CN112881570A - 一种颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素和/或齐墩果酸的检测方法 - Google Patents
一种颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素和/或齐墩果酸的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明具体涉及一种颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素或齐墩果酸的检测方法。颈痛颗粒是国内首个治疗神经根型颈椎病的国家级新药，由三七、川芎、延胡索、羌活、白芍、威灵仙、葛根七味药制成，现有检测方法缺乏对其中羌活及威灵仙中有效成分进行测定的方法。本发明提供了一种针对颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素或齐墩果酸进行检测的方法，该方法能够实现上述三种成分的良好分离效果，对于颈痛颗粒的质量控制具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素和/或齐墩果酸的检测方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
颈痛颗粒根据孙树椿教授的组方制成，是国内首个专业治疗神经根型颈椎病的国家级新药、山东省自主创新产品、国家重点新产品。该药由三七、川芎、延胡索、羌活、白芍、威灵仙、葛根七味药制成，其中三七、川芎、延胡索起到活血行气、散瘀通络的作用；羌活、威灵仙、葛根有祛风寒湿邪外出、缓解颈项强紧的功效；而白芍则着力于养血柔阴、濡养筋脉，主要功效是“活血化瘀、行气止痛”，用于神经根型颈椎病属血瘀气滞、脉络闭阻证。
发明专利《一种颈痛颗粒指纹图谱的建立方法及应用》(专利公布号CN111999423A)公布了一种颈痛颗粒指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。针对颈痛颗粒作为一种中药复方制剂，由7味处方药材组成、成分复杂多样、且尚未完全明确等特点，通过研究试验，进一步对颈痛颗粒中特征性成分有效分离，使其形成特征峰多且能够有效表征颈痛颗粒制剂质量的指纹图谱，但未对其中有效成分进行含量测定。
2020年版《中华人民共和国药典》(一部)仅采用薄层色谱法结合对照品延胡索乙素、紫花前胡苷、芍药苷等和对照药材川芎对颈痛颗粒进行鉴别，或采用高效液相色谱法测定人参皂苷Rg 1、人参皂苷Rb 1和三七皂苷R1的含量，质控指标单一，不能全面反映中药方剂多成分、多靶点的特点。
发明专利《一种治疗神经根型颈椎病的中药制剂的检测方法》(专利公布号CN105929080B)公开了一种治疗神经根型颈椎病的中药制剂的含量检测方法。该方法通过高效液相色谱法进行测定，包括川芎的含量测定、白芍的含量测定、葛根的含量测定，但未对羌活和威灵仙进行含量控制。
发明专利《一种羌活配方颗粒及制备方法和质量控制方法》(专利公布号CN101474224)公开了一种羌活配方颗粒及其制备方法和质量控制方法，采用红外指纹图谱进行质量鉴别，无含量测定。
综上所述，现有技术中无能够准确测定颈痛颗粒中羌活、威灵仙成分含量的方法。
发明内容
针对上述研究背景，本发明目的在于提供一种针对颈痛颗粒中主要活性成分进行测定的方法，用于实现对颈痛颗粒质量的控制作用。本发明选择羌活醇、异欧前胡素及齐墩果酸作为检测目标，并针对上述物质提供了一种稳定可靠的检测方法。
基于上述技术目的，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的检测方法，所述检测方法包括样品前处理及检测过程；所述样品前处理采用固相萃取方法制备待测样品，所述检测通过高效液相进行梯度洗脱分离待测样品，所述梯度洗脱程序如下：
0～15min，56％A→56％A；15～29min，56％A→10％A；29～39min，10％A→10％A；39～39.1min，10％A→56％A；39.1～55min，56％A→56％A。
发明人研究团队针对颈痛颗粒以往的研究中，尚未对其中的羌活和威灵仙的含量测定方法进行研究。由于中药组方作用的发挥需要多组分共同实现，因此针对颈痛颗粒产品中羌活、威灵仙的关键药效成分进行测定具有重要的意义。其中，由于羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸属于羌活、威灵仙中的代表性成分。并且，现有研究证实了，羌活醇具有镇痛、镇静和抗炎等作用，异欧前胡素具有舒张血管的效果，而齐墩果酸则具有抗炎、强心、镇静及保肝等功效。对于上述三种成分的检测也代表着颈痛颗粒中多功效成分能否共同发挥作用，对于药效的质量控制具有重要意义。
本发明研究过程中发现，齐墩果酸作为一种五环三萜类物质，其存在形式包括游离体及配糖体两种形态，导致直接采用有机试剂提取齐墩果酸的稳定性不足，不同批次经液相检测回收率差异较大。针对该技术问题，本发明在样品前处理环节中增加了固相萃取步骤，有效的克服了齐墩果酸提取率不高的现象。
