CN112914019A - 一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测 - Google Patents
一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112914019A CN112914019A CN201911242146.6A CN201911242146A CN112914019A CN 112914019 A CN112914019 A CN 112914019A CN 201911242146 A CN201911242146 A CN 201911242146A CN 112914019 A CN112914019 A CN 112914019A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- swine fever
- fever virus
- african swine
- asfv
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000701386 African swine fever virus Species 0.000 title claims abstract description 144
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 27
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 29
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 10
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims 7
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 claims 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 abstract description 24
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 abstract description 19
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000014155 detection of activity Effects 0.000 abstract 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 abstract 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 26
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 108091093078 Pyrimidine dimer Proteins 0.000 description 4
- ASJWEHCPLGMOJE-LJMGSBPFSA-N ac1l3rvh Chemical class N1C(=O)NC(=O)[C@@]2(C)[C@@]3(C)C(=O)NC(=O)N[C@H]3[C@H]21 ASJWEHCPLGMOJE-LJMGSBPFSA-N 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000013635 pyrimidine dimer Substances 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 101710149086 Nuclease S1 Proteins 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 101100102558 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) Ba71V-087 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 2
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701083 Bovine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 229940124863 Varicella-zoster virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-amino-4-(trifluoromethyl)-1,3-thiazole-5-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C=1SC(N)=NC=1C(F)(F)F XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000009930 food irradiation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- PRZSXZWFJHEZBJ-UHFFFAOYSA-N thymol blue Chemical compound C1=C(O)C(C(C)C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C(=CC(O)=C(C(C)C)C=2)C)=C1C PRZSXZWFJHEZBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
- A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
- A23L5/30—Physical treatment, e.g. electrical or magnetic means, wave energy or irradiation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及活性检测，以受非洲猪瘟病毒ASFV污染的饲料为对象，采用高能电子束进行辐照，对辐照后的饲料采用Long‑Range PCR/qPCR或Long‑Range PCR/LAMP的方法，检测其所含非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值。可用于对饲料中非洲猪瘟病毒ASFV的灭活以及其灭活后活性的快速检测。实验表明，该技术可以使饲料中的ASFV含量降到单次饲喂的传染剂量之下，为食品安全提供保障，同时，采用活性检测方法进行有效验证，准确性可以达到90%。
