CN112899277A

CN112899277A - 一种棉花花粉育性相关长链非编码rna及其靶基因的应用

Info

Publication number: CN112899277A
Application number: CN202110142132.8A
Authority: CN
Inventors: 华金平; 聂虎帅; 苏莹; 郭安慧; 程成
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN112899277B

Abstract

本发明公开了一种棉花花粉育性相关长链非编码RNA及其靶基因的应用。本发明所提供的lncRNA与蛋白来源于陆地棉，由序列表序列1所示的核苷酸及序列表序列5所示的氨基酸组成。实验证明，将含有序列表序列1的第6位至第502位所示的DNA分子及序列表序列3中第884位至第1379位所示的DNA分子的重组载体pCLCrVA‑TCONS_00473367和pCLCrVA‑GhCYP724B注入棉花子叶，棉花植株营养生长不受影响，但盛花期花药干瘪，花粉粒数量减少且育性降低。本发明为创制新型不育系材料提供了新的lncRNA/基因和方法，在植物杂交种创制和杂种优势利用方面具有重要意义。

Description

一种棉花花粉育性相关长链非编码RNA及其靶基因的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体为一种棉花花粉育性相关长链非编码RNATCONS_00473367及其靶基因GhCYP724B的应用。

背景技术

棉花杂种优势明显，种植杂交棉可以显著提高棉花产量。利用雄性不育系统创制杂交种省时、省力、成本低。因此，揭示棉花雄性不育发生机制有利于构建雄性不育系统，有助于杂交种选育及杂种优势利用。

长链非编码RNA(LncRNA)是一类具有调控功能的非编码RNA，已在多种作物中证明参与雄性器官花粉育性调控。水稻LDMAR是长度为1236bp的lncRNA：长日照条件下，足够丰度的LDMAR是花粉正常发育的必要条件。突变植株中LDMAR启动子区域甲基化水平上升导致LDMAR表达丰度降低，引起花药绒毡层降解，造成水稻雄性不育。玉米Zm401具有小的开放阅读编码框，属于长链非编码RNA，在绒毡层细胞和花粉粒小孢子中特异地高表达。沉默Zm401引起玉米功能基因ZmMADS2、ZmM3-3和ZmC5表达模式变化，造成绒毡层细胞和小孢子发育异常，影响雄蕊生长和花药发育。到目前为止，棉花中报道的lncRNA相对较少，且均不涉及花粉育性。

TCONS_00473367在棉花可育材料花蕾中特异高表达，靶基因GhCYP724B编码羟基化酶，调控油菜素内酯合成，但在棉花中尚无该lncRNA及蛋白编码基因调控花粉育性的报道。

发明内容

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的目的是提供一种棉花花粉育性相关长链非编码RNA及其靶基因的应用。

本发明所提供的花粉育性相关长链非编码RNA及其靶基因，来源于陆地棉(Gossypium hirsutum L.)，所述长链非编码RNA(lncRNA)的名称为TCONS_00473367，其靶基因的名称为GhCYP724B；

所述TCONS_00473367是如下a)或b)的核苷酸序列：

a)由序列表序列1所示的核苷酸序列构成的长链非编码RNA；

b)由序列表序列1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸碱基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由(a)衍生的长链非编码RNA。

所述GhCYP724B编码得到的蛋白质是c)或d)的蛋白质序列：

c)由序列表序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

d)将序列表序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由(c)衍生的蛋白质；

序列表序列5所示的氨基酸序列由493个氨基酸残基组成。

为了使上述c)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述d)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述d)中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列3的第1位至第1482位核苷酸序列所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述蛋白质的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述蛋白质的编码基因为如下1)-6)中的任意一种DNA分子：

1)序列表序列3中第1位至第1482位所示的DNA分子；

2)序列表序列4中第1位至第3334位所示的DNA分子；

3)序列表序列3所示的DNA分子；

4)序列表序列4所示的DNA分子；

5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

6)在严格条件下与1)或2)或3)或4)或5)限定的DNA序列杂交且编码权利要求3所述蛋白质的DNA分子。

序列表序列2由1101个脱氧核苷酸组成，是陆地棉(Gossypium hirsutum L.)长链非编码RNA TCONS_00473367的全长序列，包括两个外显子(第1-480位、第780-1101位)和一个内含子。

序列表序列4为GhCYP724B基因对应的棉花基因组DNA，全长3334bp，由9个外显子和8个内含子组成，所述9个外显子分别为：第1-224位、第366-691位、第807-960位、第1159-1438位、第1537-1627位、第1841-1920位、第2085-2192位、第3002-3124位、第3231-3334位。

序列表序列1经鉴定为长链非编码RNA，鉴定严格条件如下：序列表序列1转录本长度为802bp，超过了lncRNA标准定义的200bp；

首先，利用CPAT网站：http://lilab.research.bcm.edu/cpat/，预测序列表序列1编码能力得分，结果显示score为-0.0681，该序列为非编码RNA；

然后，通过CNCI网站：https://en.bioinfo.org/software/cnci，预测序列表序列1编码能力得分，结果显示score为-0.0328，序列为非编码RNA；