另外，所述羌活醇及异欧前胡素在结构上较为相似，都具有芳香杂环酮结构。为了实现上述两种成分的良好分离效果，本发明针对洗脱程序进行了调整，与现有梯度洗脱程序不同之处在于，本发明首先升高水相的比例之后再逐渐降低，实现了上述三种成分分离度均在1.5以上。
基于该效果，本发明第二方面，提供一种颈痛颗粒的质量控制方法，所述质量控制方法包括采用第一方面所述检测方法测定待测样品中羌活醇、异欧前胡素或齐墩果酸的含量。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
本发明使用高效液相色谱法能对颈痛颗粒中的羌活、威灵仙含量测定，检测灵敏度高，方法重现性好，同时采用双波长检测控制多个有效成分的含量，大大节省了样品分析检测成本。
本发明的检测方法操作简便、快速、检测成本低、测定结果准确，重现性好、填补颈痛颗粒中对羌活和威灵仙含量控制的空白。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中针对颈痛颗粒中活性成分的检测尚缺乏有效的质量控制方法，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素或齐墩果酸的检测方法。
本发明第一方面，提供一种颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的检测方法，所述检测方法包括样品前处理及检测过程；所述样品前处理采用固相萃取方法制备待测样品，所述检测通过高效液相进行梯度洗脱分离待测样品，所述梯度洗脱程序如下：
0～15min，56％A→56％A；15～29min，56％A→10％A；29～39min，10％A→10％A；39～39.1min，10％A→56％A；39.1～55min，56％A→56％A。
优选的，所述样品前处理步骤如下：将所述颈痛颗粒溶于水中，采用乙酸乙酯作为洗脱液对颈痛颗粒水溶液进行洗脱，获得洗脱液吹干后加入甲醇溶液复溶得到所述待测样品。
进一步的，所述洗脱过程通过固相萃取装置实现。
进一步的，所述甲醇溶液的体积分数为75～85％。
上述优选的技术方案的一些实施方式中，所述样品前处理方式如下：将颈痛颗粒加入水中获得颈痛颗粒水溶液，将所述颈痛颗粒水溶液加入正压板中，以乙酸乙酯为洗脱液进行洗脱，将所述洗脱液吹干后加入少量甲醇溶液进行复溶，所述洗脱液与甲醇溶液的体积比为2～4：1。
优选的，所述高效液相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
上述优选技术方案的一种具体的实施方式中，所述色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm。
优选的，所述流动相参数如下：以乙腈为流动相A，以水为流动相B。
优选的，所述检测柱温为23～27℃；进一步的，所述柱温为24～25℃。
优选的，所述检测波长为200～320nm。
进一步的，所述羌活醇或异欧前胡素的检测波长为305～315nm；所述齐墩果酸的检测波长为200～210nm。
本发明第二方面，提供一种颈痛颗粒的质量控制方法，所述质量控制方法包括采用第一方面所述检测方法测定待测样品中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸中一种或几种的含量。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1色谱条件与系统适用性试验
1、样品前处理
精密称取1g颈痛颗粒置具塞的锥形瓶中，加入20mL去离子水，密塞，称定重量，超声30min后使固体成分充分溶解，放冷后加入少量水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。将所述续滤液加入正压板中，加入乙酸乙酯溶液进行洗脱，取3mL洗脱液吹干后加入1mL80％的甲醇溶液重新溶解，得到所述供试品。
2、高效液相检测
照中国药典2020年版通则0512高效液相色谱法测定；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为310nm(羌活醇、异欧前胡素)、205nm(齐墩果酸)。
表1
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 56 | 44 |
| 15 | 56 | 44 |
| 29 | 10 | 90 |
| 39 | 10 | 90 |
| 39.1 | 56 | 44 |
| 55 | 56 | 44 |
对照品溶液的制备：取羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸对照品适量，精密称定，置量瓶中，用甲醇溶解并稀释制成每1mL含羌活醇60μg、异欧前胡素30μg、齐墩果酸40μg的溶液，即得；
测定法：分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
3、检测方法稳定性考察
(1)系统适用性试验及阴性干扰试验