Description
技术领域
本发明是一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测，具体涉及采用高能电子束灭活饲料中的非洲猪瘟病毒（ASFV）的技术以及用于辐照后病毒的活性检测方法，属于食品安全领域。
背景技术
非洲猪瘟是由ASFV(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的。ASFV是ASFV科的唯一成员，尚未发现有亲缘的病毒。ASFV可以感染家猪和野猪，并引起急性出血热（非洲猪瘟），致死率接近100%。
非洲猪瘟最早于1900年在非洲东部暴发并相继传播至非洲西部及撒哈拉沙漠以南的许多国家。1957在葡萄牙里斯本报道了欧洲的首例非洲猪瘟疫情。到1990年非洲猪瘟已经扩散到了中、西欧洲以及加勒比海地区和南美洲。2007年格鲁吉亚和俄罗斯报道了非洲猪瘟疫情，此后东欧国家亦相继暴发非洲猪瘟。2018年8月我国辽宁沈阳首次首例非洲猪瘟疫情，并且传播迅速，截至 2018年底，已有23个省超过100多起家猪感染非洲猪瘟的报道。
ASFV的基因组和病毒颗粒十分复杂，侵染方式、成熟方式多样等原因，非洲猪瘟疫苗开发的进程缓慢，但至今仍未研制出可以商用的ASFV疫苗。所以ASFV的防控重点还是监测并切断各种可能的传播、感染途径。ASFV传播方式多样化，而且可以在各种猪肉制品和环境中存活相当长的时间，给ASFV的防控带来了相当大的挑战。据报道，饲料也是传播ASFV的途径之一，并且单次饲喂被污染的饲料引起感染的最低剂量为104 TCID50。随着饲料中ASFV含量和受污染饲料饲喂次数的增加，感染机率也会逐步增加。如何灭活被污染饲料中的ASFV并且检测其活性是降低饲料途径传播ASFV的关键。
辐照很早便被应用于食品的杀菌。广泛的营养评估、毒性研究和喂养试验表明辐照食品不存在任何风险，且辐照产生的营养变化甚至比巴氏杀菌产生的营养变化幅度都要小。近年来，电子束辐照陈为了食品辐照杀菌消毒的热点。已经有研究表明使用不同电子束辐照剂量对新城疫病毒、1型牛疱疹病毒和鸡传染性法氏囊病毒活性物质进行照射，可以完全灭活这3种病毒。有关辐照灭活病毒，如现有专利文献CN103167880A（灭活的水痘带状疱疹病毒疫苗、其生产方法及用途，2013.06.19）、CN105431171A（用于使用电子束射线来病毒灭活的方法，2016.03.23）等。
例如CN105431171A采用50至300 kGy的电子束辐照来灭活液体样品中病毒的免疫原成分或是疫苗，可灭活的病毒包括多种有/无包膜、单链/双链RNA和单链/双链DNA病毒，并通过滴定法检测了电子束辐照灭活后病毒的TCID50值来反映病毒活性。CN105431171A还发现电子束灭活病毒后几乎完好地保存了病毒结构和抗原性，某些病毒如PRRSV（猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒）可在灭活后用于制备疫苗。
ASFV是单链DNA病毒，基因组长达180~196 kb。研究表明，ASFV基因组两端也存在重复序列和变异区，中间为中心保守区。除此外，ASFV自带DNA修复系统，但保真性十分低，所以其基因组变异较大，给PCR检测ASFV带来了一定难度。但qPCR和LAMP仍是从环境样品中快速检测ASFV的主要方法。目前在ASFV的快速检测方面，已有专利文献CN110106290A（一种基于CRISPR/Cas系统用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒, 2019.08.09），CN110453010A（一种用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组、试剂和试剂盒,2019.11.15）。
多种辐照都可以引起DNA不同形式的损伤，如单链/双链断裂、形成嘧啶二聚体。PCR过程中聚合反应的进行需要相对完整的DNA链，任何断裂、嘧啶二聚体都会阻断聚合反应。所以PCR已被广泛应用于检测断裂、形成嘧啶二聚体等细胞DNA损伤。病毒的繁殖亦要求相对完整的基因组DNA，所以已有文献表明可以尝试通过PCR法检测辐照后病毒基因组的完整性而评价其活性。比如R.A. Rodriıguez和S. Bounty结合Long-Range PCR和qPCR对紫外照射后腺病毒2型的活性进行了评价（Long-range quantitative PCR for determininginactivationof adenovirus 2 by ultraviolet light）；Brian M. Pecson建立了评价经紫外辐照的噬菌体MS2的活性的方法（Framework for Using Quantitative PCR as aNonculture Based MethodTo Estimate Virus Infectivity）。
对于饲料生产企业而言，除了需要ASFV检测技术以检测饲料生产过程中是否受到污染外，如何灭活被污染的饲料并检测灭活处理后病毒是否仍具有活性，是降低生产损失的关键之一。这对于规模化的生猪养殖场而言同样重要，所以迫切需要一种可以灭活饲料或器材中ASFV的技术和快速检测其活性的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，采用高能电子束辐照技术对受污染饲料中非洲猪瘟病毒ASFV进行灭活，实验表明，该技术可以使饲料中的ASFV含量降到单次饲喂的传染剂量之下。
本发明的另一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，可实现辐照后饲料中ASFV活性的快速检测，实验表明，该检测方法的准确性可以达到90%，可以不需要进行依赖于细胞培养的病毒滴定，快速检测电子束辐照后饲料中残存的病毒的活性。
本发明通过下述技术方案实现：一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，以受非洲猪瘟病毒ASFV污染的饲料为对象，采用高能电子束进行辐照。
根据辐照前，饲料中非洲猪瘟病毒ASFV浓度及其水分活度，选择高能电子束辐照的剂量范围。
采用LAMP技术可视化的检测辐照前饲料中非洲猪瘟病毒ASFV的浓度。
采用水分活度仪检测辐照前饲料中非洲猪瘟病毒ASFV的水分活度。
所述高能电子束的辐照剂量控制在10～25kGy。
所述饲料经高能电子束辐照后，非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值不高于104。
本发明还涉及一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，以上述辐照后的饲料为对象，采用long range-PCR/qPCR或long rang-PCR/LAMP的方法，检测其所含非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值。
