JP6279668B2 - メラニン産生抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び創傷治癒促進作用を有する化合物 - Google Patents
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Description
本発明は、化合物に関し、特に天山雪蓮花から抽出される、メラニン産生抑制作用及びコラーゲン産生促進作用を有する化合物に関するものである。
メラニンは、皮膚のメラニン細胞（melanocyte）に存在するチロシナーゼの作用下で、酵素反応（enzymatic reaction）又は非酵素的酸化反応（non-enzymatic oxidation reaction）により、チロシンからドーパ（3，4-dihydroxyphenylalanine）を経由して作り出されるものである。皮膚のシミ、そばかすなどの色素沈着（pigmentation）に関する研究では、ホルモンの分泌が異常になると、又は紫外線を過度に浴びると、メラニンの大量産生及び皮膚内への沈着が起きやすくなることが判明された。
皮膚の美白（skin whitening）のため、美白医療従事者は、美白剤又は美白化粧料にＬ-アスコルビン酸、Ｌ-アスコルビン酸の誘導体、コウジ酸、アルブチン又はハイドロキノンをマッチングしたものを治療処方とし、メラニンの過剰沈着によるシミ又はそばかすの治療又は緩和を行っていた。
しかしながら、臨床治療では、上記治療処方には安定性又は溶解性が低い欠点があることが発見された。また、メラニンを薄くすること又は除去することにおける上記治療処方の効果は理想的なものではなかった。処方中のＬ-アスコルビン酸（又はコウジ酸）の濃度を上げて美白効果を高めることはできるものの、安全性の問題が伴う。
本発明の主な目的は、メラニン産生抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び創傷治癒促進作用を有する化合物を提供することにある。
上記課題を解決すべく、本発明の発明者らが鋭意研究を重ねた結果、メラニン産生抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び創傷治癒促進作用を有する、下記化学式Ｉで示される化合物を見出し、本発明を完成させた。該化合物は天山雪蓮花から抽出できる。
本発明は、綿頭雪蓮（Saussurea laniceps）から抽出されたチロシナーゼ阻害剤（tyrosinase inhibitor）又はメラニン生成阻害剤（melanogenesis inhibitor）とは異なる、メラニン産生抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び創傷治癒促進作用を有する化合物を提供する。実験により、該化合物は高い活性を有し、特にヒト皮膚線維芽細胞におけるＭＭＰ−９の遺伝子発現量を抑制する抑制活性、ＭＩＴＦの遺伝子発現量を抑制する抑制活性、コラーゲンの産生を促進する促進活性及びメラニンを抑制する抑制活性を有していることが実証された。
上記化合物は、天山雪蓮花のカルス（callus）から抽出されたものである。
本発明の好ましい実施例によれば、投与量８ｎｇ/ｍＬ〜１８ｎｇ/ｍＬの該化合物は、ヒト皮膚線維芽細胞（human normal skin fibroblasts）におけるＭＭＰ−９ゼラチナーゼの遺伝子発現量を５０％以上低下させることができる。
本発明の好ましい実施例によれば、投与量８ｎｇ/ｍＬ〜１８ｎｇ/ｍＬの該化合物は、ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン分泌量を少なくとも２０％増加させることができる。
本発明の好ましい実施例によれば、投与量８ｎｇ/ｍＬ〜１８ｎｇ/ｍＬの該化合物は、ヒト皮膚線維芽細胞におけるＭＩＴＦ（Microphthalmia-associated transcription factor，小眼球症関連転写因子）の遺伝子発現量を４５％以上低下させることができる。 本発明の好ましい実施例によれば、投与量８ｎｇ/ｍＬ〜１８ｎｇ/ｍＬの該化合物は、ヒト皮膚線維芽細胞におけるメラニンを少なくとも２０％低下させることができる。
本発明の好ましい実施例によれば、投与量８ｎｇ/ｍＬ〜１８ｎｇ/ｍＬの該化合物は、ヒト皮膚線維芽細胞における損傷エリアの閉鎖・修復パーセンテージを１.２１〜１.４倍増加させることができる。
本発明によれば、メラニン産生抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び創傷治癒促進作用を有する化合物を提供することができる。