在上述色谱条件下，分别精密量取对照品溶液、供试品溶液及溶剂(80％甲醇溶液)各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，供试品色谱图中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸与其相邻色谱峰的分离度大于1.5，且溶剂无干扰。
(2)标准曲线的制备和线性关系考察
精密量取对照品贮备溶液(羌活醇600μg、异欧前胡素300μg、齐墩果酸400μg)0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.1mL、1.2mL，分别置10mL容量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀，各精密进样10μl，以峰面积(A)对对照品浓度(C)线性关系良好。
表2
分别精密量取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，各连续测定6次，记录峰面积并计算相对标准偏差。
表3
结果表明，仪器精密度良好。
(3)稳定性试验
供试品溶液制备完成后，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，于室温放置，分别于0、2、4、6、8、12、24小时测定一次，考察24小时，计算峰面积的相对标准偏差。
表4
| 时间(h) | 羌活醇 | 异欧前胡素 | 齐墩果酸 |
| 0 | 1935467 | 1156007 | 3035124 |
| 2 | 1932467 | 1162635 | 3030254 |
| 4 | 1931026 | 1156448 | 3032657 |
| 6 | 1931725 | 1155632 | 3036523 |
| 8 | 1933245 | 1152314 | 3035412 |
| 12 | 1934768 | 1151758 | 3036542 |
| 24 | 1934986 | 1151869 | 3036653 |
| RSD％ | 0.08 | 0.31 | 0.07 |
结果表明，供试品中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸在24小时内溶液稳定性良好。
(4)重复性试验
取本品，重复测定6次，计算样品中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的含量。
表5
| 序号 | 羌活醇(mg/g) | 异欧前胡素(mg/g) | 齐墩果酸(mg/g) |
| 1 | 5.38 | 3.79 | 3.12 |
| 2 | 5.4 | 3.86 | 3.25 |
| 3 | 5.35 | 3.86 | 3.25 |
| 4 | 5.55 | 3.75 | 3.26 |
| 5 | 5.46 | 3.79 | 3.29 |
| 6 | 5.47 | 3.75 | 3.32 |
| RSD％ | 1.22 | 1.20 | 1.93 |
结果表明，分析方法重复性良好。
(5)回收率试验
精密称取同一批样品6份，精密加入对照品，计算回收率。
表6
| 名称 | 回收率％ |
| 羌活醇 | 98.56-100.23 |
| 异欧前胡素 | 99.01-100.26 |
| 齐墩果酸 | 98.65-100.06 |
表明该测定方法测定结果准确。
实施例2
本实施例中，针对实施例1中所述检测作为一种颈痛颗粒质量控制方法进行说明：取颈痛颗粒3批，测定并计算羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的含量，结果如下。
表7
| 批号 | 羌活醇(mg/g) | 异欧前胡素(mg/g) | 齐墩果酸(mg/g) |
| 20101011 | 5.21 | 3.65 | 3.02 |
| 20101012 | 5.47 | 3.80 | 3.25 |
| 20101013 | 5.49 | 3.49 | 3.17 |
本发明含量测定方法能够稳定检测出颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的含量，检测灵敏度高，方法重现性好。
综上：本发明含量测定的方法通过控制颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的含量，从而控制制剂的质量。
对比例1
本实施例中，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表8中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为310nm(羌活醇、异欧前胡素)、205nm(齐墩果酸)。
表8
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 55 | 45 |
| 15 | 55 | 45 |
| 29 | 80 | 20 |