包括以下步骤：
（1）提取辐照后饲料中非洲猪瘟病毒ASFV基因组DNA；
（2）采用Long-Range PCR对基因组DNA进行扩增，获得long range - PCR扩增产物，再依次进行步骤（3）、（4）或者依次进行步骤（5）、（6）；
（3）对Long-Range PCR扩增产物进行qPCR或LAMP扩增；
（4）根据qPCR或LAMP扩增结果，计算得到非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值；
（5）在Long-Range PCR扩增产物中加入染料后，再进行LAMP扩增，使LAMP扩增的结果可视化；
（6）将LAMP扩增产物进行颜色比对，得到非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值。
所述步骤（4）中，按以下公式计算非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值，
TCID50=eb-ax
其中x为对long range-PCR产物进行qPCR时达到所预设的阈值所需要的循环数。
所述步骤（5）中，染料为对pH敏感的染料溴甲酚紫、百里香酚蓝或是萘酚。
一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组，针对非洲猪瘟病毒ASFV的衣壳蛋白p72的编码基因B646L（Gene ID: 22220311）设计引物组，引物组为LAMP引物组、PCR引物组或qPCR引物组。
所述LAMP引物组的序列号为：
F3：5'-GTAGACGCAATATACGCTTTA-3'，
B3：5'- GCCATTTAAGAGCAGACATT -3'，
FIP：5'- GACCAAGTGCTTATATCCAGTCATTTTTT GGATCC ATATAGTTCGGATGT -3'，
BIP：5'- GGAGGTATCGGTGGAGGGAATTTT GAATTCGCAAATCATGAATGT -3'。
所述qPCR引物组的序列号为：
Forward primer：5'- CAAAAAGGCCCGACTGGTTG -3'，
Reverse primer：5'- CAGTTCCGTTTCGTCCTCCA -3'。
所述qPCR引物组的序列号为：
Forward primer：5'- TAAAGTACGCCCGCATACG -3'，
Reverse primer：5'- GGTGTTTGGTTGTCCCAGT -3'。
一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂，包括上述用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组。
一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂盒，包括上述用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组或权利要求15所述用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明提供了针对被ASFV污染的饲料进行高能电子束灭活的具体技术，和具体的评判标准，并给出了针对ASFV的高能电子束灭活的具体工艺参数，以避免在饲料中过高剂量照射引起的浪费。
（2）本发明提供了在辐照灭活后，可以替代依赖于细胞培养的病毒滴定检测病毒活性的基于PCR的辐照后病毒灭活检测方法，缩短了辐照后检测病毒活性的时间，便于现场快速检测。
（3）本发明相对于以往现场快速检测ASFV的方法无法检测其活性的缺陷，本发明提供了适用于辐照后可以快速检测病毒活性的方法。
具体实施方式
下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
非洲猪瘟病毒African Swine Fever Virus，ASFV具有多种可能的传播和感染途径，其中饲料也是传播途径中的一种，为了降低感染几率，本发明提出了对饲料中非洲猪瘟病毒ASFV进行灭活的方法，该方法可使被污染的饲料中的非洲猪瘟病毒的TCID50低于单次饲喂被污染的饲料引起感染的最低剂量，为更好保证该方法在使用过程中的有效性，本发明还提供了灭活后饲料中非洲猪瘟病毒活性的检测方法，已提供更全面、更有效的阻止非洲猪瘟病毒的感染途径。
以下是对本发明所述灭活方法及其活性检验方法的具体概述：
以受非洲猪瘟病毒ASFV污染的饲料为对象，首先，使用LMAP技术和水分活度仪分别测定被非洲猪瘟病毒ASFV污染的饲料中非洲猪瘟病毒ASFV浓度以及水分活度，以确定高能电子束辐照的剂量，其辐照剂量通常控制在10～25kGy，可根据非洲猪瘟病毒ASFV浓度以及水分活度进行选择，例如10～20 kGy或者进一步控制在10～15kGy。在经过高能电子束辐照处理后，采集部分饲料样品通过Long-Range PCR/qPCR或Long-Range PCR/LAMP的方法检测高能电子束辐照后饲料中非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值，并通过TCID50值判断饲料辐照灭活是否达标。
使用高能电子束灭活饲料中ASFV的技术包括：辐照前被污染饲料ASFV含量的测定和水分活度的测定、合适剂量的高能电子束辐照处理、TCID50值的测定及灭活效果的评判。
辐照前测定被污染饲料中ASFV的含量是为了确定合适的辐照剂量，尽量降低电子束辐照的成本。被污染饲料中ASFV的含量越高，需要采用的辐照剂量越高。本发明采用LAMP技术检测被污染饲料中ASFV的含量，在LAMP扩增前加入pH敏感染料，使LMAP的结果可视化，能够快速判定ASFV被污染饲料中ASFV的含量。本发明针对ASFV的衣壳蛋白p72的编码基因B646L设计了LAMP引物组，用于快速检测被污染饲料中ASFV的含量。此外影响高能电子束灭活被污染饲料中的ASFV的效果的因素很多，本发明主要考虑了饲料的水分对于灭活效果的影响，对于不同水分活度采用不同的辐照剂量。
基于辐照后一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法包括：
采集辐照后饲料样品中的非洲猪瘟病毒ASFV基因组DNA，采用Long-Range PCR/qPCR或Long-Range PCR/LAMP的方法，检测其所含非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值。
包括以下步骤：
（1）提取辐照后饲料中非洲猪瘟病毒ASFV基因组DNA；
（2）采用Long-Range PCR对基因组DNA进行扩增，获得Long-Range PCR扩增产物，再依次进行步骤（3）、（4）或者依次进行步骤（5）、（6）；
（3）对Long-Range PCR扩增产物进行qPCR或LAMP扩增；
