的质量分数为10％-85％。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的载体包括溶剂、聚合物和脂质体中的至少一种。

6.权利要求1～5任一项所述的酰胺类化合物或组合物在制备具有抗氧化和/或抗炎作用的产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗氧化和/或抗炎作用具体是指抗UV导致皮肤细胞氧化和/或炎性损伤作用。

8.权利要求1～5任一项所述的酰胺类化合物或组合物在制备具有抗光老化、抗炎、防皱、防晒或防止色素沉着作用的产品中的应用。

9.权利要求1～5任一项所述的酰胺类化合物或组合物在制备具有治疗或预防皮肤癌作用的产品中的应用。

10.根据权利要求6～9任一项所述的应用，其特征在于，所述的产品为化妆品、护肤品、食品、保健品或药物。

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