| 39 | 80 | 20 |
| 39.1 | 90 | 10 |
| 55 | 55 | 45 |
基于上述洗脱程序分离得到的样品色谱图中，所述羌活醇与异欧前胡素难以分离。本发明研究过程中，针对所述梯度洗脱程序的参数进行了研究，采用以有机相为主的流动相难以实现羌活醇与异欧前胡素的分离效果，发明人联想到，在羌活醇与异欧前胡素难以分离的样品段增大有机相中水相的比例(即实施例1所述方案)，从而实现上述两成分的分离。
对比例2
本实施例中，提供又一种颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素及齐墩果酸的检测方法，与实施例1中不同之处在于，本申请中供试品制备方法如下：取颈痛颗粒研细，取2g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入体积分数80％甲醇50mL，密塞，称定重量，振摇，超声30-45分钟，放冷，用体积分数80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
取同一批样品分别采用实施例1及对比例2中所述方法进行检测，进样量10μL，注入高效液相色谱仪测定。两样本连续测定6次，记录结果如下：
表9
回收率考察结果如下表10所示：
表10
结合表9和表10中的数据可以看出，对比例2提供的样品处理方法存在回收率低、检测稳定性较差的现象，特别是齐墩果酸的检测，对比例2中提供的样品前处理方法难以实现充分的提取效果。同样的检测条件下，实施例1中提供的样品前处理方法能够充分的将颈痛颗粒中上述三种成分进行充分提取。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括样品前处理及检测过程；所述样品前处理采用固相萃取方法制备待测样品，所述检测通过高效液相进行梯度洗脱分离待测样品，所述梯度洗脱程序如下：
0～15min，56％A→56％A；15～29min，56％A→10％A；29～39min，10％A→10％A；39～39.1min，10％A→56％A；39.1～55min，56％A→56％A。
优选的，所述样品前处理步骤如下：将所述颈痛颗粒溶于水中，采用乙酸乙酯作为洗脱液对颈痛颗粒水溶液进行洗脱，获得洗脱液吹干后加入甲醇溶液复溶得到所述待测样品。
2.如权利要求1所述颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的检测方法，其特征在于，所述检测方法中，所述样品前处理步骤如下：将所述颈痛颗粒溶于水中，采用乙酸乙酯作为洗脱液对颈痛颗粒水溶液进行洗脱，获得洗脱液吹干后加入甲醇溶液复溶得到所述待测样品。
3.如权利要求2所述颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的检测方法，其特征在于，所述洗脱过程通过固相萃取装置实现；
或，所述甲醇溶液的体积分数为75～85％；
优选的，所述样品前处理方式如下：将颈痛颗粒加入水中获得颈痛颗粒水溶液，将所述颈痛颗粒水溶液加入正压板中，以乙酸乙酯为洗脱液进行洗脱，将所述洗脱液吹干后加入少量甲醇溶液进行复溶，所述洗脱液与甲醇溶液的体积比为2～4：1。
4.如权利要求1所述颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
5.如权利要求4所述颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的检测方法，其特征在于，所述色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm。
6.如权利要求1所述颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的检测方法，其特征在于，所述流动相参数如下：以乙腈为流动相A，以水为流动相B。
7.如权利要求1所述颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的检测方法，其特征在于，所述检测柱温为23～27℃；进一步的，所述柱温为24～25℃。
8.如权利要求1所述颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的检测方法，其特征在于，所述检测波长为200～320nm。
9.如权利要求8所述颈痛颗粒中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸的检测方法，其特征在于，所述羌活醇或异欧前胡素的检测波长为305～315nm；所述齐墩果酸的检测波长为200～210nm。
10.一种颈痛颗粒的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法包括采用权利要求1-9任一项所述检测方法测定待测样品中羌活醇、异欧前胡素、齐墩果酸中一种或几种的含量。
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