CN112280697A - 一种通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及高产油酿酒酵母 - Google Patents

一种通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及高产油酿酒酵母 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及高产油酿酒酵母，具体的，所述培养方法为通过调控培养液的pH值维持在7.2至7.8之间以提高酿酒酵母油脂含量的方法。本方法有效避免了产油酿酒酵母菌株大规模筛选所具有的工作量庞大且结果具有随机性和不确定性的不足，同时，相比常规的微生物油脂积累诱导方法，本方法培养酿酒酵母可以获得更高的油脂含量和油脂产量，可以解决高值棕榈油酸资源量不足的问题，具有极大的工业化生产及应用价值，可带来极好的经济效益和社会效益。

Description

一种通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方 法及高产油酿酒酵母
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，具体的，涉及一种在酿酒酵母培养过程中，通过调控培养液pH以提高酿酒酵母油脂含量的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
在酿造业以及面点食品加工业中，酿酒酵母得到了广泛应用，近来研究发现，酿酒酵母的油脂中富含棕榈油酸(十六碳烯酸，C16:1)，这是一种价格昂贵且在自然界中非常稀有的ω-7单不饱和脂肪酸。研究表明：棕榈油酸对高血压、高血脂、代谢功能综合征、II型糖尿病等疾病具有显著的预防和治疗效果，相关的医药制剂已在欧美等国家上市，但目前，棕榈油酸主要来自野生动植物资源，如澳洲坚果、沙棘、深海鱼等，而由于上述野生动植物难以商业化养殖或种植，导致市场发展受限。在酿酒酵母总脂中棕榈油酸的占比可以达到50％左右，应用前景良好、价值度高。但是，由于酿酒酵母的油脂含量只能达到细胞干重的5％左右，难以通过自身大量积累。即使在油脂诱导培养基中培养(例如：缺氮等)，其油脂含量也很少超过20％，因此，很少有关于酿酒酵母产油的研究，一般也不认为酿酒酵母是一种产油微生物。现有的酿酒酵母发酵培养过程中，酵母细胞优先将有机碳源转化成乙醇和细胞生物量而不是用于油脂的积累，因此如果用其来产油，其糖对油脂的得率很低，糖耗(生产单位油脂的耗糖量)必然很高。同时油脂含量过低不利于提取油脂，提取率过低。由于上述原因，酿酒酵母生产油脂的成本被大幅度推高了。因此，要利用酿酒酵母来工业化生产棕榈油酸，必须发展新的技术来提高酿酒酵母的油脂含量。
目前，在酿造业和面点食品加工行业中，酿酒酵母应用广泛，但很少有研究其油脂积累的文献报道。通过培养基优化，特别是碳氮比等的控制来提高酿酒酵母的油脂含量是最常采用的方法。如有研究表明在葡萄糖15％(w/v，下同)，酵母浸粉0.4％，蛋白胨0.2％，柠檬酸0.471％，ZnSO4·7H2O 0.2％，MgSO4·7H2O0.1％，FeSO4·7H2O 0.005％，CaCl20.025％的优化培养基中，培养4天后的酿酒酵母细胞油脂含量最高可达14.55％。但与其他产油微生物相比，这一油脂含量实在是太低了，不具备生产应用价值。也有人研究发现：用优化的高有机碳浓度(50g/L)低氮浓度(5mM)的培养基发酵培养的过程中，酿酒酵母的油脂含量提高到了20％。这表明：对于酿酒酵母，高碳氮比的油脂诱导培养对于油脂积累的强化作用非常有限，无法满足工业生产油脂的要求(例如，一般的产油微生物和产油农作物的油含量在40％左右，如果低于40％则认为产油性价比不高，不宜用于油脂生产)。
近些年，有研究试图通过基因工程改造来提高酿酒酵母的油脂含量。有研究人员对酿酒酵母进行了基因改造以强化其油脂合成途径，但其油脂含量也只有11.6％，油脂产量极低，仅有0.023g/L。更重要的是，将基因工程微生物应用于食品等原料的生产，其安全性还存在巨大争议，短期内，基因工程微生物生产食品类原料还难以实现商业化应用。
发明内容