再次，使用CPC网站：http://cpc.cbi.pku.edu.cn/，预测序列表序列1编码能力得分，结果显示score为-1.2201，序列为非编码RNA；

Pfam(http://pfam.janelia.org/)分析结果显示序列表序列1转录本不能比对到氨基酸序列的HMM统计模型上，进一步证明该转录本是潜在的lncRNA。

该转录本在可育材料2074B花蕾中的表达量(FPKM)三次生物学重复的值分别为5.5708、7.2964、5.6904；综合以上结果充分证明，序列表序列1转录本为lncRNA。

序列表序列3位于序列表序列1下游28kb处，受序列表序列1调控。

含有所述长链非编码RNA(lncRNA)及其靶基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述长链非编码RNA(lncRNA)及其靶基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括病毒介导的基因沉默载体，如pCLCrV、TbCSV、TMV、PVX、TRV、TGMV、CbLCV、ACMV、STMV和TYLCCNV等。

所述植物表达载体可包含外源基因的外显子区域保守序列，片段长度设定为150bp到510bp之间。

此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，同时构建CHLI(棉花镁离子鳌合酶亚基I)基因沉默载体，作为下一步实验阳性对照，便于检测基因沉默效率；同时转化病毒介导的基因沉默空载体pCLCrVA作为阴性对照。

所述重组载体可为将所述lncRNA或其靶基因插入载体pCLCrVA得到的重组表达载体，目的片段长度设定为495bp到505bp之间。具体可为将序列表序列1中第6位至第502位所示的DNA分子插入载体pCLCrVA得到重组表达载体；将序列表序列3中第884位至第1379位的DNA序列插入载体pCLCrVA得到重组表达载体。

所述重组载体是按照如下方法制备得到的：用Spe I和Pac I对含有所述lncRNA或基因的载体pMD18-T进行双酶切，回收0.5kb大小的目的片段，与经Spe I和Pac I双酶切的载体pCLCrVA的骨架连接，获得所述重组载体。

本发明保护所述长链非编码RNA(lncRNA)及所述其靶基因导入植物体内，调控植物花粉育性的应用。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将所述长链非编码RNA(lncRNA)或其靶基因在目的植物中敲除，得到雄性不育植株的转基因植物。

本发明还提供一种创制棉花杂交种的方法，包括将所述长链非编码RNA(lncRNA)及其靶基因敲除创制雄性不育母本的过程。

在上述两种方法中，所述敲除是通过所述重组载体实现的。

在上述两种方法中，所述重组载体是通过子叶注射法导入植物的。

在上述应用和方法中，所述目的植物为可育棉花材料。

本发明的有益效果：

实验证明，将含有序列表序列1中第6位至第502位所示的DNA分子的重组载体pCLCrVA-TCONS_00473367注射棉花子叶，棉花植株营养生长正常，盛花期花粉育性降低。检测目的序列表达模式，发现VIGS植株中TCONS_00473367及其靶基因GhCYP724B均显著下调；将含有序列表序列3中第884位至第1379位所示的DNA分子的重组载体pCLCrVA-GhCYP724B注射棉花子叶，棉花植株花粉育性同样降低，表现出雄性不育现象。本发明为创制新的棉花雄性不育系提供了一个lncRNA及其靶向的蛋白编码基因，对进一步通过雄性不育系统创制棉花杂交种具有重要意义。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为TCONS_00473367及其靶基因GhCYP724B在不同材料和不同组织部位表达模式：

a图为TCONS_00473367在可育材料组织特异表达半定量PCR电泳图和荧光定量柱形图；

b图为TCONS_00473367在不同材料及不同组织中表达模式图；

c图为GhCYP724B在不同材料及不同组织中表达模式图。

图2为重组质粒pCLCrVA-TCONS_00473367及重组质粒pCLCrVA-GhCYP724B构建的结构示意图。

图3为病毒介导的基因沉默载体辅助质粒pCLCrVB结构示意图。

图2中所述目的片段均插在Spe I和Pac I多克隆位点处。VIGS载体由两部分组成，其中，pCLCrVA中AL1-AL4分别编码外壳蛋白、复制相关蛋白、转录激活蛋白和复制增强蛋白；pCLCrVB中BV1和BC1的功能分别为核穿梭蛋白和运动蛋白。

图4为TCONS_00473367在受体植株2074B、转空载体pCLCrVA植株、转pCLCrVA-TCONS_00473367植株和转pCLCrVA-GhCYP724B植株中表达模式示意图，柱形图为qRT-PCR检测结果，凝胶电泳图为半定量PCR检测结果；

图5为GhCYP724B在受体植株2074B、转空载体pCLCrVA植株、转pCLCrVA-TCONS_00473367植株和转pCLCrVA-GhCYP724B植株中表达模式示意图，柱形图为qRT-PCR检测结果，凝胶电泳图为半定量PCR检测结果。