（4）根据qPCR或LAMP扩增结果，计算得到非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值；
（5）在Long-Range PCR扩增产物中加入染料后，再进行LAMP扩增，使LAMP扩增的结果可视化；
（6）将LAMP扩增产物进行颜色比对，得到非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值。
进行Long-Range PCR的目的在于减少假阳性结果。单纯的qPCR或是LAMP法无法用于病毒灭活检测的原因即在于其扩增的片段过短，很可能因为在扩增区域未因辐照出现断裂、嘧啶二聚体而出现假阳性结果。已有文献表明结合不同长度片段的Long-Range PCR可以对qPCR或是LAMP的结果进行修正，使之更能反应病毒灭活的真实情况。
本发明针对包含ASFV的衣壳蛋白p72的编码基因B646L在内左右长达11.2 kb的片段设计了Long-Range PCR引物。
针对ASFV的衣壳蛋白p72的编码基因B646L设计了qPCR的引物，采用的LAMP引物组同辐照前检测被污染饲料中ASFV的含量所使用的LAMP引物组。
在活性检测方法中，利用对pH敏感染料来使LAMP的结果可视化，通过一定循环数LAMP扩增后的颜色来反应扩增模板本来的含量。在辐照后进行检测时，可以对照通过实验建立的的体系（比色卡）快速判断饲料中残存的ASFV的TCID50值。
本发明建立了qPCR结果与饲料中残存的ASFV的TCID50值的换算方法，如下：
TCID50=eb-ax
其中x为对long range-PCR产物进行qPCR时达到所预设的阈值所需要的循环数（Ct值）。
下面以几个典型实施例来列举说明本发明的具体实施方式，当然，本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
实施例1：
（一）从饲料样品中提取ASFV基因组DNA。
使用病毒基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明，从饲料样品中提取ASFV的基因组DNA。
（二）LAMP可视化检测辐照前饲料中ASFV含量。
针对ASFV的衣壳蛋白p72的编码基因B646L设计LAMP引物组，引物组、扩增条件和扩增后的片段，如下表1所示。
表1 LAMP可视化检测设计引物组、扩增条件和扩增后的片段
扩增时加入pH敏感染料，LAMP完成后对照pH敏感染料的比色卡，计算辐照前饲料样品中ASFV的含量。
（三）检测辐照前饲料的水分活度。
采用水分活度仪检测饲料的水分活度。
（四）采用高能电子束对饲料进行辐照。
针对辐照前饲料不同的病毒含量、水分活度采取不同的辐照剂量，具体如下表2。
表2 病毒含量、水分活度与辐照剂量
实施例2：
以实施例1中辐照后的饲料为对象，采用Long-Range PCR方法对其进行检测。
首先，针对ASFV基因组DNA中包含衣壳蛋白p72编码基因B646L在内的长达11.2 kb的片段（自B475L基因左端92.6 kb处至B66L基因右端103.8 kb处）设计Long-Range PCR引物，引物、扩增片段在ASFV基因组的具体位置如下表3所示。
表3 引物及扩增片段长度
辐照处理之后按照实施例1所述方法从饲料中提取ASFV的基因组DNA，采用本发明所述方法进行低循环数的Long-Range PCR扩增。扩增产物使用核酸酶S1进行消化，去除其中的Long-Range PCR引物和单链末端，并稀释适当倍数。
实施例3：
以实施例1中辐照后的饲料为对象，采用Long-Range PCR方法对其进行检测，并计算其所含ASFV的TCID50值。
针对ASFV衣壳蛋白p72的编码基因B646L设计qPCR引物，引物和扩增后的片段如下表4所示。
表4 扩增对象、引物及扩增后片段
对Long-Range PCR的产物进行核酸酶S1处理后，加入qPCR引物进行扩增。根据以下公式计算辐照后ASFV的TCID50值：
TCID50=eb-ax
其中x为对Long-Range PCR产物进行qPCR时达到所预设的阈值所需要的循环数（Ct值）。
实施例4：
以实施例1中辐照后的饲料为对象，采用Long-Range PCR方法对其进行检测，并计算其所含ASFV的TCID50值。
LAMP扩增各项同实施例1。
对Long rane-PCR的产物进行核酸酶S1处理后，加入LMAP引物组进行扩增。LAMP扩增前，加入pH敏感的染料，使LAMP扩增的结果可视化，对比pH敏感染料的比色卡得出辐照后饲料样品中ASFV的TCID50值。
实施例5：
辐照灭活效果的评判。
评判标准，以文献报道的单次饲喂引起感染的最低剂量为准： TCID50值小于104，优选TCID50值小于102、更优选TCID50值小于101，还更优选的是辐照之后病毒的活性已经不能被检测到。
实施例6：
本实施例涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组。
针对非洲猪瘟病毒ASFV的衣壳蛋白p72的编码基因B646L设计引物组，引物组可以是LAM引物组、PCR引物组或qPCR引物组，其设计方式参见上述实施例1、实施例2和实施例3。在使用上述引物组对非洲猪瘟病毒进行活性检测时，该引物组中还可以包括其他可以使用且能满足活性检测条件的物质，例如：Dntp、BST酶、Buffer等。
实施例7：
本实施例涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂。
该试剂包括上述实施例6中涉及的任意一种引物组，还可以包括其他可以使用且能满足活性检测条件的物质，例如：Dntp、BST酶、Buffer等。
实施例8：
本实施例涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂盒。
该试剂盒包括上述实施例6所述引物组或者实施例7所述试剂，该试剂盒的检测评判标准参见上述实施例5。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川生美思达生物科技有限公司
<120> 一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测
<130> 2019
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1941
<212> DNA
<213> B464L
<400> 1
atggcatcag gaggagcttt ttgtcttatt gctaacgatg ggaaggccga caagattata 60
ttggcccaag acttgcttaa tagcaggatt tctaacatta aaaatgtgaa caaaagttat 120
gggaaacccg accccgaacc cactttgagt caaatcgaag aaacacattt ggttcatttt 180
aatgcgcatt ttaagcctta tgttccagta gggtttgaat acaataaagt acgcccgcat 240
acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 300
ttccatgata tggtgggcca ccatatattg ggtgcatgtc attcgtcctg gcaggatgct 360
ccgattcagg gcacggccca gatgggggcc catggtcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 420
ggatatgact gggacaacca aacaccttta gagggcgccg tttacacgct tgtagatccc 480
tttggaagac ctattgtacc cggcacaaag aatgcgtacc gaaacttggt ttactactgc 540
gaataccccg gagaacgact ttatgaaaac gtaagattcg atgtaaatgg aaattccctg 600
gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt gtgcgcaaat tttgcatccc aggggataaa 660
atgactggat ataagcactt ggtcggccag gaggtatcgg tggagggaac tagtggccct 720
ctcctatgca acattcatga tttgcacaag ccgcaccaaa gcaaacctat tcttaccgat 780
gaaaatgata cgcagcgaac gtgcagccat accaacccga aattcctttc acaacatttt 840
cccgagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tattacggac 900
gcaacgtatc tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct 960
aaatactatc agccccctct tgcgctctgg attaagctgc gcttttggtt taacgagaac 1020
gtgaaccttg ctattccctc ggtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag 1080
cttgcatcgc aaaaggattt ggtgaatgaa tttcctggac tttttatacg ccagtcgcgt 1140
tttatacctg gacgccccag tagacgcaat atacgcttta aaccatggtt tatcccagga 1200
gtcattaatg aaatctcgct cacgaataat gaactttaca tcaataacct gtttgtaacc 1260
cctgaaatac acaacctttt tgtaaaacgc gttcgatttt ccctgatacg tgtccataaa 1320
acgcaggtga cccacaccaa caataaccac cacgatgaaa aactaatgtc tgctcttaaa 1380
tggcccattg aatatatgtt tataggatta aaacctacct ggaacatctc cgatcaaaat 1440
cctcatcaac accgagattg gcacaagttc ggacatgttg ttaacgccat tatgcagcct 1500
actcaccacg cagagataag ctttcaggat agagatacag ctcttccaga cgcatgttca 1560
tctatatcgg atattagccc cgttacgtat ccgatcacat tacctattat taaaaacatt 1620
tccgtaactg ctcatggtat caatcttatc gataagtttc catcaaagtt ctgcagctct 1680
tacataccct tccactacgg aggcaatgca attaaaaccc ccgatgatcc gggtgcgatg 1740
atgattacct ttgctttgaa gccacgggag gaataccaac ccagtggtca tattaacgta 1800
tccagagcaa gagaatttta tattagttgg gacacggatt acgtggggtc tatcactacg 1860
gctgatcttg tggtatcggc atctgctatt aactttcttc ttcttcagaa cggttcagct 1920
gtgctgcgtt acagtaccta a 1941
<210> 2
<211> 1428
<212> DNA
<213> B475L
<400> 2
atggatcagg aagaatccca cgttataagt atttttgaaa cccttggtgc gtattttatc 60
aacatttttt ataacttttt atacaaaaat gcactataca aaaaacattc cattgttacg 120
gaatatcagt atcaagtaaa gggctatatt ttaggggtta aacaaaataa aaaactttat 180
gaaaaaatgc tagatagttt ttacaaatat ttttgtaaca ttacccaaat taacagcaaa 240
acattaaact tttcaaactt cataacaacg attgttgatt ctttcatacc taaagaatac 300
agccaatcta taagccttga aaagaaagaa tctatcttgg aattgctact gtgcgactac 360
attagcaatt tgggcacctt tatcacaaca gaaaaaatgc tgccctttat tatcaaaaac 420
cggaaagaaa actaccataa agttacgaaa gaaatgcaag attatagtct tacctttctg 480
ctcaaaaaaa gaatggaact atacaacaaa tttttgcgaa aacaggccta tgtggagccg 540
gagacagaat tagaagaaac gtatgcaaga cttagttcat acaatcgcag ccttcttcat 600
caaattgaag aattaacatc tgaaaaaaag tcgctcttag cggatctctc cacgctacgt 660
aaaaaatatg aaaaaagaca gagtgaatac cggcgacttg ttcaactcct ttatcagcaa 720
attcaacgct cttctacatc aaagagcagc tatccactca caaagtttat tgaaacatta 780