针对上述技术不足和技术空缺，本发明提供了一种有效的解决方法，即在酿酒酵母发酵培养过程中，通过调控发酵培养液的pH值，使其维持在7.2至7.8之间，在该弱碱性培养环境下，酿酒酵母细胞内乙醇合成途径中的中间产物乙醛不再能作为正常的氢受体，两分子的乙醛之间将进行互相氧化-还原发生歧化反应，导致乙醇的生产受限；同时，由于主要代谢产物的生成受到限制，酿酒酵母细胞内的有机碳代谢流向倾向于向脂肪酸的合成。并且，细胞内脂肪酸的从头合成过程作为氢受体体系，大量合成脂肪酸，并最终形成油脂。这一方法与本研究领域通过高碳氮比促进微生物油脂积累的普遍方法存在极为显著的区别，且促进酿酒酵母油脂积累的效果更加显著，同时，本方法从未在酿酒酵母的油脂积累研究中被报道过。而且，酿酒酵母的常规培养中所采用的pH值为4至6，为酸性环境，但在该酸性条件下，酿酒酵母的油脂含量极低。因此，本方法具有明显的创造性和显著的新颖性，也具有极大的工业化生产及应用价值。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，包括：在酿酒酵母培养过程中，调控发酵培养液的pH值，使其维持在7.2至7.8之间。
由上述分析可知，现有的技术手段没有找到一个方便有效的手段来解决酿酒酵母的油脂积累强化问题。本发明对酿酒酵母的碳代谢途径进行分析发现，其油脂含量低的主要原因是酿酒酵母会将有机碳源优先转化成乙醇，而不是油脂的基本构成单元脂肪酸。因此，要提高酿酒酵母的油脂含量，从有机碳源向乙醇和脂肪酸合成的分配入手，通过调控手段使有机碳源较少地流向乙醇的合成，而较多地流向脂肪酸的合成，可能是一个比较有效的强化酵母产油的方法。
本发明的第二个方面，提供了任一上述的方法培养的高产油酿酒酵母。
本发明可以使酿酒酵母的油脂含量达到细胞干重的45％以上，从而使其具有了工业化的应用前景，形成了一条新的油脂生产途径。
本发明的第三个方面，提供了上述的高产油酿酒酵母在油脂生产中的应用。
由于本发明的高产油酿酒酵母产油效率高、培养方法简单，因此，有望在油脂生产中得到广泛的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了一种提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，该方法为：在酿酒酵母培养过程中，通过调控培养液的pH值，使其维持在7.2至7.8之间，在该弱碱性培养环境下，酿酒酵母细胞内乙醇合成途径中的中间产物乙醛不再作为正常的氢受体，导致乙醇的发酵生产受限；同时，由于主要代谢产物的生成受到限制，酿酒酵母细胞内的有机碳代谢流向倾向于脂肪酸的合成。并且，细胞内脂肪酸的从头合成过程作为氢受体体系，大量合成脂肪酸，并最终形成油脂。通过该方法可以使酿酒酵母的油脂含量达到细胞干重的45％以上。
(2)本发明提供的方法与本研究领域通过高碳氮比促进微生物油脂积累的普遍方法存在极为显著的差别，且作用原理也完全不同。普遍方法的作用原理是通过培养液中氮元素的缺乏抑制微生物的生长和蛋白质的合成，从而降低蛋白质在细胞干重中的占比，因此，相对地细胞干重中另外两种主要成分糖类和油脂的含量会得到提高。但普遍方法中的缺氮条件会大幅降低培养液中的微生物细胞密度(即生物量)，从而导致油脂产量和油脂产率的降低。本发明提供的方法的作用原理是通过调控培养液的pH值至7.2～7.8的弱碱性环境来调控有机碳代谢流向，以及细胞内脂肪酸从头合成过程的相关酶活性，从而实现其油脂合成的强化。由此可见，本发明所提供的方法完全区别于普遍方法，普遍方法对本发明所提供的方法不具备启发作用，也不具有借鉴效果。因此，本发明所提供的方法具有极其明显的创造性。
(3)从促进油脂积累的效果来看，本发明所提供的方法可以使酿酒酵母的油脂含量达到细胞干重的45％以上，而普遍方法只能使酿酒酵母的油脂含量达到细胞干重的20％以下，因此本方法是普遍方法所能达到的效果的2.2倍以上。同时，本发明所提供的方法可以使酿酒酵母的细胞密度达到27g/L以上，而普遍方法由于其对生长的限制作用而只能使酿酒酵母的细胞密度达到4g/L左右(由本发明实施例提供)，因此，通过简单计算可知，本方法所能达到的油脂产量为12.2g/L，而普遍方法所能达到的油脂产量不足0.8g/L，可见本发明所提供的方法的油脂产量是普遍方法的15倍以上。