本発明で開示するメラニン産生抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び創傷治癒促進作用を有する化合物をより明確にするため、以下、図面を参照しながら本発明の好ましい実施實施例を説明する。
天山雪蓮花（Saussurea involucrata）は、主に中国の新疆、青海、甘粛、雲南又はチベットなどの寒地に生息する植物であり、一般的には海抜２４００〜４１００メートルの雪線付近の岩間又は断崖で発見できる。天山雪蓮花には生物活性成分、栄養素及びミネラル元素が豊富に含まれているため、野生の天山雪蓮花に対する全面的な研究が国内外の研究者によって行われている。
本発明のメラニン産生抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び創傷治癒促進作用を有する化合物は、下記化学式Ｉで示されるものであり、天山雪蓮花から抽出できる。化学式Ｉで示される化学構造はセスキテルペノイド誘導体（Sesquiterpenoid derivative）である。
当業者が所定の製造工程又は方法により本発明の前記化合物を得られるように、該化合物の製造方法を以下に説明する。図１は、メラニン産生抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び創傷治癒促進作用を有する化合物の製造方法を示すフローチャートである。図１に示すように、該化合物の製造方法は主に下記５つのステップを含む。
ステップ（Ｓ１）：天山雪蓮花（Saussurea involucrata）の外植片培地を調製する。
ステップ（Ｓ２）：該外植片培地からカルス培地を調製し、更に液状培地を調製する。
ステップ（Ｓ３）：該液状培地を加工して該カルスのバイオマスを得、更にバイオマス破砕物を調製する。
ステップ（Ｓ４）：該バイオマス破砕物に対して抽出を行って少なくとも上澄み液を得る。
ステップ（Ｓ５）：カラムクロマトグラフィーにより該上澄み液から前記セスキテルペノイド誘導体を分離する。
ステップ（Ｓ１）：天山雪蓮花（Saussurea involucrata）の外植片培地を調製する。
ステップ（Ｓ２）：該外植片培地からカルス培地を調製し、更に液状培地を調製する。
ステップ（Ｓ３）：該液状培地を加工して該カルスのバイオマスを得、更にバイオマス破砕物を調製する。
ステップ（Ｓ４）：該バイオマス破砕物に対して抽出を行って少なくとも上澄み液を得る。
ステップ（Ｓ５）：カラムクロマトグラフィーにより該上澄み液から前記セスキテルペノイド誘導体を分離する。
なお、上記ステップ（Ｓ１）は下記に示す具体的なステップを含む。
ステップ（Ｓ１１）：雪蓮花植物（plant of S. involucrata）から少なくとも若葉（young leaf）を取り、複数の葉切片（leaf segments）に切断する。
ステップ（Ｓ１２）：該複数の葉切片を漂白剤（bleach）で１０分間水洗（rinsing）する。更に、該複数の葉切片を滅菌水（sterile water）で３分間洗浄する。
ステップ（Ｓ１３）：該複数の葉切片を固態培地（solid culture medium）に接種する。前記固態培地はＭＳ培地である。
ステップ（Ｓ１４）：前記固態培地を暗環境に置き、１８℃〜３０℃の培養温度で５週間暗所培養する。
ステップ（Ｓ１１）：雪蓮花植物（plant of S. involucrata）から少なくとも若葉（young leaf）を取り、複数の葉切片（leaf segments）に切断する。
ステップ（Ｓ１２）：該複数の葉切片を漂白剤（bleach）で１０分間水洗（rinsing）する。更に、該複数の葉切片を滅菌水（sterile water）で３分間洗浄する。
ステップ（Ｓ１３）：該複数の葉切片を固態培地（solid culture medium）に接種する。前記固態培地はＭＳ培地である。
ステップ（Ｓ１４）：前記固態培地を暗環境に置き、１８℃〜３０℃の培養温度で５週間暗所培養する。
また、上記ステップ（Ｓ２）は下記に示す具体的なステップを含む。
ステップ（Ｓ２１）：前記ステップ（Ｓ１４）で得られた該固態培地から該複数の葉切片を取り出し、更に該複数の葉切片から少なくともカルスを取り出す。
ステップ（Ｓ２２）：得られたカルスを砕き、滅菌ピンセット（sterilized forceps）でフラスコ内に移す。該フラスコ内には、予め１００ｍＬの液状ＭＳ培地が設置されている。
ステップ（Ｓ２３）：該フラスコを暗環境に置き、２５℃、１５０ｒｐｍの培養条件で該フラスコに対して振盪培養（shaking culture）を４８時間行って、該カルスの液体培養物を得る。
ステップ（Ｓ２１）：前記ステップ（Ｓ１４）で得られた該固態培地から該複数の葉切片を取り出し、更に該複数の葉切片から少なくともカルスを取り出す。