ccctctgaac atttttctaa tgaagaatac caaaaagaga caccggcgga tcaaaaagaa 840
gtagtagaga tggaattatt gagaaaacaa gaactattaa caagccaaga gctaaccagc 900
aagtcaccaa acaattatcc cgtgccacat tcgaggacta tagtaagtaa accaccagat 960
aactatcctg tgccacgatc tagaacaaca actaaactag attttgataa ttctcttcaa 1020
aaccaagaac ttcacactaa aaacggattt agcgagaaag atattgttga gtttggtcag 1080
gataaacctg aggaagaaaa tattcttgcg attgatcagg ataaacctga ggaagaaaat 1140
attcttgcga ttaaacagga tatacctgaa gaagaaaata ttcttgcgat tgatcaggat 1200
aaacctgagt ttaatcaaga tacacctgag tttaaagaag ctgttcttga taccaaagaa 1260
aatatccttg aagaagaaaa tcaagatgag cctattgttc aaaatccatt cttggaaaat 1320
ttttggaaac ctgagcagaa gacattcaac cagtcgggcc tttttgaaga atcttcaaat 1380
tttagcaatg attggtccgg cggagatgta actttaaatt tttcataa 1428
<210> 3
<211> 201
<212> DNA
<213> B66L
<400> 3
atggatataa aaagagcact tatccttttt ttactatttt tagtcgtatt gagcaatgcc 60
tttgtggact acattattag caattttaac catgccgtga catgcagaaa acctacctac 120
tttggtatag ttcttcaagg tatttttctt gttattcttt ttagcatcgt cgattacctt 180
attaatgaaa acattcttta a 201
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> LAMP引物，F3
<400> 4
gtagacgcaa tatacgcttt a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> LAMP引物，B3
<400> 5
gccatttaag agcagacatt 20
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> LAMP引物，FIP
<400> 6
gaccaagtgc ttatatccag tcattttttg gatccatata gttcggatgt 50
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> LAMP引物，BIP
<400> 7
ggaggtatcg gtggagggaa ttttgaattc gcaaatcatg aatgt 45
<210> 8
<211> 225
<212> DNA
<213> LAMP扩增非洲猪瘟病B646L片段
<400> 8
gtagacgcaa tatacgcttt aaaccatggt ttatcccagg agtcattaat gaaatctcgc 60
tcacgaataa tgaactttac atcaataacc tgtttgtaac ccctgaaata cacaaccttt 120
ttgtaaaacg cgttcgattt tccctgatac gtgtccataa aacgcaggtg acccacacca 180
acaataacca ccacgatgaa aaactaatgt ctgctcttaa atggc 225
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> qPCR Forward primer
<400> 9
taaagtacgc ccgcatacg 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> qPCR Reverse primer
<400> 10
ggtgtttggt tgtcccagt 19
<210> 11
<211> 222
<212> DNA
<213> qPCR扩增非洲猪瘟病B646L片段
<400> 11
taaagtacgc ccgcatacgg gtacccccac cttgggaaac aagcttacct ttggtattcc 60
ccagtacgga gactttttcc atgatatggt gggccaccat atattgggtg catgtcattc 120
gtcctggcag gatgctccga ttcagggcac ggcccagatg ggggcccatg gtcagcttca 180
aacgtttcct cgcaacggat atgactggga caaccaaaca cc 222
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Long-Range PCR Forward primer
<400> 12
caaaaaggcc cgactggttg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Long-Range PCR Reverse primer
<400> 13
caaaaaggcc cgactggttg 20
Claims (16)
1.一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：以受非洲猪瘟病毒ASFV污染的饲料为对象，采用高能电子束进行辐照。
2.根据权利要求1所述的一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：根据辐照前，饲料中非洲猪瘟病毒ASFV浓度及其水分活度，选择高能电子束辐照的剂量范围。
3.根据权利要求2所述的一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：采用LAMP技术可视化的检测辐照前饲料中非洲猪瘟病毒ASFV的浓度。
4.根据权利要求2所述的一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：采用水分活度仪检测辐照前饲料中非洲猪瘟病毒ASFV的水分活度。