在另一项以酿酒酵母产油为目的的研究中，尽管对酿酒酵母进行了基因改造以强化其油脂合成途径，但其油脂含量只有11.6％，油脂产量也仅有0.023g/L(Kyung Ok Yu,et al.Development of a Saccharomycescerevisiae strain for increasing the accumulation of triacylglycerol as amicrobial oil feedstock for biodiesel production using glycerol as asubstrate.Biotechnology&Bioengineering,2012,110(1):343-347)，本发明是其的530倍。这一方面再次说明了酿酒酵母油脂积累的困难程度，另一方面也凸显了本发明的有益效果。同时，本发明所提供的方法从未在酿酒酵母的油脂积累研究中被报道过。由此可见，本发明所提供的方法具有极为显著的新颖性。
(4)本发明所提供的方法还可以避免产油酿酒酵母菌株大规模筛选所具有的工作量庞大且结果具有随机性和不确定性的不足，而本方法对酿酒酵母菌株具有广泛适用性。
(5)本发明由于可以大幅提高酿酒酵母的油脂含量，因此在油脂提取过程中可以采用更简单的油脂提取工艺，也可以获得更高的油脂提取率，并可降低油脂提取成本，提高有机碳源向目标产物的转化率，降低培养成本。
(6)酿酒酵母的油脂中富含非常稀有且价格昂贵的棕榈油酸，其对糖尿病、代谢功能综合征、高血脂、高血压等疾病具有显著的预防和治疗效果。但目前棕榈油酸主要来源于难以商业化养殖或种植的野生动植物资源，如深海鱼、沙棘、澳洲坚果等，资源量极其有限。棕榈油酸虽已被开发成医药制剂在欧美等国家上市，但由于资源问题而导致市场发展受限。在国内，糖尿病、代谢功能综合征、高血脂、高血压等疾病的发展日趋严峻，而棕榈油酸相关医药制剂的开发和推广也因资源量的不足而受到限制。本发明所提供的方法正好可以解决棕榈油酸资源不足的问题，具有极大的工业化应用价值，也具有极为重要的社会效益和经济效益。
(7)本发明的方法简单、操作方便、实用性强，易于推广。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为不同pH值对酿酒酵母生长和油脂含量的影响；
图2为pH弱碱性和氮缺乏对酿酒酵母生长和油脂含量影响的对比；
图3为厌氧和好氧培养条件下维持pH弱碱性对酿酒酵母生长和油脂含量的影响；
图4为在不同培养阶段开始维持pH弱碱性对酿酒酵母油脂含量的影响；
图5为不同酿酒酵母菌株在pH弱碱性条件下的油脂含量；
图6为pH弱碱性条件下酿酒酵母的脂肪酸组成。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如上所述，酿酒酵母油脂含量低，而现有技术促进酿酒酵母油脂积累的效果极其有限，远不能满足油脂大量生产的需求。同时，酿酒酵母油脂中富含有重要医用价值的棕榈油酸，大量生产富含棕榈油酸的油脂具有极为重要的社会效益和经济效益。因此急需发明一种快速有效的方法促进酿酒酵母油脂的大量积累。
有鉴于此，本发明提供一种大幅提高酿酒酵母油脂含量的方法，所述方法包括：在酿酒酵母培养过程中，通过调控培养液的pH值，使其维持在7.2至7.8之间，以促进酿酒酵母油脂的积累。
本发明的目的之一在于提供一种提高酿酒酵母油脂含量的培养方法。
本发明的目的之二在于提供通过上述方法制备得到的酿酒酵母油脂。
为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，所述方法包括：在酿酒酵母培养过程中，通过调控培养液的pH值，使其维持在7.2至7.8之间，以促进酿酒酵母油脂的积累。
进一步的，所述酿酒酵母英文名称为Saccharomyces cerevisiae，又称面包酵母，或者出芽酵母，或者通俗地称为啤酒酵母，或者红酒酵母，或者白酒酵母，或者葡萄酒酵母，或者果酒酵母；
进一步的，所述的培养过程包括厌氧发酵培养过程和/或好氧发酵培养过程；
进一步的，所述的维持培养液的pH在7.2至7.8之间这一过程可以起始于整个培养过程的任何阶段。
本发明的第二个方面，提供上述方法制备得到的酿酒酵母油脂。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。同时本发明实施例中所用到的酿酒酵母均为已记录的野生种，普通技术人员可以通过商业渠道购买得到，或从自然环境中分离纯化得到，无需进行用于专利程序的生物材料保藏。
以下实施例中，实施例1-4、6采用的酿酒酵母的编号为SC-17，购买自弗曼迪斯酵母公司，商品型号为S-23。
实施例1：
不同的pH值条件下酿酒酵母的生长和油脂含量，具体步骤如下：
在酿酒酵母培养过程中，通过加酸或加碱的方式，调控培养液的pH值分别维持在4、5、6、7、7.2、7.5、7.8、8，持续培养4天后用重量法测定培养液中酿酒酵母的生物量，用氯仿-甲醇法测定其油脂含量。其他培养条件为：接种量5％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％，葡萄糖150g/L，空气通气量0.5vvm，转速800rpm，温度28℃。
结果如图1所示，在调控培养液的pH值在7.2至7.8的条件下，酿酒酵母的生物量可以达到25g/L以上，油脂含量为细胞干重的45％以上。而在pH值在4至7的条件下，虽然酿酒酵母的生物量可以达到30g/L以上，但油脂含量只有细胞干重的10％左右，通过计算可知，调控培养液的pH值在7.2至7.8之间可以使酿酒酵母的油脂产量达到酿酒酵母常用的酸性培养条件下的4倍左右。
实施例2
pH弱碱性条件和氮缺乏对酿酒酵母生长和油脂含量影响的对比，具体步骤如下：
在酿酒酵母培养过程中，通过加酸或加碱的方式，调控培养液的pH值维持在7.5，持续培养4天后用重量法测定培养液中酿酒酵母的生物量，用氯仿-甲醇法测定其油脂含量。其他培养条件为：接种量5％，蛋白胨5％，酵母浸粉0％，葡萄糖150g/L空气通气量0.02vvm，转速200rpm，温度28℃。以氮缺乏培养组(不添加酵母浸粉和蛋白胨，pH为6)作为对照。
结果如图2所示，在pH7.5的弱碱性培养条件下，酿酒酵母的生物量可以达到27g/L，油脂含量为细胞干重的46％。而在微生物产油诱导的普遍培养方法，即氮缺乏培养组中，酿酒酵母的生物量只有4g/L，油脂含量为18％，通过计算可知，pH7.5的弱碱性培养条件下酿酒酵母的油脂产量是通过微生物常用诱导产油方法所获得的油脂产量的17.3倍。
实施例3
厌氧和好氧培养条件下维持pH弱碱性对酿酒酵母生长和油脂含量的影响，具体步骤如下：
在酿酒酵母培养过程中，通过加酸或加碱的方式，调控培养液的pH值维持在7.5，持续培养4天后用重量法测定培养液中酿酒酵母的生物量，用氯仿-甲醇法测定其油脂含量。其他培养条件为：接种量5％，蛋白胨0％，酵母浸粉5％，葡萄糖160g/L，好氧条件下空气通气量4vvm，厌氧条件下不通空气，温度28℃，转速10rpm。
结果如图3所示，在好氧条件下，调控培养液的pH值维持在7.5，酿酒酵母的生物量可以达到27g/L，油脂含量为细胞干重的46％。在厌氧条件下调控培养液的pH值维持在7.5，酿酒酵母的生物量为25g/L，油脂含量为45％。由此可见，该方法在厌氧条件下酿酒酵母的生物量和油脂积累量仍然可以达到很高的水平。本领域的专业人员应当知晓，在厌氧条件下，酿酒酵母油脂积累量极低，只有细胞干重的5％左右。因此，本方法在酿酒酵母的厌氧和好氧培养条件下都可极为显著地促进其油脂的积累，具有极大的有益效果。
实施例4
在不同培养阶段开始维持pH弱碱性对酿酒酵母油脂含量的影响，具体步骤如下：
在酿酒酵母培养过程中，分别在酿酒酵母的不同生长阶段为起点，通过加酸或加碱的方式，调控培养液的pH值维持在7.5，持续培养4天后用重量法测定培养液中酿酒酵母的生物量，用氯仿-甲醇法测定其油脂含量。其他培养条件为：接种量5％，即蛋白胨2％，酵母浸粉3％，葡萄糖340g/L，空气通气量0.5vvm，转速200rpm，温度36℃。其中，所述的不同培养阶段包括：迟滞期、对数生长期、稳定期以及衰亡期。
结果如图4所示，分别在酿酒酵母的不同生长阶段为起点，通过维持培养液的pH值为7.5继续培养酿酒酵母，都可以使其油脂含量达到45％左右。
实施例5
不同酿酒酵母菌株在pH弱碱性条件下的油脂含量，具体步骤如下：
在弱碱性条件下培养40株酿酒酵母菌株，这些酿酒酵母菌株皆为商用菌株，分别编号为SC1至SC40，SC1～SC6购自安琪公司，商品型号为SY葡萄酒酵母、RW葡萄酒酵母、普通型酵母、低糖型酵母、耐高糖型酵母及白酒酵母，SC7～SC17购自弗曼迪斯公司，商品型号为S-33、BE-134、S-04、US-05、BE-256、WB-06、T-58、K-97、W-34/70、S-189及S-23，SC18～SC32购自红树杰克公司，商品型号为M44、M05、M21、M76、M36、M20、M02、M29、M42、M47、M41、M54、M84、M15及M31，SC33～SC40购自拉曼公司，商品型号为温莎英式艾尔、赛森、慕尼黑、比利时修道院、钻石、西海岸BRY-97、伦敦ESD及诺丁汉。在培养过程中，通过加酸或加碱的方式，调控培养液的pH值维持在7.5，持续培养4天后用氯仿-甲醇法测定培养液中酿酒酵母的油脂含量。其他培养条件为：接种量10％，葡萄糖40g/L，酵母浸粉1％，蛋白胨2％，空气通气量1vvm，转速200rpm，温度10℃，。
结果如图5所示，通过调控培养液的pH值维持在7.5培养40株不同编号的酿酒酵母菌株，这些酿酒酵母菌株的油脂含量均可达到45％左右。由此可见，本方法对酿酒酵母菌株具有广泛适用性。
实施例6
pH弱碱性条件下酿酒酵母的脂肪酸组成，具体步骤如下：
在酿酒酵母培养过程中，通过加酸或加碱的方式，调控培养液的pH值维持在7.5，持续培养4天后用气相色谱法测定培养液中酿酒酵母油脂的脂肪酸组成。其他培养条件为：接种量5％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％，葡萄糖160g/L，空气通气量0.5vvm，转速200rpm，温度28℃。
结果如图6所示，酿酒酵母油脂的脂肪酸组成中以棕榈油酸(C16:1)为主，其占总脂肪酸的50％左右。如前文所述，棕榈油酸是一种非常稀有且昂贵的单不饱和脂肪酸，它在医药领域具有非常重要的应用价值。本发明所提供的方法可以大幅提高富含棕榈油酸的酿酒酵母油脂含量，可以解决棕榈油酸资源不足的问题，具有极大的工业化应用价值，也具有极为重要的社会效益和经济效益。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，其特征在于，包括：在酿酒酵母培养过程中，调控发酵培养液的pH值，使其维持在7.2至7.8之间。
2.如权利要求1所述的通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，其特征在于，所述酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae，是一种菌株或多种菌株的混合。
3.如权利要求1所述的通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，其特征在于，所述的培养过程包括厌氧发酵培养过程和/或好氧发酵培养过程。
4.如权利要求1所述的通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，其特征在于，在迟滞期、对数生长期、稳定期或衰亡期中任一时期，调控发酵培养液的pH值，使其维持在7.2至7.8之间。
5.如权利要求1所述的通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，其特征在于，所述培养基中含有葡萄糖40～340g/L，蛋白胨0％～5％，酵母浸粉0％～5％。
6.如权利要求1所述的通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，其特征在于，所述培养的条件为温度10～36℃，转速10～800rpm，空气通气量0.02～4vvm。
7.如权利要求1所述的通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，其特征在于，所述方法还包括培养结束时收集酿酒酵母细胞、提取油脂。
8.权利要求1-7任一项所述的方法培养的高产油酿酒酵母。
9.权利要求8所述的高产油酿酒酵母在油脂生产中的应用。
10.如权利要求8所述的高产油酿酒酵母在棕榈油酸生产中的应用。
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