图6为转基因棉花花器官表型观察结果：

a图为转空载体pCLCrVA棉花植株盛花期花朵图；

b图为转pCLCrVA-TCONS_00473367棉花植株盛花期花朵图；

c图为转pCLCrVA-GhCYP724B棉花植株盛花期花朵图；

d图为转空载体pCLCrVA棉花植株盛花期花药图；

e图为转pCLCrVA-TCONS_00473367棉花植株盛花期花药图；

f图为转pCLCrVA-GhCYP724B棉花植株盛花期花药图；

g图为转空载体pCLCrVA棉花植株盛花期花粉I₂-KI染色图；

h图为转pCLCrVA-TCONS_00473367棉花植株盛花期花粉I₂-KI染色图；

i图为转pCLCrVA-GhCYP724B棉花植株盛花期花粉I₂-KI染色图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、TCONS_00473367及其靶基因GhCYP724B表达分析

步骤11不同棉花材料不同组织获得及保存

首先取可育材料2074B(苏棉20；Liu et al.,Over-expression oftranscription factor GhWRI1 in upland cotton.Biologia Plantarum 2018.62:335-342.公众可从中国农业大学获得)苗期叶片(Leaf)、孢原细胞期到花粉母细胞期花蕾(FB-I)、减数分裂期到双核期花蕾(FB-II)、花粉粒成熟期花蕾(FB-III)、开花前一天花苞(Bud)、盛花期花瓣(Petal)、盛花期柱头(Stigma)、盛花期花药(Anther)、开花10天后种子(Seed)用于TCONS_00473367组织特异性表达分析。此外，再取不育系2074A减数分裂期到双核期花蕾、可育材料E5903减数分裂期到双核期花蕾、F₁-A(2074A×E5903)减数分裂期到双核期花蕾，用于TCONS_00473367及GhCYP724B棉种特异及组织特异表达分析。以上所有样品液氮速冻，保存于-80℃，用于RNA抽提。

步骤12总RNA的提取及cDNA的获得

利用改进的CTAB-醋酸铵法(聂虎帅，棉花细胞质雄性不育系2074A败育特征及机理研究：[博士学位论文]，中国农业大学，2019)分别提取步骤11保存材料的总RNA，使用PrimeScript^TM RT反转录试剂盒(TaKaRa，Dalian，China)反转录得到cDNA。

步骤13半定量PCR(Semi-quantitative RT-PCR)和实时荧光定量PCR(Real-timePCR)

将步骤12反转录得到的cDNA稀释6倍后作为半定量PCR和实时荧光定量PCR的模板。根据TCONS_00473367转录本序列，设计特异引物TC67-F和TC67-R；根据GhCYP724B保守序列，设计特异引物CYP724-F和CYP724-R；以GhUBQ7为内参基因。

实时荧光定量PCR在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。结果如图1所示。

ΔΔC_T＝(C_T.Target-C_T.UBQ7)_{Time x}-(C_T.Target-C_T.UBQ7)_{Time 0}

Time x表示任意时间点，Time₀表示经UBQ7校正后1倍量的目标基因表达。

引物TC67-F/TC67-R和CYP724-F/CYP724-R的序列如下：

TC67-F：5’-AGCAACGCCTTCCCTTTCA-3’(对应序列表序列1外显子区域的第30-48位)；

TC67-R：5’-TCAAGATACCGTCGTGAGCAA-3’(对应序列表序列1外显子区域的第185-205位)。

CYP724-F：5’-TCAAGGGTAAGGGTGGGACT-3’(对应序列表序列3外显子区域的第97-116位)；

CYP724-R：5’-GGGGAGAAGAACAAATGGG-3’(对应序列表序列3外显子区域的的第245-262位)。

内参基因GhUBQ7的引物序列如下：

GhUBQ7-F：5’-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’

GhUBQ7-R：5’-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’

图1中的a图结果表明，TCONS_00473367在孢原细胞期及减数分裂期到双核期花蕾中特异高表达，在其它组织器官中表达丰度较低；图1中的b图和图1中的c图结果表明，TCONS_00473367及GhCYP724B均在可育材料花蕾中表达量较高，而在不育材料花蕾以及可育材料其它组织中表达丰度较低。

实施例2、棉花长链非编码RNATCONS_00473367及蛋白编码基因GhCYP724B片段的克隆及VIGS载体构建

以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)栽培种苏棉20(2074B)减数分裂期到双核期花蕾为材料提取总RNA，反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，以VIGS67-F/VIGS67-R和VIGS724-F/VIGS724-R为引物进行PCR扩增。

上述PCR扩增的引物序列如下：

引物VIGS67-F：5’-CCTTAGGAGAAGAGGATGATTCGCT-3’；

引物VIGS67-R：5’-TTCATCATGAAATCACAGTGAACCT-3’。

引物VIGS724-F：5’-TGGATTCTTTATTGGGTGGC-3’；

引物VIGS724-R：5’-CCTGAAGTTTTGAACAAGGTGG-3’。

上述PCR引物序列，分别在上游引物5’端添加Spe I(ACTAGT)酶切位点序列，下游引物5’端添加Pac I(TTAATTAA)酶切位点序列。

上述PCR扩增的反应体系(25μl)：2μl cDNA，1μl上下游引物混合液(10μM)，2.5μl10×LA buffer，2μl dNTP(2.5mM each)，0.3μl LA-Taq酶，17.2μl ddH₂O。

上述PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

上述PCR扩增产物分别进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收500bp左右的目的片段，连接到pMD18-T(TAKARA，D101A)克隆载体上，12h后将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，采用蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，PCR检测后将阳性克隆送公司进行测序。

测序结果与参考基因组目的序列比对，结果表明，阳性克隆载体，命名为pMD18-T-TCONS_00473367，为载体pMD18-T中插入了序列表序列1的第6位至第502位核苷酸序列所示的长497bp的DNA片段；阳性克隆载体，命名为pMD18-T-GhCYP724B，为载体pMD18-T中插入了序列表序列3的第884位至第1379位核苷酸序列所示的长496bp的DNA片段。

将上述测序正确的单克隆菌液扩摇后，分别提取质粒DNA，接下来，用限制性内切酶Spe I和Pac I酶切质粒DNA，回收酶切产物；同时用限制性内切酶Spe I和Pac I酶切病毒介导的基因沉默载体pCLCrVA，回收载体骨架；将上述步骤目的片段酶切产物和载体骨架酶切产物连接；16℃过夜后，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取单克隆进行PCR检测；分别提取阳性克隆重组质粒pCLCrVA-TCONS_00473367和pCLCrVA-GhCYP724B，进行双酶切验证。结果证明重组质粒为在载体pCLCrVA的Spe I和Pac I酶切位点之间插入了序列表序列1的第6位至第502位所示的长497bp的DNA片段，以及在载体pCLCrVA的Spe I和Pac I酶切位点之间插入了序列表序列3的第884位至第1379位所示的长496bp的DNA片段。

上述pCLCrVA载体骨架由华中农业大学植物科学学院张献龙老师课题组改造及提供(Gu et al.A versatile system for functional analysis of genes and microRNAsin cotton.Plant Biotechnol Journal,2014,12(5):638-649)。

实施例3、病毒介导的基因沉默棉花TCONS_00473367和GhCYP724B

步骤31重组农杆菌的构建

取实施例2制备得到的重组植物表达载体pCLCrVA-TCONS_00473367和pCLCrVA-GhCYP724B，以及阳性对照载体pCLCrVA-CHLI、空载体pCLCrVA和辅助载体pCLCrVB，用冻融法转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，所述感受态细胞购自北京拓英坊科技有限公司，28℃于无抗生素液体YEP培养基振荡培养3-4h后，涂布于含50μg/ml硫酸卡那霉素和50μg/ml利福平的YEP固体培养中筛选培养；经过菌落PCR，所述PCR分别使用实施例2中的引物VIGS67-F/VIGS67-R和VIGS724-F/VIGS724-R进行，然后鉴定阳性单克隆，将鉴定正确的农杆菌即含有重组植物表达载体pCLCrVA-TCONS_00473367和pCLCrVA-GhCYP724B的重组农杆菌分别命名为GV3101/pCLCrVA-TCONS_00473367和GV3101/pCLCrVA-GhCYP724B；阳性对照载体、空载体及辅助载体命名为GV3101/pCLCrVA-CHLI、GV3101/pCLCrVA和GV3101/pCLCrVB。

步骤32子叶注射法获得目的lncRNA及基因沉默的棉花植株

步骤321农杆菌侵染液的制备

取步骤31获得的重组根癌农杆菌GV3101/pCLCrVA-TCONS_00473367、GV3101/pCLCrVA-GhCYP724B、GV3101/pCLCrVA-CHLI、GV3101/pCLCrVA和GV3101/pCLCrVB分别接种于5ml YEP液体培养基中，所述YEP液体培养基中含50μg/ml硫酸卡那霉素和50μg/ml利福平，摇菌过夜，第二天扩摇至500ml YEP液体培养基中，28℃培养至OD₆₀₀为0.8-1.5；离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体，所述侵染液包括：MES：10mmol/L，MgCl：10mmol/L，乙酰丁香酮：200μmol/L；至OD₆₀₀为0.8-1.5，获得农杆菌悬浮液。

步骤322棉花子叶注射

将脱绒后的苏棉20(2074B)种子用自来水浸泡过夜，待种子露白后，播种于直径为30cm的花盆中，28℃环境下培养。待棉花子叶展平后，将步骤321制备好的农杆菌悬浮液GV3101/pCLCrVA-TCONS_00473367、GV3101/pCLCrVA-GhCYP724B、GV3101/pCLCrVA-CHLI、GV3101/pCLCrVA分别与GV3101/pCLCrVB悬浮液等体积混合得到混合液，室温静置3小时。利用注射器将上述混合液，从棉花子叶背面注射进入叶片内部，使悬浮液充满整个子叶。完成注射的棉花植株置于28℃温室，16h/8h光暗周期培养。

步骤323基因沉默效率检测

待注射完成1-2周后，观察注射GV3101/pCLCrVA-CHLI植株真叶生长状况，如果真叶变黄，说明CHLI基因发生沉默，VIGS系统有效。待转基因棉花植株现蕾后，取减数分裂期到双核期花蕾，去除苞叶、萼片、花瓣、胚珠后提取总RNA，参考实例1中的方法合成cDNA，并进行半定量PCR及实时荧光定量PCR检测。所用引物同实例1所述。

检测结果如图4、图5所示，在注射GV3101/pCLCrVA-TCONS_00473367的棉花植株(VIGS-TCONS_00473367)中，TCONS_00473367的表达模式相对于受体植株苏棉20(2074B)及注射GV3101/pCLCrVA棉花植株(VIGSA)显著降低，此外TCONS_00473367的靶基因GhCYP724B表达模式也有显著降低。而在注射GV3101/pCLCrVA-GhCYP724B的棉花植株(VIGS-GhCYP724B)中，GhCYP724B表达模式相对于受体植株苏棉20(2074B)及注射GV3101/pCLCrVA棉花植株显著降低，而TCONS_00473367的表达模式没有发生显著变化。以上结果表明，注射GV3101/pCLCrVA-TCONS_00473367，可显著沉默TCONS_00473367表达丰度，而且TCONS_00473367可正向调控GhCYP724B，导致GhCYP724B表达模式也显著降低；注射GV3101/pCLCrVA-GhCYP724B，可显著沉默GhCYP724B表达丰度，而GhCYP724B对TCONS_00473367没有逆向调控作用。

步骤33沉默TCONS_00473367及其靶基因GhCYP724B棉花表型鉴定

观察沉默TCONS_00473367棉花植株表型，结果发现与受体及阴性对照植株相比，沉默TCONS_00473367对棉花营养生长没有影响；待植株进入盛花期，受体及阴性对照植株花药饱满，散粉高峰期花粉粒完全散出并完成授粉；而沉默TCONS_00473367棉花植株花药干瘪，并且在散粉高峰期没有可育花粉粒散出；将花药捣碎后，进行花粉I₂-KI染色，显微镜观察结果显示，沉默TCONS_00473367棉花植株花粉粒较少、形状不规则、且着色较浅，表现出雄性不育的特点。特异沉默GhCYP724B，棉花植株表现出与沉默TCONS_00473367相同的表型性状，营养生长正常，花药干瘪、花粉粒形状不规则、着色较浅且数量较少，以上结果如图6中的a图～i图所示。

综合以上结果表明，沉默TCONS_00473367，其靶基因GhCYP724B表达显著下调，植株表现出雄性不育现象；特异沉默GhCYP724B，植株同样出现雄性不育；以上结果均在两年的重复实验中得到证实。

总结：长链非编码RNA TCONS_00473367通过调控GhCYP724B表达模式，影响棉花植株花粉育性。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种棉花花粉育性相关长链非编码RNA及其靶基因的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 802

<212> DNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum L.）

<400> 1

aacatcctta ggagaagagg atgattcgct agcaacgcct tccctttcat ggtagcacaa 60

acatcaaagt gccacttttt tttaaatcgg agctaaaagg gcaaaacatg ccaatagatt 120

cagggatgct acgcaacatg ctaagcctga tcccacataa atcaagacca tgggcgaatt 180

gtatattgct cacgacggta tcttgaatgt taacattttt agaaaaaagt ttgttccgcc 240

tctgcataag cacgatcgac agttgcctac tactacctca acatcatatt ttgcttgaaa 300

ccttcttaca accaacttat tttgcttttg actgagtctc aagacaatgg ccctattgca 360

tgtacgcaaa agcattgcca ttcctctctt actccgacaa caatcgctct ttccaaagat 420

cgacttccta ctcacatgat tttacccgac ggtgttcttc ttcacatgaa tttgaagtag 480

gttcactgtg atttcatgat gaaaacaaaa atgctggtaa gtggcggtca caaaacagaa 540

atatatgaat aaatatttgg tagataataa gggagttgag attttatttc ttttttttca 600

tcaattaata tattaaataa ttattctatg taaggttaat taaggtaaat taatttattt 660

ggtatatata atatttttat ttatttgtat tattatctca aatttttatg tcatgttatt 720

tttaggttta atccaccaat tgatttctaa actatctttt tttttctaac ttacttcata 780

ttttttggtc acaagtgcta cc 802

<210> 2

<211> 1101

<212> DNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum L.）

<400> 2

aacatcctta ggagaagagg atgattcgct agcaacgcct tccctttcat ggtagcacaa 60

acatcaaagt gccacttttt tttaaatcgg agctaaaagg gcaaaacatg ccaatagatt 120

cagggatgct acgcaacatg ctaagcctga tcccacataa atcaagacca tgggcgaatt 180

gtatattgct cacgacggta tcttgaatgt taacattttt agaaaaaagt ttgttccgcc 240

tctgcataag cacgatcgac agttgcctac tactacctca acatcatatt ttgcttgaaa 300

ccttcttaca accaacttat tttgcttttg actgagtctc aagacaatgg ccctattgca 360

tgtacgcaaa agcattgcca ttcctctctt actccgacaa caatcgctct ttccaaagat 420

cgacttccta ctcacatgat tttacccgac ggtgttcttc ttcacatgaa tttgaagtag 480

gtatttctaa gttctgtttc gatataatta agggtttata tgcataaaat aaatcttgga 540

tcccatatca acttaatttg tataatttgt tgatacatca cattcgttga ggcgaagggg 600

ttttatttta taaattatta gattatttag aagaaaaaaa acatgtgttt cacttgggaa 660

aaagtcggtt caatcaccac ataacaacaa aaacaagact tcactattcc atgcatggta 720

ataactcgtt gaattaaaga atattaatga tggtaaacta attactttta tgattacagg 780

ttcactgtga tttcatgatg aaaacaaaaa tgctggtaag tggcggtcac aaaacagaaa 840

tatatgaata aatatttggt agataataag ggagttgaga ttttatttct tttttttcat 900

caattaatat attaaataat tattctatgt aaggttaatt aaggtaaatt aatttatttg 960

gtatatataa tatttttatt tatttgtatt attatctcaa atttttatgt catgttattt 1020

ttaggtttaa tccaccaatt gatttctaaa ctatcttttt ttttctaact tacttcatat 1080

tttttggtca caagtgctac c 1101

<210> 3

<211> 1482

<212> DNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum L.）

<400> 3

atggctgaag gtgattcttg ctgggtggtt gttttggttg ggggagttgt tggttttatt 60

ctagttgttg tgttgaacca tttctggcct ttgctcttca agggtaaggg tgggactgtc 120

cccaagggga gttttggatg gcctttactt ggtgaaacat ttagcttctt aaagcctcac 180

tcttccaatt ctgtgggggc gtttcttcat gatcattgtt ctaggtatgg gaaggtgttc 240

aaatcccatt tgttcttctc ccccacagtg gtatcatgtg acccagagct aaactatttc 300

atacttcaaa ctgaaggcaa gctgttcgag tgtagttatc caaagcctat ccatggcatc 360

ttgggcaagg tttcaatgct tgtggcagtg ggagacactc acaagaggct cagaaatgca 420

gcactctcac tggtcaccat taccaaatca aagcctgagt ttctccatga cattgaaaac 480

atagccattc aaattctgga ctcatggaaa aataaaccac aagtcatctt ctgtgaagag 540

gctagaaagt ttacattcaa tgtaatagta aagcaagtgt tagggttgac accacaagag 600

ccagagactt cagaaattct agaagatttt ctcactttta tgagaggcct catctctctc 660

cctctctata ttcctggaac cccatatgca agagctgttc aggctagaag cagaatatct 720

tctactgtca aagctattgt agagaaaaga agagcaggaa gaagaaataa taataataat 780

gatgatgatg atgataataa taattctaaa aaaaacagtg atttcggagg aatccttcta 840

tctgttgata ccttatctga agatgaaaaa gtgagctttg ttttggattc tttattgggt 900

ggctatgaaa ctacttccct tttgatgtgt atggtgattc atttcttaag ccactcccca 960

gctgcattgc aacagttaaa gcaagaacat cttaaaataa ggagcatgaa gcagaaacat 1020

gatgatcatt tggactggga ggattataag aaaatggaat tcactcaata tgtcatcaat 1080

gaagctctca gatatggcaa cgttgtcaaa ttcgttcacc gaaaggccct taaagatgtc 1140

aaatataaag gttacctaat tccatcagga tggaaggtcc tacctgtttt cactgcagtt 1200

catttagacc catctctcca tgcaaatgct acccagttcc atccatggcg gtgggagagc 1260

caggatccca catgcaaaaa atttacaccc tttggaggtg ggtcaagatg ctgtcctgga 1320

tctgacctag ccaaggttga ggttgctttc ttcctccacc accttgttca aaacttcagg 1380

tggaaaacag aaggtgagga tcaacctata gcatacccct atgtcgaatt tcaaagagga 1440

ttggttctga atgtggatcc atgttcggaa acaactatgt ag 1482

<210> 4

<211> 3334

<212> DNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum L.）

<400> 4

atggctgaag gtgattcttg ctgggtggtt gttttggttg ggggagttgt tggttttatt 60

ctagttgttg tgttgaacca tttctggcct ttgctcttca agggtaaggg tgggactgtc 120

cccaagggga gttttggatg gcctttactt ggtgaaacat ttagcttctt aaagcctcac 180

tcttccaatt ctgtgggggc gtttcttcat gatcattgtt ctaggtaagt ttataactta 240

actcacatca catgtatata tatgcctttt gtatgatgat ttttcactcc ttcagctgtg 300

atgtatatat atatatgtgt gtgtgcgtgg agtaatctaa aatgaaaatt ggtattgaaa 360

tttcaggtat gggaaggtgt tcaaatccca tttgttcttc tcccccacag tggtatcatg 420

tgacccagag ctaaactatt tcatacttca aactgaaggc aagctgttcg agtgtagtta 480

tccaaagcct atccatggca tcttgggcaa ggtttcaatg cttgtggtag tgggagacac 540

tcacaagagg ctcagaaatg cagcactctc actggtcacc attaccaaat caaagcctga 600

gtttctccat gacattgaaa acatagccat tcaaattctg gactcatgga aaaataaacc 660

acaagtcatc ttctgtgaag aggctagaaa ggtatagtac cactagtatt aataaataat 720

aatgttaaag aatctaatca aattctaatg gaatgtttct tacttttttt attttttcct 780

tttgtcaact tttggttcca tgtatagttt acattcaatg taatagtaaa gcaagtgtta 840

gggttgacac cacaagagcc agagacttca gaaattctag aagattttct cacttttatg 900

agaggcctca tctctctccc tctctatatt cctggaaccc catatgcaag agctgttcag 960

gtactcaaca aaagcactgt attgatagct ttgtttatta aattaaatga aacaataata 1020

attatggtgt ggtttaataa atggtttatg agagacttag cttagctcta tatatctctc 1080

tccttttttt ctttttattg tttttggctg caaaaaggaa gcatgtgatc atcaacttta 1140

cctttgacta tctttacagg ctagaagcag aatatcttct actgtcaaag ctattgtaga 1200

gaaaagaaga gcaggaagaa gaaataataa taataatgat gatgatgatg ataataataa 1260

ttctaaaaaa aacagtgatt tcctagaaat ccttctatct gttgatacct tatctgaaga 1320

tgaaaaagtg agctttgttt tggattcttt attgggtggc tatgaaacta cttccctttt 1380

gatgtgtatg gtgattcatt tcttaagcca ctccccagct gcattgcaac agttaaaggt 1440

aaccccaccc ttgtattcta atttccatca atttcatgca gatcttctat tattaatctc 1500

taaatctttt taattatgtt ttgaactaaa aatacagcaa gaacatctta aaataaggag 1560

catgaagcag aaacatgatg atcatttgga ctgggaggat tataagaaaa tggaattcac 1620

tcaatatgta agaaattttc tatatatata tatgttcttt ttcatacttt aatatataaa 1680

aaatagaaca caactttttc ttctaatacc ccaacaaaga agaaaaaaat acaactttgt 1740

tctgatacac ctttttctag catgtttgga ataatgatgt gattttataa ccttttattt 1800

tttctctaat gcatgcttgc ttttcttttt catgcttgta ggtcatcaat gaagctctca 1860

gatatggcaa cgttgtcaaa ttcgttcacc gaaaggccct taaagatgtc aaatataaag 1920

gttttgttat ttatttattt cgatataaaa atgttattag ttctaaaata acaatgtgca 1980

atatgattcg tgattcaata taataatgca gtgcatgaac ttatagatat tgtagtttat 2040

acttctatta taagatatat aacccaaagt tttgggttga aacaggttac ctaattccat 2100

caggatggaa ggtcctacct gttttcactg cagttcattt agacccatct ctccatgcaa 2160

atgctaccca gttccatcca tggcggtggg aggtaaatta ctcatctcat gccctaaatg 2220

gggtacccat ggcctcatct aagtaatggc tgaaagggac catgtcccta actttcactc 2280

aaaacttatc ctattttttt aatttcaact ttcatatgtt catattgggc tcctccaaaa 2340

tctgaagtca aaatataaaa gtgatcactt ataatcattc ccctatagaa aaataatact 2400

aataataatg atgattatag tatgttttaa agtaaaagtt tctttttatt tttacaattt 2460

ctaattttta agttgttgaa atgaagttct ggttctgaaa ctgggggcca tccctcggaa 2520

attttgatct gtttgtagca ttattttgtt gaaattgtgg ggggtggggg accttataaa 2580

ttgtaggaca aagtgacgac ttttcatcag aaatttggag atacgcacca ttttttttgt 2640

tagattcatg aaaatagcct ttcactgtac cttatggcca tgacagatat ttggtacacc 2700

aaacctaaaa taccttacaa tggatccgat tgaccaactt cttgatttac acattcatta 2760

ccacctaaaa caaaataaag aaacatgttt tgttgcattt cagaaacccg tgttgatttt 2820

tcaaaacttc caactatcaa atttcttgaa gtagaaatgc tttgttaatg aaagatgatc 2880

tttcaaaccc gagctcaact gggttcttgt aatcatgtga catttagtaa gttcgagttc 2940

aagtccacct ggactctttt gtggggaaaa cgtacaagat tatttccatg tttttgatgc 3000

agagccagga tcccacatgc aaaaaattta caccctttgg aggtgggtca agatgctgtc 3060

ctggatctga cctagccaag gttgaggttg ctttcttcct ccaccacctt gttcaaaact 3120

tcaggtgatt ttcttatatg tatatccagt aaacaaaatc agcactagtg ctattttctt 3180

cttcaacttt aaaaatccca atttactgta acatagtgac aaattttgta ggtggaaaac 3240

agaaggtgag gatcaaccta tagcataccc ctatgtcgaa tttcaaagag gattggttct 3300

gaatgtggat ccatgttcgg aaacaactat gtag 3334

<210> 5

<211> 493

<212> PRT

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum L.）

<400> 5

Met Ala Glu Gly Asp Ser Cys Trp Val Val Val Leu Val Gly Gly Val

1 5 10 15

Val Gly Phe Ile Leu Val Val Val Leu Asn His Phe Trp Pro Leu Leu

20 25 30

Phe Lys Gly Lys Gly Gly Thr Val Pro Lys Gly Ser Phe Gly Trp Pro

35 40 45

Leu Leu Gly Glu Thr Phe Ser Phe Leu Lys Pro His Ser Ser Asn Ser

50 55 60

Val Gly Ala Phe Leu His Asp His Cys Ser Arg Tyr Gly Lys Val Phe

65 70 75 80

Lys Ser His Leu Phe Phe Ser Pro Thr Val Val Ser Cys Asp Pro Glu

85 90 95

Leu Asn Tyr Phe Ile Leu Gln Thr Glu Gly Lys Leu Phe Glu Cys Ser

100 105 110

Tyr Pro Lys Pro Ile His Gly Ile Leu Gly Lys Val Ser Met Leu Val

115 120 125

Ala Val Gly Asp Thr His Lys Arg Leu Arg Asn Ala Ala Leu Ser Leu

130 135 140

Val Thr Ile Thr Lys Ser Lys Pro Glu Phe Leu His Asp Ile Glu Asn

145 150 155 160

Ile Ala Ile Gln Ile Leu Asp Ser Trp Lys Asn Lys Pro Gln Val Ile

165 170 175

Phe Cys Glu Glu Ala Arg Lys Phe Thr Phe Asn Val Ile Val Lys Gln

180 185 190

Val Leu Gly Leu Thr Pro Gln Glu Pro Glu Thr Ser Glu Ile Leu Glu

195 200 205

Asp Phe Leu Thr Phe Met Arg Gly Leu Ile Ser Leu Pro Leu Tyr Ile

210 215 220

Pro Gly Thr Pro Tyr Ala Arg Ala Val Gln Ala Arg Ser Arg Ile Ser

225 230 235 240

Ser Thr Val Lys Ala Ile Val Glu Lys Arg Arg Ala Gly Arg Arg Asn

245 250 255

Asn Asn Asn Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asn Asn Asn Ser Lys Lys Asn

260 265 270

Ser Asp Phe Gly Gly Ile Leu Leu Ser Val Asp Thr Leu Ser Glu Asp

275 280 285

Glu Lys Val Ser Phe Val Leu Asp Ser Leu Leu Gly Gly Tyr Glu Thr

290 295 300

Thr Ser Leu Leu Met Cys Met Val Ile His Phe Leu Ser His Ser Pro

305 310 315 320

Ala Ala Leu Gln Gln Leu Lys Gln Glu His Leu Lys Ile Arg Ser Met

325 330 335

Lys Gln Lys His Asp Asp His Leu Asp Trp Glu Asp Tyr Lys Lys Met

340 345 350

Glu Phe Thr Gln Tyr Val Ile Asn Glu Ala Leu Arg Tyr Gly Asn Val

355 360 365

Val Lys Phe Val His Arg Lys Ala Leu Lys Asp Val Lys Tyr Lys Gly

370 375 380

Tyr Leu Ile Pro Ser Gly Trp Lys Val Leu Pro Val Phe Thr Ala Val

385 390 395 400

His Leu Asp Pro Ser Leu His Ala Asn Ala Thr Gln Phe His Pro Trp

405 410 415

Arg Trp Glu Ser Gln Asp Pro Thr Cys Lys Lys Phe Thr Pro Phe Gly

420 425 430

Gly Gly Ser Arg Cys Cys Pro Gly Ser Asp Leu Ala Lys Val Glu Val

435 440 445

Ala Phe Phe Leu His His Leu Val Gln Asn Phe Arg Trp Lys Thr Glu

450 455 460

Gly Glu Asp Gln Pro Ile Ala Tyr Pro Tyr Val Glu Phe Gln Arg Gly

465 470 475 480

Leu Val Leu Asn Val Asp Pro Cys Ser Glu Thr Thr Met

485 490

Claims

1.一种长链非编码RNA，是如下a)或b)的长链非编码RNA：

a)由序列表序列1所示的核苷酸序列构成的长链非编码RNA；

b)由序列表序列1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸碱基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由a)衍生的长链非编码RNA。

2.含有权利要求1所述长链非编码RNA的重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

3.一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物育性相关的由a)衍生的蛋白质。

4.权利要求3所述蛋白质的编码基因，为如下1)-6)基因中的任意一种DNA分子：

1)其核苷酸序列是序列表序列3中第1位至第1482位所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表序列4中第1位至第3334位所示的DNA分子；

3)其核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子；

4)其核苷酸序列是序列表序列4所示的DNA分子；

5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求3所述蛋白质的DNA分子；

6)在严格条件下与1)或2)或3)或4)或5)限定的DNA分子杂交且编码权利要求3所述蛋白质的DNA分子。

5.含有权利要求4所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

6.如权利要求2或权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1所述的长链非编码RNA或权利要求4所述的编码基因插入载体pCLCrVA得到的重组载体；

所述重组载体是按如下方法制备得到的：

用Spe I和Pac I对含有长链非编码RNA或编码基因的载体pMD18-T进行双酶切，回收0.5kb的目的片段，与经Spe I和Pac I双酶切的载体pCLCrVA的骨架连接，获得重组载体。

7.权利要求1所述长链非编码RNA、权利要求3所述的蛋白质或权利要求4所述的编码基因在调控目的棉花花粉育性中的应用。

8.一种创制棉花雄性不育系的方法，包括将权利要求1所述长链非编码RNA或权利要求4所述的编码基因在棉花中敲除的步骤。

9.一种培育转基因棉花的方法，是将权利要求1所述长链非编码RNA或权利要求4所述的编码基因在棉花中敲除后，得到花粉育性低于受体棉花的转基因棉花。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述敲除是通过权利要求6所述的重组载体实现的。