5.根据权利要求1所述的一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：所述高能电子束的辐照剂量控制在10～25kGy。
6.根据权利要求1所述的一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：所述饲料经高能电子束辐照后，非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值不高于104。
7.一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，其特征在于：以权利要求1所述辐照后的饲料为对象，采用Long-Range PCR/qPCR或Long-Rang PCR/LAMP的方法，检测其所含非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值。
8.根据权利要求7所述的一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）提取辐照后饲料中非洲猪瘟病毒ASFV基因组DNA；
（2）采用long range-PCR对基因组DNA进行扩增，获得long range -PCR扩增产物，再依次进行步骤（3）、（4）或者依次进行步骤（5）、（6）；
（3）对Long-Range PCR扩增产物进行qPCR或LAMP扩增；
（4）根据qPCR或LAMP扩增结果，计算得到非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值；
（5）在Long-Range PCR扩增产物中加入染料后，再进行LAMP扩增，使LAMP扩增的结果可视化；
（6）将LAMP扩增产物进行颜色比对，得到非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值。
9.根据权利要求8所述的一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中，按以下公式计算非洲猪瘟病毒ASFV的TCID50值，
TCID50=eb-ax
其中x为对Long-Range PCR产物进行qPCR时达到所预设的阈值所需要的循环数。
10.根据权利要求8所述的一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，其特征在于：所述步骤（5）中，染料为对pH敏感的染料。
11.一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组，其特征在于：针对非洲猪瘟病毒ASFV的衣壳蛋白p72的编码基因B646L设计引物组，引物组为LAMP引物组、PCR引物组或qPCR引物组。
12.根据权利要求11所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组，其特征在于：所述LAMP引物组的碱基序列为：
F3：5'-GTAGACGCAATATACGCTTTA-3'，
B3：5'- GCCATTTAAGAGCAGACATT -3'，
FIP：5'- GACCAAGTGCTTATATCCAGTCATTTTTT GGATCC ATATAGTTCGGATGT -3'，
BIP：5'- GGAGGTATCGGTGGAGGGAATTTT GAATTCGCAAATCATGAATGT -3'。
13.根据权利要求11所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组，其特征在于：所述PCR引物组的碱基序列为：
Forward primer：5'- CAAAAAGGCCCGACTGGTTG -3'，
Reverse primer：5'- CAGTTCCGTTTCGTCCTCCA -3'。
14.根据权利要求11所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组，其特征在于：所述qPCR引物组的碱基序列为：
Forward primer：5'- TAAAGTACGCCCGCATACG -3'，
Reverse primer：5'- GGTGTTTGGTTGTCCCAGT -3'。
15.一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂，其特征在于：包括权利要求11所述用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组。
16.一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂盒，其特征在于：包括权利要求11所述用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组或权利要求15所述用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911242146.6A CN112914019A (zh) | 2019-12-06 | 2019-12-06 | 一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911242146.6A CN112914019A (zh) | 2019-12-06 | 2019-12-06 | 一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112914019A true CN112914019A (zh) | 2021-06-08 |
Family
ID=76161622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911242146.6A Pending CN112914019A (zh) | 2019-12-06 | 2019-12-06 | 一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112914019A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105431171A (zh) * | 2013-07-26 | 2016-03-23 | 弗劳恩霍弗促进应用研究注册公司 | 用于使用电子射线来病毒灭活的方法 |
-
2019
