CN112899202A - 一株促进鲁氏接合酵母产愈创木酚类物质的魏斯氏菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株促进鲁氏接合酵母产愈创木酚类物质的魏斯氏菌，属于生物工程技术领域。通过将类肠膜魏斯氏菌LCW‑28与鲁氏接合酵母ZQ‑01在培养基中共培养有效提高了愈创木酚类物质的产量，愈创木酚类物质的总产量最高比单独培养提高了3.87倍，与假丝酵母相比提高了15.71倍，与光滑球拟酵母相比提高了17.28倍；其中，4‑乙基愈创木酚产量为2.12mg/L，是单独培养鲁氏接合酵母的8.8倍。

Description

一株促进鲁氏接合酵母产愈创木酚类物质的魏斯氏菌

技术领域

本发明涉及一株促进鲁氏接合酵母产愈创木酚类物质的魏斯氏菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

愈创木酚类物质包含了愈创木酚，4-乙基愈创木酚，4-乙烯基愈创木酚，具有烟熏味、酱香味与温和的烧烤味，是酱油公认的表征风味物质之一，它是一种调味酱料，是一种重要的天然香精。适当含量的愈创木酚可提高酱油的浓厚感，并缓和酱油咸味的作用。若少含或不含愈创木酚，则酱油口味淡薄，其含量相差0.5mg/L就很容易被感官所识别。愈创木酚类物质是酱油主要风味成分之一，因此，需要将其在酱油中的含量增至合适的浓度。

目前主要从两个方面增加酱油中的愈创木酚类物质：1、发酵工艺。愈创木酚类物质根据报道其前体主要为阿魏酸和木质素，所以提高其在酱油发酵过程中的含量能有效提高愈创木酚类物质的含量；此外，发酵过程的温度、pH、氧气含量等发酵条件也存在影响。其弊端是由影响因素过多导致的工作量大，耗时耗力，效率低。2、微生物手段。对微生物进行基因改造来调控愈创木酚类物质代谢，可从源头上强化其生成途径，是目前最有效的一种方法，局限性在于人们担心这类菌株的安全性以及可能会对酱油风味形成产生不可控的影响。尽管可以产生愈创木酚类物质，但产量很少不足以提高酱油口感。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种提高发酵体系中愈创木酚类物质含量的方法，所述方法是将类肠膜魏斯氏菌LCW-28与鲁氏接合酵母共同发酵培养。

在一种实施方式中，所述类肠膜魏斯氏菌LCW-28，已于2020年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020778。

在一种实施方式中，所述类肠膜魏斯氏菌具有促进鲁氏接合酵母生长的功能。

在一种实施方式中，所述鲁氏接合酵母为鲁氏接合酵母ZQ-01。

在一种实施方式中，所述鲁氏接合酵母ZQ-01，记载于张继冉.酱油中氨基甲酸乙酯的产生机制和消除策略研究[D].江南大学,2016。

在一种实施方式中，所述发酵的培养基包括但不限于MRS培养基。

在一种实施方式中，所述类肠膜魏斯氏菌LCW-28在发酵体系中的终浓度为1×10⁶～1×10⁷CFU/mL；鲁氏接合酵母在发酵体系中的终浓度为1×10⁶～1×10⁷CFU/mL。

在一种实施方式中，所述发酵的反应条件是在35～39℃静置培养55～65h。

在一种实施方式中，所述愈创木酚类物质包括愈创木酚、4-乙基愈创木酚和4-乙烯基愈创木酚。

本发明的第二个目的是提供一种组合物，所述组合物由鲁氏接合酵母ZQ-01和类肠膜魏斯氏菌LCW-28组成。

在一种实施方式中，所述类肠膜魏斯氏菌LCW-28已于2020年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020778。

在一种实施方式中，所述鲁氏接合酵母ZQ-01记载于张继冉.酱油中氨基甲酸乙酯的产生机制和消除策略研究[D].江南大学,2016。

本发明的第三个目的是提供一种发酵剂，所述发酵剂含有上述组合物。

在一种实施方式中，所述发酵剂的制备方式为：取200～600μL的类肠膜魏斯氏菌LCW-28接种于10～30mL MRS液体培养基中，37℃下活化2至3代；取200～600μL的鲁氏接合酵母ZQ-01接种于10～30mL MRS液体培养基中，30℃下活化2至3代；待活菌数达到1.0×10⁶CFU/mL以上时，6000～1000rpm下离心15min，去除上清，在无菌环境下依次加入缓冲液和冷冻保护剂，待细胞浓度不低于1.0×10⁶CFU/mL时，等比例混合两菌，真空冷冻干燥处理得到发酵剂。

在一种实施方式中，所述缓冲液为pH值为6～7的0.1～0.3M磷酸盐缓冲液和/或0.5％～1％的生理盐水和/或双蒸水，冷冻保护剂为10～20％的甘油和/或8～12％的海藻糖。

本发明还保护所述提高愈创木酚类物质含量的方法，或所述发酵剂在制备含愈创木酚类物质食品中的应用。

在一种实施方式中，所述含愈创木酚类物质食品包括含愈创木酚类物质的调味品和酒。

在一种实施方式中，所述酒包括白酒、葡萄酒、啤酒、起泡酒或果酒；所述调味品包括酱油或醋。

有益效果：

类肠膜魏斯氏菌LCW-28与愈创木酚类物质合成菌株鲁氏接合酵母ZQ-01共培养，能够很好地提高体系中生成的愈创木酚类物质，与单独接种鲁氏接合酵母相比可使愈创木酚类物质提高达3.87倍；其中，愈创木酚提高1.26倍，4-乙基愈创木酚提高7.83倍，4-乙烯基愈创木酚提高7.63倍。

生物材料保藏

本发明所提供的类肠膜魏斯氏菌，分类命名为WeissellaparamesenteroidesLCW-28，已于2020年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2020778，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

附图说明

图1为4-乙基愈创木酚生物合成途径。

图2为共培养下类肠膜魏斯氏菌与鲁氏接合酵母的活细胞计数；对照为类肠膜魏斯氏菌纯培养，鲁氏接合酵母纯培养，假丝酵母纯培养。图A为类肠膜魏斯氏菌LCW-28活细胞计数，图B为酵母活细胞计数。

图3为酱油发酵体系中各微生物共培养对愈创木酚类物质产量的影响，各菌株均为本发明筛选得到的其他的菌株(Zygosaccharomyces rouxii是鲁氏接合酵母，Candidaorthopsilosis是假丝酵母，Tetragenococcus halophilus是嗜盐四链球菌，Staphylococcus pasteuri是葡萄球菌，Bacillus cereus是芽孢杆菌，Pediococcusacidilactici是乳酸足球菌)。

图4为鲁氏接合酵母与类肠膜魏斯氏菌LCW-28共培养，对鲁氏接合酵母合成愈创木酚类物质途径上重要基因的相对表达量的影响。对照为鲁氏接合酵母纯培养。

具体实施方式

鲁氏接合酵母ZQ-01：鲁氏接合酵母ZQ-01：记载于张继冉.酱油中氨基甲酸乙酯的产生机制和消除策略研究[D].江南大学,2016。

类肠膜魏斯氏菌LCW-28，已于2020年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020778，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

MRS培养基：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉8g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二甲2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温801g/L。

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L。

高效气相色谱与质谱仪联用分析法测定愈创木酚类物质含量：参见周金虎.黄鹤楼酒生态洞酿产愈创木酚类功能菌的筛选与应用[D].湖北工业大学,2019.

活细胞计数法：称取1g菌液倒入盛有灭菌玻璃珠和99mL生理盐水锥形瓶中混匀，梯度稀释后涂布到类肠膜魏斯氏菌和酵母菌计数培养基上，30℃培养1～3天后计数。类肠膜魏斯氏菌为兼性厌氧菌，平板培养为1～3天出现小菌落。因此，共培养的菌液进行MRS平板计数时类肠膜魏斯氏菌可以和酵母区分。

实施例1：共培养对类肠膜魏斯氏菌和鲁氏接合酵母生长的影响

类肠膜魏斯氏菌LCW-28在37℃的MRS中静置培养24h，以获得预培养物。将预培养物以2％(v/v)的接种量接种到100mL新鲜MRS培养基中。静态孵育24h后，以10000g离心5min收集细胞，并重悬于4mL无菌水中。将1mL悬浮液转移到装有30mL MRS培养基的50mL离心管中，并在37℃静态生长4h。

鲁氏接合酵母在含有6％(m/v)NaCl的YPD培养基中于30℃静态生长24h，以获得预培养物。将预培养物以2％(v/v)的接种量接种到100mL含有6％(m/v)NaCl的新鲜YPD肉汤中。静态孵育24h后，以10000g离心5min收集细胞，并重悬于4mL无菌水中。

类肠膜魏斯氏菌LCW-28的纯培养，将30mL MRS肉汤接种1mL悬浮液，计数为2.5×10⁸CFU/L，并在37℃静态生长8h。

鲁氏接合酵母纯培养，用0.5mL悬浮液接种30mL MRS肉汤，计数为3.4×10⁷CFU/mL，并在30℃静态生长4h。

当共培养类肠膜魏斯氏菌LCW-28和鲁氏接合酵母ZQ-01时，将鲁氏接合酵母的1mL细胞悬液(3.4×10⁷CFU/mL)转移至30mL MRS肉汤中，并添加1mL的类肠膜魏斯氏菌LCW-28细胞悬浮液，37℃静态生长8h。

用活细胞计数法测定两种菌的生长情况。

结果如图2A所示，类肠膜魏斯氏菌LCW-28和鲁氏接合酵母或假丝酵母共培养时，与类肠膜魏斯氏菌LCW-28单独培养的活细胞数无明显差异，类肠膜魏斯氏菌LCW-28的生长状态不受影响；如图2B所示，当类肠膜魏斯氏菌LCW-28和鲁氏接合酵母ZQ-01共培养时，鲁氏接合酵母ZQ-01的活细胞数明显上升，比未添加类肠膜魏斯氏菌对照增加0.8～0.97个数量级，最高达到1.0×10⁸CFU·g^-1。因此，添加类肠膜魏斯氏菌LCW-28与鲁氏接合酵母ZQ-01共培养可以有效提高鲁氏接合酵母ZQ-01的浓度。

实施例2：不同微生物共培养对愈创木酚类物质产量的影响

将鲁氏接合酵母ZQ-01、假丝酵母(Candida orthopsilosis)、或光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)，在MRS培养基中分别与类肠膜魏斯氏菌LCW-28，葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)，嗜盐四链球菌(Tetragenococcus halophilus)，芽孢杆菌(Bacillus cereus)或乳酸足球菌(Pediococcus acidilactici)进行共培养。

在装有30mL MRS培养基的100mL培养瓶中，同时添加进行共培养的菌液(3.4×10⁷CFU/mL)，37℃培养60h，每隔10h吸取发酵液。检测发酵上清液愈创木酚类物质的量。

发酵液在4℃下10000r/min离心5min，收集上清液，加入5倍量的二氯甲烷及83.36μg·L^-1的2-辛醇作为内标超声萃取15min，经分液漏斗得到有机相，重复提取2次。向有机相中加5g无水Na2SO4，12h，过滤，在冰浴中经氮气吹扫浓缩至0.5mL供GC/MS检测分析。

通过表1可以看出，鲁氏接合酵母与类肠膜魏斯氏菌共培养时愈创木酚类物质含量最高达到3.075mg/L，与鲁氏接合酵母纯培养培养提高了3.87倍，与假丝酵母相比提高了15.71倍。与光滑球拟酵母相比提高了17.28倍。说明类肠膜魏斯氏菌与鲁氏接合酵母共培养能显著提高愈创木酚类物质的含量。

表1不同菌株共培养愈创木酚类物质含量

实施例3：共培养对合成4-EG途径上重要基因的表达影响

将培养好的鲁氏酵母菌悬液于4℃条件下，12000r/min离心3min，弃上清液后置于离心管(DEPC水处理)放入液氮中，待菌体凝固后倒入预冷好的研钵中进行研磨，将菌体研磨为白色粉末，并转移到1.5mL Eppendorf管中。采用Nasia试剂盒进行RNA提取，将反转录过的cDNA使用THUNDERBIRD

qPCR Mix试剂盒按照仪器说明进行qRT-PCR反应。所用引物如(表2)所示。

当共培养4h时，基因的相对表达量差异最大，其中aroB与aroF相对表达量增加最多，与对照组相比增加了4.5倍与3.2倍(图3)。然而，合成苯丙氨酸的主要基因pheA有所下将这证明，共培养并不能提苯丙氨酸的含量。其中与4-EG合成有着最直接关系的pad有着显著提高，说明类肠膜魏斯氏菌能促进酚酸脱羧酶的表达从而使阿魏酸和香豆酸脱羧产生4-EG。

表2本发明所用引物

实施例4：共培养对合成4-EG途径上重要酶的酶活影响

PAL酶活测定原理是：PAL催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm处有强吸收峰，因此可通过测定反应液在290nm处的吸光值变化计算PAL活性，通过计算即可得出PAL活性的高低。

DAHP的酶活测定原理根据DAHP在450nm处有最大吸收峰的有色物质，通过检测该有色物质在450nm的增加速率，进而计算出DAHP酶活性的大小。

FDC1酶活测定原理是根据(Cavin等人1997)稍作修改。阿魏酸脱羧酶可以使阿魏酸生成4-VG，在340nm下检测FA的下降速率，即可反映FDC1活性大小。

C4H酶活测定原理是以肉桂酸作为底物，在酶促反应的最适反应条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于酶标仪或分光光度计在290nm处检测吸光值，即可计算出C4H活性大小。所有酶活性测定方法均按苏州格锐思生物科技有限公司购买的试剂盒说明书执行。

类肠膜魏斯氏菌LCW-28与鲁氏酵母共培养中的DAHP活性在发酵6d时相对于鲁氏酵母纯培养上调31.88％(P<0.01)。在发酵6d时，共培养中的TAL较纯培养显著上调28.8％(P<0.01)。共培养中的PAD在发酵6d时与纯培养时上调了1.46倍(图4)。尽管酶的活性并不直接反映代谢通量，但它们可能显示出细胞中这些酶存在的定量证据。因此，这三种酶被认为是在鲁氏酵母中生成4-EG的关键因素。

实施例5：共培养对合成愈创木酚类物质途径上重要中间产物的含量影响

取100μL样本，加入400μL含有2-氯苯丙氨酸的提取液，涡旋30s；超声5min(冰浴)；-20℃沉淀1h；4℃，12000rpm离心15min；吸取425μL上清液移至EP管中(动作轻缓)；将提取物放入真空浓缩器中干燥，加入100μL蒸馏水复溶并重复涡旋以后的步骤；将上清液(60μL)转移到2mL进样瓶，每个样本各取10μL混合成QC(Quality control)样本，取QC60μL进行上机检测。

液相色谱质谱条件：AB 6600Triple TOF质谱仪通过Analyst TF 1.7,AB Sciex软件对质谱数据进行一级、二级区分采集，在每个数据过程中，筛选出对应的二级质谱数。质谱条件：轰击能量：30eV，15张二级谱图每50ms。ESI离子源参数设置如下：雾化气压(GS1)：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度：600℃，喷雾电压：5000V(正离子模式)或-4000V(负离子模式)。本项工作由上海阿趣生物科技有限公司完成。

对与4-EG途径相关的中间代谢产物含量进行了测定，结果如表3所示，发现其中莽草酸途径中间代谢产物都有显著性提高，发酵6d时，共培养中烯醇式丙酮酸，赤藓糖-4-磷酸和莽草酸的含量高于纯培养，且在发酵期间差异最大。在共培养中，烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸显著上调比纯培养增加68.59％和61.06％。此外，共培养中的酪氨酸含量在发酵6d时也要高于纯培养，增加了59.39％。苯丙氨酸的含量则一直处于下降趋势，在第6天与对照组相比下降了40.9％。对香豆酸是4-EG的直接前体，对香豆酸的含量在第6d与对照组相比提高了2.28倍。根据实施例3～5的结果绘制得到如图1所示的4-乙基愈创木酚生物合成途径。

表3愈创木酚类物质合成相关中间代谢产物

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高发酵体系中愈创木酚类物质含量的方法，其特征在于，所述方法是将类肠膜魏斯氏菌与鲁氏接合酵母共同发酵培养；所述类肠膜魏斯氏菌是类肠膜魏斯氏菌LCW-28，其保藏编号为CCTCC M 2020778，已于2020年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心；

所述类肠膜魏斯氏菌具有促进鲁氏接合酵母生长的功能。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鲁氏接合酵母为鲁氏接合酵母ZQ-01。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基包括但不限于MRS培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述类肠膜魏斯氏菌LCW-28在发酵体系中的终浓度为1×10⁶～1×10⁷CFU/mL；鲁氏接合酵母在发酵体系中的终浓度为1×10⁶～1×10⁷CFU/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的反应条件是在35～39℃培养55～65h。

6.一种组合物，其特征在于，由鲁氏接合酵母ZQ-01和类肠膜魏斯氏菌LCW-28组成；所述类肠膜魏斯氏菌LCW-28的保藏编号为CCTCC M 2020778，已于2020年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心。

7.一种发酵剂，其特征在于，含有权利要求6所述组合物。

8.制备权利要求7所述发酵剂的方法，其特征在于，将类肠膜魏斯氏菌LCW-28和鲁氏接合酵母ZQ-01分别活化，将活化后得到的菌液经离心、收集沉淀后，在沉淀中加入缓冲液和冷冻保护剂得到重悬液，等比例混合两菌重悬液后，真空冷冻干燥处理得到发酵剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液和/或生理盐水和/或双蒸水，所述冷冻保护剂为甘油和/或海藻糖。

10.权利要求1～5任一所述组方法，或权利要求6所述组合物或权利要求7所述发酵剂在制备含愈创木酚类物质食品中的应用。

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