ステップ（Ｓ２２）：得られたカルスを砕き、滅菌ピンセット（sterilized forceps）でフラスコ内に移す。該フラスコ内には、予め１００ｍＬの液状ＭＳ培地が設置されている。
ステップ（Ｓ２３）：該フラスコを暗環境に置き、２５℃、１５０ｒｐｍの培養条件で該フラスコに対して振盪培養（shaking culture）を４８時間行って、該カルスの液体培養物を得る。
また、上記ステップ（Ｓ３）は下記に示す具体的なステップを含む。
ステップ（Ｓ３１）：前記ステップ（Ｓ２３）で得られた該液体培養物をバイオリアクタシステムに移して試験生産（production test pilot process）を行い、該カルスのバイオマスを得る。
ステップ（Ｓ３２）：得られたバイオマスを冷凍乾燥する。
ステップ（Ｓ３３）：冷凍乾燥した該バイオマスを破砕してバイオマス破砕物を得る。
ステップ（Ｓ３１）：前記ステップ（Ｓ２３）で得られた該液体培養物をバイオリアクタシステムに移して試験生産（production test pilot process）を行い、該カルスのバイオマスを得る。
ステップ（Ｓ３２）：得られたバイオマスを冷凍乾燥する。
ステップ（Ｓ３３）：冷凍乾燥した該バイオマスを破砕してバイオマス破砕物を得る。
また、上記ステップ（Ｓ４）は下記に示す具体的なステップを含む。
ステップ（Ｓ４１）：抽出液に７０％食品用エタノール（ＥｔＯＨ）水溶液を使い、７０°Ｃの水浴中で、所定の体積比（１０：１, ｖ/ｖ）で該バイオマス破砕物に対して抽出を３０分間行う。
ステップ（Ｓ４２）：４８００ｒｐｍの遠心条件で前記ステップ（１２）での産物に対して遠心を１０分間行う。更に、少なくとも上澄み液を集める。
ステップ（Ｓ４１）：抽出液に７０％食品用エタノール（ＥｔＯＨ）水溶液を使い、７０°Ｃの水浴中で、所定の体積比（１０：１, ｖ/ｖ）で該バイオマス破砕物に対して抽出を３０分間行う。
ステップ（Ｓ４２）：４８００ｒｐｍの遠心条件で前記ステップ（１２）での産物に対して遠心を１０分間行う。更に、少なくとも上澄み液を集める。
上記ステップ（Ｓ４２）が完了すれば、カラムクロマトグラフィーにより、得られた上澄み液から前記セスキテルペノイド誘導体を分離できる。図２は、カラムクロマトグラフィーによって該上澄み液から天山雪蓮花抽出物を分離する工程を示すフローチャートである。図２に示すように、上記ステップ（Ｓ５）が完了すれば、１６種の抽出物（Ａ−Ｐ）が得られる。そのうち抽出物Ｄは化学式Ｉで示されるセスキテルペノイド誘導体であり、番号はＳＥ２である。
抽出物Ｄが化学式Ｉで示されるセスキテルペノイド誘導体であることを実証するため、本発明の発明者らは、抽出物Ｄの分子構造中の化学官能基の数及び種類を核磁気共鳴分光法（Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy）を用いて分析した。行われた核磁気共鳴分析は、１Ｈ−ＮＭＲ（１Ｈ核磁気共鳴スペクトル）、１３Ｃ−ＮＭＲ（１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル）、ＤＥＰＴ（Distortionless Enhancement by Polarization Transfer）、ＮＯＥＳＹ（Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy）、ＣＯＳＹ（Correlation Spectroscopy）、ＨＳＱＣ（Heteronuclear Single-Quantum Correlation Spectroscopy）、ＨＭＢＣ（Heteronuclear Multiple Bond Correlation）である。
上記抽出物Ｄの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、ＤＥＰＴスペクトル、ＮＯＥＳＹスペクトル、ＣＯＳＹスペクトル、ＨＳＱＣスペクトル、以及ＨＭＢＣスペクトルは、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ及び図３Ｇにそれぞれ示される。上記複数の核磁気共鳴スペクトルから、抽出物Ｄの分子構造は化学式Ｉで示されるものであることを確認できる。
さらに、化学式Ｉで示される化合物には確かにメラニンの産生を抑制する効果があることを実証するため、本発明の発明者らは複数の実験を行った。
[実験１： ヒト皮膚線維芽細胞の培養]
ＣＣＤ−９６６ＳＫは付着性ヒト線維芽細胞（human normal skin fibroblasts）であり、それを１０％（ｖ/ｖ）のウシ胎児血清（fetal calf serum，FCS）、０.３７％（ｗ/ｖ）のＮａＨＣＯ３、１００ｕｎｉｔｓ/ｍｌのペニシリン、１００ｕｎｉｔｓ/ｍｌのストレプトマイシン、０.１ｍＭのＮＥＡＡ（non-essential amino acid solution，非必須アミノ酸溶液）、１Ｍｍのピルビン酸ナトリウム及び０.０３％のＬ−グルタミンを含むＭＥＭ（minimum essential medium）培養液で培養する。細胞の培養は３７℃、５％ＣＯ２及び相対湿度８０％の恒温培養装置内で行われ、２日に１回培養液を交換する。倒立顕微鏡で観察し、細胞がある程度コンフルエントに達して単層（monolayer）薄膜が形成した時点で継代培養（subculture）を行う。
ＣＣＤ−９６６ＳＫは付着性ヒト線維芽細胞（human normal skin fibroblasts）であり、それを１０％（ｖ/ｖ）のウシ胎児血清（fetal calf serum，FCS）、０.３７％（ｗ/ｖ）のＮａＨＣＯ３、１００ｕｎｉｔｓ/ｍｌのペニシリン、１００ｕｎｉｔｓ/ｍｌのストレプトマイシン、０.１ｍＭのＮＥＡＡ（non-essential amino acid solution，非必須アミノ酸溶液）、１Ｍｍのピルビン酸ナトリウム及び０.０３％のＬ−グルタミンを含むＭＥＭ（minimum essential medium）培養液で培養する。細胞の培養は３７℃、５％ＣＯ２及び相対湿度８０％の恒温培養装置内で行われ、２日に１回培養液を交換する。倒立顕微鏡で観察し、細胞がある程度コンフルエントに達して単層（monolayer）薄膜が形成した時点で継代培養（subculture）を行う。
[実験２： ＭＭＰ−９遺伝子発現量]
ＭＭＰ−９遺伝子はマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinases，MMPs）ファミリーの一員であり、主に細胞外マトリックス（extracellular matrix）の破壊及び再構築に関与している。今まで、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン及び膜貫通型ＭＭＰ（transmembrane type-MMP）を含む２８種のＭＭＰｓが発見された。ＭＭＰ−９はゼラチナーゼの一員である。
ＭＭＰ−９遺伝子はマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinases，MMPs）ファミリーの一員であり、主に細胞外マトリックス（extracellular matrix）の破壊及び再構築に関与している。今まで、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン及び膜貫通型ＭＭＰ（transmembrane type-MMP）を含む２８種のＭＭＰｓが発見された。ＭＭＰ−９はゼラチナーゼの一員である。
細胞外マトリックス（extracellular matrix）は主にコラーゲン、エラスチン、糖タンパク質及びプロテオグリカンの４種類の構成成分からなり、組織、器官によってそれらの割合が異なる。皮膚は、コラーゲンによって支持されていなければたるんでしまい弾力を失うことが知られている。ＵＶＡの照射又は炎症反応はＭＭＰｓを過剰発現させる。この状態では、ＭＭＰｓはほぼ全ての細胞外マトリックスを破壊でき、結合組織内のタンパク質構造を分解できる。細胞外マトリックス内のコラーゲンは、ＭＭＰ−９によって分解、破壊される。
したがって、本発明の発明者らは、実験２を通じて、化学式Ｉで示される化合物の、ＭＭＰ−９遺伝子発現量の抑制における効果を研究した。実験２では、下記５つのグループを設けた。
（１）対照グループ（CTL group）：ヒト皮膚線維芽細胞を有する培地。
（２）１倍投与量−２４時間グループ（1X-24 group）：本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、２４時間作用させて観察を行った。ここでは、１倍投与量の化合物とは、８.７５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（３）１倍投与量−４８時間グループ（1X-48 group）：本発明の化合物（化学式Ｉ）をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、４８時間作用させて観察を行った。
（４）２倍投与量−２４時間グループ（1X-24 group）：本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、２４時間作用させて観察を行った。ここでは、２倍投与量の化合物とは１７.５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（５）２倍投与量−４８時間グループ（1X-48 group）：本発明の化合物（化学式Ｉ）をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、４８時間作用させて観察を行った。
（１）対照グループ（CTL group）：ヒト皮膚線維芽細胞を有する培地。
（２）１倍投与量−２４時間グループ（1X-24 group）：本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、２４時間作用させて観察を行った。ここでは、１倍投与量の化合物とは、８.７５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（３）１倍投与量−４８時間グループ（1X-48 group）：本発明の化合物（化学式Ｉ）をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、４８時間作用させて観察を行った。
（４）２倍投与量−２４時間グループ（1X-24 group）：本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、２４時間作用させて観察を行った。ここでは、２倍投与量の化合物とは１７.５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（５）２倍投与量−４８時間グループ（1X-48 group）：本発明の化合物（化学式Ｉ）をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、４８時間作用させて観察を行った。
実験２では、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Real-time polymerase chain reaction、RT-PCR）によって、目的物（すなわちＭＭＰ−９遺伝子発現量）の反応前及びＰＣＲ後の産物の量的関係を観察した。図４は各グループのＭＭＰ−９遺伝子発現量を示す棒グラフである。図４から分かるように、１倍投与量−２４時間グループでは、対照グループと比較して、ＭＭＰ−９遺伝子発現量を約８０％抑制する効果を示し、効果が最も高かった。このように、実験の結果から、投与量８ｎｇ/ｍＬ〜１８ｎｇ/ｍＬの該化合物は、正常ヒト皮膚線維芽細胞（human normal skin fibroblasts）におけるＭＭＰ−９ゼラチナーゼの遺伝子発現量を５０％以上低下させることができるという結論が得られた。
図５は各グループのコラーゲン分泌量を示す棒グラフである。図５のコラーゲン分泌量（Collagen Secretion Assay）データから分かるように、１倍投与量−２４時間グループ（1X-24）では、対照グループ（CTL）と比較して、ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン分泌量は２０％増加した。また、２倍投与量−２４時間グループ（2X-24）では、対照グループと比較して、ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン分泌量は３０％増加した。このように、実験の結果から、投与量８ｎｇ/ｍＬ〜１８ｎｇ/ｍＬの該化合物はヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン分泌量を少なくとも２０％増加させることができるという結論が得られた。
[実験３：ＭＩＴＦ遺伝子発現量]
メラニンの生合成は非常に複雑な過程であり、主にメラニン細胞内のチロシナーゼの触媒反応によってメラニンが形成される。この過程には多くの遺伝子が関与している 。そのうち、「小眼球症関連転写因子（Microphthalmia-associated transcription factor）」と呼ばれるＭＩＴＦ遺伝子が非常に重要な役割を果たしている。ＭＩＴＦは、メラニン細胞から発見され、チロシナーゼ（メラニン生成の鍵酵素）の活性を促進することによってメラニンの合成を調節する。そのため、ＭＩＴＦ遺伝子発現量を抑制すれば、チロシナーゼの活性を低下させることができ、メラニンの合成を抑制して美白の効果を得ることができる。
メラニンの生合成は非常に複雑な過程であり、主にメラニン細胞内のチロシナーゼの触媒反応によってメラニンが形成される。この過程には多くの遺伝子が関与している 。そのうち、「小眼球症関連転写因子（Microphthalmia-associated transcription factor）」と呼ばれるＭＩＴＦ遺伝子が非常に重要な役割を果たしている。ＭＩＴＦは、メラニン細胞から発見され、チロシナーゼ（メラニン生成の鍵酵素）の活性を促進することによってメラニンの合成を調節する。そのため、ＭＩＴＦ遺伝子発現量を抑制すれば、チロシナーゼの活性を低下させることができ、メラニンの合成を抑制して美白の効果を得ることができる。
したがって、本発明の発明者らは、実験３を通じて、化学式Ｉで示される化合物の、ＭＩＴＦ遺伝子発現量の抑制における効果を研究した。実験３では、下記５つのグループを設けた。
（１）対照グループ（CTL group）：ヒト皮膚線維芽細胞を有する培地。
（２）１倍投与量−２４時間グループ（1X-24 group）：本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、２４時間作用させて観察を行った。ここでは、１倍投与量の化合物とは、８.７５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（３）１倍投与量−４８時間グループ（1X-48 group）：本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、４８時間作用させて観察を行った。
（４）２倍投与量−２４時間グループ（1X-24 group）：本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、２４時間作用させて観察を行った。ここでは、２倍投与量の化合物とは１７.５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（５）２倍投与量−４８時間グループ（1X-48 group）：本発明の化合物（化学式Ｉ）をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、４８時間作用させて観察を行った。
（１）対照グループ（CTL group）：ヒト皮膚線維芽細胞を有する培地。
（２）１倍投与量−２４時間グループ（1X-24 group）：本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、２４時間作用させて観察を行った。ここでは、１倍投与量の化合物とは、８.７５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（３）１倍投与量−４８時間グループ（1X-48 group）：本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、４８時間作用させて観察を行った。
（４）２倍投与量−２４時間グループ（1X-24 group）：本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、２４時間作用させて観察を行った。ここでは、２倍投与量の化合物とは１７.５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（５）２倍投与量−４８時間グループ（1X-48 group）：本発明の化合物（化学式Ｉ）をヒト皮膚線維芽細胞の培地に添加し、４８時間作用させて観察を行った。
実験３においても、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって、目的物（すなわちＭＩＴＦ遺伝子発現量）の反応前及び反応後の産物の量的関係を観察した。図６は各グループのＭＩＴＦ遺伝子発現量を示す棒グラフである。図６から分かるように、１倍投与量−２４時間グループ及び１倍投与量−４８時間グループでは、対照グループと比較して、ＭＩＴＦ遺伝子発現量を約４０％抑制する効果を示し、効果が最も高かった。
図７は各グループのメラニン定量分析結果を示す棒グラフである。図７に示すメラニン定量分析（melanin quantification assay）結果から分かるように、１倍投与量−４８時間グループ（1X-48）では、対照グループと比較して、ヒト皮膚線維芽細胞におけるメラニンは２０％低下した。また、２倍投与量−４８時間グループ（2X-48）では、対照グループと比較して、ヒト皮膚線維芽細胞におけるメラニンは４０％低下した。このように、実験の結果から、投与量８ｎｇ/ｍＬ〜１８ｎｇ/ｍＬの該化合物はヒト皮膚線維芽細胞におけるＭＩＴＦの遺伝子発現量を４５％以上低下させることができるという結論が得られた。
[実験４： 皮膚創傷の治癒]
創傷とは、狭義的には皮膚組織が損傷したことをいう。皮膚創傷の治癒（Wound healings）は動的且つ複雑な生理的過程であり、創傷の回復には、異なる多くの細胞、組織間の共同作用が関与している。人体の皮膚組織の治癒過程は、出血凝固期、炎症期、増殖期及び成熟期に分けられている。増殖期では、線維芽細胞によって線維細胞（fibrocyte）が絶えずに生成され、コラーゲンが生成される。成熟期では、古いコラーゲンが新しいコラーゲンに取って代わられてコラーゲン再構築（Collagen remolding）が完成し、皮膚組織の外観及び機能が元の正常状態に近いものとなる。
創傷とは、狭義的には皮膚組織が損傷したことをいう。皮膚創傷の治癒（Wound healings）は動的且つ複雑な生理的過程であり、創傷の回復には、異なる多くの細胞、組織間の共同作用が関与している。人体の皮膚組織の治癒過程は、出血凝固期、炎症期、増殖期及び成熟期に分けられている。増殖期では、線維芽細胞によって線維細胞（fibrocyte）が絶えずに生成され、コラーゲンが生成される。成熟期では、古いコラーゲンが新しいコラーゲンに取って代わられてコラーゲン再構築（Collagen remolding）が完成し、皮膚組織の外観及び機能が元の正常状態に近いものとなる。
したがって、本発明の発明者らは、実験４を通じて、化学式Ｉで示される化合物の、皮膚創傷の治癒における補助効果を研究した。実験４では、下記４つのグループを設けた。
（１）対照グループ（CTL group）：ヒト皮膚線維芽細胞に損傷エリアを作り、１８時間観察した。
（２）１倍投与量−１８時間グループ（1X-18 group）：ヒト皮膚線維芽細胞に損傷エリアを作ると共に、本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞に添加する。化合物が１８時間作用した後、該ヒト皮膚線維芽細胞における損傷エリアの変化を観察した。ここでは、１倍投与量の化合物とは、８.７５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（３）２倍投与量−１８時間グループ（2X-18 group）： ヒト皮膚線維芽細胞に損傷エリアを作ると共に、本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞に添加する。化合物が１８時間作用した後、該ヒト皮膚線維芽細胞における損傷エリアの変化を観察した。ここでは、２倍投与量の化合物とは１７.５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（４）４倍投与量−１８時間グループ（4X-18 group）：ヒト皮膚線維芽細胞に損傷エリアを作ると共に、本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞に添加する。化合物が１８時間作用した後、該ヒト皮膚線維芽細胞における損傷エリアの変化を観察した。ここでは、４倍投与量の化合物とは３５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（１）対照グループ（CTL group）：ヒト皮膚線維芽細胞に損傷エリアを作り、１８時間観察した。
（２）１倍投与量−１８時間グループ（1X-18 group）：ヒト皮膚線維芽細胞に損傷エリアを作ると共に、本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞に添加する。化合物が１８時間作用した後、該ヒト皮膚線維芽細胞における損傷エリアの変化を観察した。ここでは、１倍投与量の化合物とは、８.７５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（３）２倍投与量−１８時間グループ（2X-18 group）： ヒト皮膚線維芽細胞に損傷エリアを作ると共に、本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞に添加する。化合物が１８時間作用した後、該ヒト皮膚線維芽細胞における損傷エリアの変化を観察した。ここでは、２倍投与量の化合物とは１７.５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
（４）４倍投与量−１８時間グループ（4X-18 group）：ヒト皮膚線維芽細胞に損傷エリアを作ると共に、本発明の化合物をヒト皮膚線維芽細胞に添加する。化合物が１８時間作用した後、該ヒト皮膚線維芽細胞における損傷エリアの変化を観察した。ここでは、４倍投与量の化合物とは３５ｎｇ/ｍＬのＳＥ２をいう。
図８は各グループのヒト皮膚線維芽細胞の電子顕微鏡画像である。図８から、対照グループ、１倍投与量−１８時間グループ、２倍投与量−１８時間グループ及び４倍投与量−１８時間グループのいずれにおいても、損傷エリアが形成してから１８時間後に、該損傷エリアを閉鎖・修復するように所定量の線維細胞（fibrocyte）が生成されたことが観察できた。また、図８から、１倍投与量−１８時間グループ、２倍投与量−１８時間グループ及び４倍投与量−１８時間グループは、対照グループと比較して明らかに比較的高い損傷エリア閉鎖・修復作用を示していることも分かった。
図９は各グループにおける損傷エリアの閉鎖・修復パーセンテージを示す棒グラフである。図９の実験データから分かるように、１倍投与量−１８時間グループにおける損傷エリアの閉鎖・修復パーセンテージは対照グループよりも１.２１倍高い。また、２倍投与量−１８時間グループにおける損傷エリアの閉鎖・修復パーセンテージは、対照グループよりも１.４倍高い。更に、４倍投与量−１８時間グループにおける損傷エリアの閉鎖・修復パーセンテージは対照グループよりも１.５倍高い。
以上のように、本発明のメラニン産生抑制作用及びコラーゲン産生促進作用を有する化合物の抽出方法、化学構造及びその効果を十分且つ明確に開示した。以上により、本発明のメラニン産生抑制作用及びコラーゲン産生促進作用を有する化合物が下記の有益効果を有していることが実証された。
（１）本発明は、綿頭雪蓮から抽出されたチロシナーゼ阻害剤又はメラニン生成阻害剤とは異なる、メラニン産生抑制作用及びコラーゲン産生促進作用を有する化合物を提供する。実験結果により、該化合物は、特にヒト皮膚線維芽細胞におけるＭＭＰ−９の遺伝子発現量及びＭＩＴＦの遺伝子発現量に作用する高い抑制活性を有していることが実証された。
（２）本発明の化合物は、上記（１）で説明したようにＭＭＰ−９遺伝子発現量及びＭＩＴＦ遺伝子発現量を著しく抑制できる上、ヒト線維芽細胞におけるコラーゲン生成量を増加させることができると共に、ヒト線維芽細胞におけるメラニンを抑制することができる。
（３）実験１〜実験４の結果から、本発明の化合物は、上記（１）及び（２）で説明したようにメラニン産生抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び創傷治癒促進作用を有していることが実証されており、美白、抗老化又は創傷治癒促進用スキンケア製品、化粧品、創傷被覆材、薬剤又は食品の製造に使用できる。
（１）本発明は、綿頭雪蓮から抽出されたチロシナーゼ阻害剤又はメラニン生成阻害剤とは異なる、メラニン産生抑制作用及びコラーゲン産生促進作用を有する化合物を提供する。実験結果により、該化合物は、特にヒト皮膚線維芽細胞におけるＭＭＰ−９の遺伝子発現量及びＭＩＴＦの遺伝子発現量に作用する高い抑制活性を有していることが実証された。
（２）本発明の化合物は、上記（１）で説明したようにＭＭＰ−９遺伝子発現量及びＭＩＴＦ遺伝子発現量を著しく抑制できる上、ヒト線維芽細胞におけるコラーゲン生成量を増加させることができると共に、ヒト線維芽細胞におけるメラニンを抑制することができる。
（３）実験１〜実験４の結果から、本発明の化合物は、上記（１）及び（２）で説明したようにメラニン産生抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び創傷治癒促進作用を有していることが実証されており、美白、抗老化又は創傷治癒促進用スキンケア製品、化粧品、創傷被覆材、薬剤又は食品の製造に使用できる。
なお、上記詳細な説明は本発明の実施可能な実施例を具体的に説明したものであり、本発明の範囲は実施例によって制限されず、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で行われる均等な実施又は変更はいずれも本発明の範囲に含まれる。
Claims (4)
- メラニン産生抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び創傷治癒促進作用を有する化合物の、美白、抗老化又は創傷治癒促進用スキンケア製品、化粧品、創傷被覆材、薬剤又は食品の製造のための使用であって、前記化合物は下記化学式Ｉで示されるものである、使用。
- 前記化合物は天山雪蓮花から抽出されたものである、請求項１に記載の使用。
- 前記化合物は前記天山雪蓮花のカルスから抽出されたものである、請求項２に記載の使用。
- 前記化合物は、
天山雪蓮花の外植片を調製するステップ（Ｓ１）と、
前記外植片からカルス培地を調製し、更に液状培地を調製するステップ（Ｓ２）と、
前記液状培地を加工して前記カルスのバイオマスを得、更にバイオマス破砕物を調製するステップ（Ｓ３）と、
前記バイオマス破砕物に対して抽出を行って少なくとも上澄み液を得るステップ（Ｓ４）と、
カラムクロマトグラフィーにより前記上澄み液から前記化合物を分離するステップ（Ｓ５）と
を含む方法によって製造されたものである、請求項１に記載の使用。
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