- 2019-12-06 CN CN201911242146.6A patent/CN112914019A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105431171A (zh) * | 2013-07-26 | 2016-03-23 | 弗劳恩霍弗促进应用研究注册公司 | 用于使用电子射线来病毒灭活的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| R.A. RODRIGUEZ等: "Long‐range quantitative PCR for determining inactivation of adenovirus 2 by ultraviolet light", 《JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY》, vol. 114, no. 6, 1 June 2013 (2013-06-01), pages 1857 - 1858 * |
| 南京农业大学动物科技学院教授: "这种饲喂方式，有助于减少非瘟病毒通过饲料传染的风险", pages 1 - 12, Retrieved from the Internet <URL:https://www.yangzhu360.com/siyang/20191122/16786.html> * |
| 张泉等: "非洲猪瘟病毒常规PCR及Real-time PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》, vol. 29, no. 6, 30 June 2007 (2007-06-30) * |
| 李洪利等: "非洲猪瘟病毒实时荧光定量 ＰＣＲ 检测方法的 建立及应用", 《中国畜牧兽医》, vol. 39, no. 6, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 1 * |
| 王彩霞等: "环介导恒温扩增技术快速检测非洲猪瘟病毒", 《动物医学进展》, vol. 31, no. 2, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 1 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ballagi-Pordany et al. | The use of mimics as internal standards to avoid false negatives in diagnostic PCR | |
| CN106947838B (zh) | 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN109781981B (zh) | 一种用于检测非洲猪瘟病毒的分子探针及Realtime-PCR检测方法 | |
| CN110373500B (zh) | 一种基于双基因的双重荧光pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN110453011B (zh) | 一种基于CRISPR/Cas12a快速精准检测非洲猪瘟病毒的方法及应用 | |
| CN110791590A (zh) | 非洲猪瘟病毒vp72和cd2v基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及方法 | |
| CN113502352B (zh) | 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用 | |
| CN107034309B (zh) | 快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用途 | |
| CN110699489B (zh) | 非洲猪瘟病毒cd2v基因的实时荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及方法 | |
| CN110229932B (zh) | 非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒 | |
| CN106399584B (zh) | 一种鳜传染性脾肾坏死病毒灭活快速检验试剂盒及检测方法 | |
| CN111304371A (zh) | 非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量pcr检测组合物、检测方法及检测试剂盒 | |
| CN111321248A (zh) | 非洲猪瘟病毒mgf-505r基因荧光pcr检测试剂、试剂盒及其应用 | |
| Le Dimna et al. | Validation of two commercial real-time RT-PCR kits for rapid and specific diagnosis of classical swine fever virus | |
| CN103045754A (zh) | 一步法检测z/s亚型埃博拉病毒的实时荧光定量rt-pcr方法及其试剂盒 | |
| Canh et al. | Capsid integrity detection of pathogenic viruses in waters: Recent progress and potential future applications | |
| CN103210093B (zh) | 一种检测消化道病原体的方法 | |
| CN101831506B (zh) | 鉴别PRV gE缺失疫苗株和野毒株的试剂盒 | |
| CN107419034A (zh) | 五种猪腹泻病毒多重pcr快速诊断试剂盒及其应用 | |
| Ozoemena et al. | Comparative evaluation of measles virus specific TaqMan PCR and conventional PCR using synthetic and natural RNA templates | |
| Bohorquez et al. | Efficient detection of African Swine Fever Virus using minimal equipment through a LAMP PCR method | |
| CN112914019A (zh) | 一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测 | |
| CN112195274A (zh) | 一种新型冠状病毒的病毒样本处理液和处理方法及检测病毒的快速恒温反转录扩增试剂盒 | |
| CN117327838A (zh) | PEDV、PDCoV和RV-A三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒 | |
| WO2003002766A2 (en) | Method for detection of foot-and-mouth disease virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |