CN111679012B - 一种丹参提取液及其组合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高效液相色谱或、和薄层色谱的分析方法。包括如下步骤：标准样品的制备；目标样品的制备；或、和通过薄层色谱分析标准样品；通过薄层色谱分析目标样品；或、和通过高效液色谱分析标准样品；通过高效液色谱分析目标样品。本发明公开了两种色谱单独、或、联合用于化学工艺过程检测，目标样品包括有机酸及其衍生物、含氮杂环化合物及其衍生物。

Description

一种丹参提取液及其组合物的制备方法

技术领域

本发明属于化学分析领域，本发明具体涉及高效液相色谱或、和薄层色谱的分析方法。

背景技术

为了调控化学制品的质量，新的技术手段不断得到应用，例如薄层色谱、高效液相色谱，往往通过薄层色谱进行定性、再通过高效液相色谱予以定量。

薄层色谱法是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值(Rf)与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值(Rf)作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。

高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

《安徽中医学院学报》(2010-02-01)发表了《木瓜中有机酸和鞣质类成分的薄层色谱鉴别》(江茶龙，谢晓梅，张玲，吕美红，侴桂新)，其中记载：采用硅胶G板和聚酰胺薄膜分离鉴别木瓜中有机酸和鞣质成分。两种薄层色谱方法均能检出木瓜的有机酸以及鞣质类组分群,其中有机酸类成分的鉴别更具有应用意义。

《时珍国医国药》(2008-04-20)发表了《黄金咽喉片中挥发油及有机酸的同板薄层色谱鉴别》(何兵、冯文宇、田吉、李春红、艾洪兵)：在薄层层析色谱中均能检出青蒿油、薄荷脑、绿原酸、没食子酸和甘草酸。结论薄层色谱法简便、快速,专属性强,重复性好。

《陕西中医》(2011-03-5)发表了《降糖胶囊薄层鉴别研究》(林玉红、杨娟英、谢伟)，其中记载：采用TLC法对处方中黄芪、西洋参、山茱萸、葛根、川芎和大黄进行了定性鉴别。结果:降糖胶囊中黄芪、西洋参、山茱萸、葛根、川芎和大黄的薄层色谱上具有鉴别特征,色谱斑点清晰可见,阴性对照无干扰。

《陕西中医》(2013-09-5)发表了《安神胶囊的薄层色谱鉴别》(张晓红、王月茹、谢伟)，其中记载：采用TLC法对处方中灵芝、没药、墨旱莲、柴胡进行了定性鉴别。结果:安神胶囊中灵芝、没药、墨旱莲、柴胡的薄层色谱上具有鉴别特征,色谱斑点清晰可见,阴性对照无干扰。

《安徽医药》(2016-07-05)发表了《层色谱法鉴别“复方甲亢片”中的甲巯咪唑》(朱田密)，其中记载：采用薄层色谱法,将供试品用浓氨试液润湿,用乙酸乙酯提取,经硅胶GF254薄层层析,在紫外光灯254nm下观察以及用稀碘化铋钾试液显色,与甲巯咪唑对照品色谱对照。结果复方甲亢片色谱中甲巯咪唑斑点清晰,阴性无干扰。

《中国中药杂志》(2015-03-05)发表了《白芷中3个主要活性成分含量测定及其质量评价研究》(史洋、雷云、许海玉、等)，其中记载：采用高效液相色谱(HPLC)的方法,同时测定白芷药材中的白当归素、欧前胡素和异欧前胡素等3个指标成分的含量。

《中国实验方剂学杂志》(2013-06-20)发表了《丹参总酚酸在大鼠血浆中的药动学研究》(王小平、刘峰、杨东花、等)，其中记载：采用血药浓度法，HPLC法测定大鼠ig丹参总酚酸后不同时间点的血药浓度,DAS3.0软件计算药动学参数。HPLC选择性好,灵敏度高, 适用于血浆样品成分含量的测定,为进一步的复方药代动力学的研究奠定了基础。

《陕西中医》(2011-03-5)发表了《参梅健胃胶囊质量标准研究》(杨娟英、林玉红、谢伟)，其中记载：采用TLC法对处方中吴茱萸、黄连、荜澄茄、白术和肉桂进行了定性鉴别,采用RP-HPLC法测定了制剂中芍药苷的含量。

200510124510.0涉及一种用于治疗冠心病、心绞痛的中药胶囊剂及其质量控制方法。该胶囊剂的质量控制方法包括:丹参、丁香、冰片、广枣的薄层鉴别,气相色谱法测定冰片的含量,高效液相色谱法测定丹参的含量。

201310077615.X涉及一种脑心通胶囊的含量检测方法。采用超高效液相色谱(UPLC)技术同时测定脑心通胶囊中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、藁本内酯5个主要化学成分，可在24min内完成一次色谱分析，各主要成分色谱峰之间有良好的分离度，精密度、重复性的RSD均小于2.0％，可较全面地控制脑心通胶囊的质量。

发明内容

一种高效液相色谱或、和薄层色谱的分析应用，包括如下步骤：标准样品的制备；目标样品的制备；或、和通过薄层色谱分析标准样品；通过薄层色谱分析目标样品；或、和通过高效液色谱分析标准样品；通过高效液色谱分析目标样品。

一种高效液相色谱或、和薄层色谱的分析应用，两种色谱联合用于化学工艺过程检测，标准样品的制备；目标样品的制备；或、和通过薄层色谱分析标准样品；或、和通过薄层色谱分析目标样品；通过高效液色谱分析标准样品；或、和通过高效液色谱分析目标样品；以及组合。

一种高效液相色谱或、和薄层色谱的分析应用，目标样品包括有机酸及其衍生物、含氮杂环化合物及其衍生物。

一种高效液相色谱或、和薄层色谱的分析应用，两种色谱单独、或、联合用于化学工艺过程检测，目标样品包括有机酸及其衍生物、含氮杂环化合物及其衍生物。

有机酸优选：丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B，

含氮杂环化合物优选六元含氮杂环化合物，

含氮杂环化合物优选吩嗪类化合物、哒嗪类化合物、吡嗪类化合物、哌嗪类化合物。

含氮杂环化合物优选维生素B1、维生素B6、盐酸川芎嗪。

一种化学工艺及其过程检测：目标样品包括有机酸及其衍生物、含氮杂环化合物及其衍生物。

一种化学工艺及其过程检测：目标样品包括有机酸及其衍生物、含氮杂环化合物及其衍生物、有关物质。

有机酸及其衍生物、含氮杂环化合物、有关物质的含量及其分析，通过物理、化学的方法来检测；通过高效液相色谱和薄层色谱的分析来实现。

本发明的优选的高效液相色谱仪方法如下：

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.2％冰醋酸溶液(15:85)为流动相，检测波长为280nm。理论板数在丹参素峰计算不低于1500。

测定法：精密称取丹参素对照品，加75％甲醇溶液并稀释至刻度，制成每1ml约含丹参素钠90ug的溶液(1mg丹参素钠相当于0.90mg丹参素)，作为对照品溶液。精密量取丹参提取液1ml至100ml容量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密量取对照品与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。即得。

标准：丹参提取液每1ml含丹参素量，不得少于7.0mg。

对于高效液相色谱无法检测或难检测的丹参提取液中的物质，本发明优选了薄层色谱来分析。

本发明的目标样品的制备工艺包括：用酸、碱调控PH、从而提高活性物质的含量。

本发明的目标样品包括：生物材料粗溶液、生物材料溶液、生物材料和含氮杂环化合物的溶液。

本发明涉及一种生物材料和含氮杂环化合物的混合溶液的制备，可选择性的采用本发明的分析方法：其具体步骤如下：

第一步：生物材料粗溶液的制备：

将生物材料用重量比8～10的水提取两次，所得水提液进行浓缩，浓缩至生物材料量的5－6倍量体积；

加入氢氧化钙混悬液，调节pH值至9.5-10.0，稳定后静置1小时，加入硫酸溶液调节pH值至5.0-5.5，稳定后静置8小时以上，固液分离，清液浓缩至相对密度1.15-1.20；

第一次醇沉：往浓缩液中加入乙醇，使含醇量至60％-65％，冷藏，静置12小时以上，固液分离，清液浓缩至相对密度1.15-1.20；

第二次醇沉：往第一次醇沉的浓缩液中加入乙醇，使含醇量至70％-75％，冷藏，静置 12小时以上，固液分离，清液浓缩至相对密度1.10-1.15；

加水溶解：往第二次醇沉的浓缩液中加入浓缩液10～20倍量体积水，煮沸溶解，降温至1-5℃，静置12小时以上，固液分离，清液浓缩至相对密度1.05－1.10；

将加水溶解的清液浓缩液转移降温至1-5℃，静置1小时以上，固液分离，清液即为生物材料粗溶液；

第二步：生物材料溶液的制备：

将生物粗材料溶液用盐酸溶液，调pH值至2.0-2.5，静置1小时以上，固液分离，得清液；

清液用氢氧化钠溶液，调pH值至9.0-9.5，煮沸溶解60分钟，冷却至50-60℃；

用盐酸溶液调pH值至5.0-5.5；加热升温到115至117℃，进行热处理30分钟以上，冷却降温至2-5℃；

用盐酸溶液，调pH值至2.0-2.5，静置1小时以上，固液分离，得清液；

清液用10％氢氧化钠溶液，调pH值至5.0-5.5；

加入此时溶液体积0.4％的活性炭，煮沸30分钟，将温度降至50-60℃，固液分离，得生物材料溶液。

第三步：生物材料和含氮杂环化合物的混合溶液的制备：

取葡萄糖用注射用水加热溶解，滤过，滤液与含氮杂环化合物、甘油、上述生物材料溶液混合均匀，调pH值，加入注射用水，使得药液密度为1.022g/cm³，即得生物材料和含氮杂环化合物的混合溶液，

上述滤液中还可以加入金属离子络合剂和抗氧化剂溶解混合均匀。

本发明涉及一种生物材料和含氮杂环化合物的混合溶液的制备，可选择性的采用本发明的分析方法：其具体步骤如下：

第一步：生物材料粗溶液的制备：

将生物材料用重量比8～10的水提取两次，将所得水提液进行浓缩，浓缩至生物材料量的5－6倍量体积；

将浓缩液冷却至40-45℃，在搅拌下缓慢加入氢氧化钙溶液，调节pH值至9.5-10.0，继续搅拌30-40分钟，静置1小时，在搅拌下缓慢加入硫酸溶液调节pH值至5.0-5.5，继续搅拌30-40分钟，静置8小时以上。固液分离，清液浓缩至相对密度1.15-1.20；

第一次醇沉：往浓缩液中加入乙醇，使含醇量至60％-65％，继续搅拌30-40分钟，冷藏，静置12小时以上，固液分离，清液浓缩至相对密度1.15-1.20；

第二次醇沉：往第一次醇沉的浓缩液中加入乙醇，使含醇量至70％-75％，继续搅拌 30-40分钟，冷藏，静置12小时以上。固液分离，清液浓缩至相对密度1.10-1.15；

加水溶解：往第二次醇沉的浓缩液中加注射用水，配制成每1ml含生物材料0.4g的药液，煮沸溶解20-30分钟，降温至1-5℃，静置12小时以上，固液分离，清液浓缩至相对密度1.05－1.10；

将加水溶解的清液浓缩液转移降温至1-5℃，搅拌15-20分钟，静置1小时以上，固液分离，清液即为生物材料粗溶液；

第二步：生物材料溶液的制备：

将生物材料粗溶液用盐酸溶液，调pH值至2.0-2.5，静置1小时以上，固液分离，得清液；

清液用10％氢氧化钠溶液，调pH值至9.0-9.5，煮沸溶解60分钟，冷却至50-60℃；

用盐酸溶液调pH值至5.0-5.5，加热升温到115至117℃，进行热处理30分钟以上，冷却降温至2-5℃；

用盐酸溶液，调pH值至2.0-2.5，静置1小时以上，固液分离，得清液；

清液用10％氢氧化钠溶液，调pH值至5.0-5.5；

加入此时溶液体积0.4％的活性炭，煮沸30分钟，将温度降至50-60℃，固液分离，得清液；

清液降温至2-5℃，密封，冷藏备用，得到生物材料溶液；

第三步：生物材料和含氮杂环化合物的混合溶液的制备：

将葡萄糖加入注射用水中，搅拌溶解，用盐酸调节溶液pH值至3.8-4.0；加入活性炭，搅拌煮沸15-18分钟，药液降温至50-60℃，固液分离；

往活性炭脱色后的溶液中补加一定量的经过滤后的注射用水，依次加入甘油、无菌生物材料溶液、金属离子络合剂、抗氧化剂、含氮杂环化合物、搅拌，使之溶解混匀。

本发明的生物材料优选为：迷迭香、丹参、鼠尾草；

本发明的有机酸及其衍生物选为：丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B；

本发明的含氮杂环化合物选为：维生素B1、维生素B6、盐酸川芎嗪；

本发明的金属离子络合剂选为：依地酸二钠；

本发明的抗氧化剂优选为：亚硫酸氢钠、维生素E、维生素C。

实验例1

本发明提供一种高效液相色谱的分析方法：基于质量源于设计的理念，建立设计空间，优化的本发明的有机酸及其衍生物(丹参素)的分析方法分别如下：

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.2％冰醋酸溶液(15:85)为流动相，检测波长为280nm。理论板数在丹参素峰计算不低于1500。

测定法：精密称取丹参素对照品，加75％甲醇溶液并稀释至刻度，制成每1ml约含丹参素钠90ug的溶液(1mg丹参素钠相当于0.90mg丹参素)，作为对照品溶液。精密量取丹参提取液1ml至100ml容量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密量取对照品与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。即得。

标准：丹参提取液每1ml含丹参素量，不得少于7.0mg。

检测结果：

针对3批丹参提取液在石硫法处理、醇沉、加水溶解、调pH值及精制工序，分别取样进行丹参素含量的测定。含量结果如下表1(单位mg/ml)：

表1本发明丹参提取过程相关节点丹参素含量测定结果(单位mg/ml)

实验例2：生物材料(丹参)溶液的工艺优选

实验例2.1：本发明“石硫法”的工艺参数的优化

本发明“石硫法”工艺：将浓缩液冷却至40-45℃，在搅拌下缓慢加入20％的氢氧化钙混悬液，调节pH值至9.5-10.0，继续搅拌30-40分钟，静置1小时。在搅拌下缓慢加入 20％硫酸溶液调节pH值至5.0-5.5，继续搅拌30-40分钟，静置8小时以上。抽取上清液浓缩至相对密度1.15-1.20。

对比文件1“201710211759.8”的“石硫法”工艺：滤液浓缩至相对密度1.03，加入20％石灰液调节pH值11，静置1小时，加入20％硫酸溶液调节pH值5.0，静置24小时，离心，收集离心上清液，加热浓缩至相对密度1.20。

实验例2.2：本发明“两次醇沉”的工艺参数的优化

本发明的第一次醇沉：将浓缩液降温至40-45℃,搅拌下加入约浓缩液体积2倍量的95％以上乙醇，使含醇量至60％-65％(加醇时间控制在0.5-1小时，实际加醇体积控制在理论加醇量的±10L以内)，继续搅拌30-40分钟，降温至0-5℃，静置12小时以上，抽取上清液回收乙醇，浓缩至相对密度1.15-1.20。

本发明的第二次醇沉：将一次醇沉的浓缩液降温至40-45℃,搅拌下加入约浓缩液体积 3.5倍量的95％以上乙醇，使含醇量至70％-75％(加醇时间控制在0.5-1小时，实际加醇体积控制在理论加醇量的±5L以内)，继续搅拌30-40分钟，降温至0-5℃，静置12小时以上。抽取上清液进行乙醇回收，浓缩至相对密度1.10-1.15。

对比文件1的第一次醇沉：浓缩液加乙醇使含醇量达55％，搅拌15分钟后冷藏静置24 小时，醇沉液过滤后加热浓缩至相对密度1.15，继续加乙醇使含醇量达65％，搅拌15分钟后冷藏静置24小时；

对比文件1的第二次醇沉：继续加乙醇使含醇量达65～75％，搅拌15～25分钟后冷藏静置24小时；

实验例2.3：加水溶解

本发明：往第二次醇沉的浓缩液中加入浓缩液10倍量体积水。煮沸溶解20-30分钟，降温至1-5℃，静置12小时以上。药液用装有2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤，浓缩至相对密度1.05－1.10。

将浓缩液转移至洁区醇沉罐内，降温至1-5℃，搅拌15-20分钟，静置1小时以上，用装有2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤，使成为澄明液体，输送至收膏罐内，得生物材料粗溶液。

对比文件1：二次醇沉液过滤后加热浓缩至相对密度1.05，加入浓缩液10倍量体积水，搅拌15～25分钟冷藏静置24小时，水沉液过滤。

实验例2.4：本发明生物材料溶液“pH值调整”的工艺参数的优化

本发明：将生物材料粗溶液用10％盐酸溶液，调pH值至2.0-2.5，静置1小时以上，经 2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤；

用10％氢氧化钠溶液，调pH值至9.0-9.5，煮沸溶解60分钟，冷却至50-60℃。

用10％盐酸溶液调pH值至5.0-5.5；加热升温到115至117℃，进行热处理30分钟(热处理加热时间不超过70分钟)，冷却降温至2-5℃；

用10％盐酸溶液，调pH值至2.0-2.5，静置1小时以上，经2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤；

用10％氢氧化钠溶液，调pH值至5.0-5.5，即得生物材料溶液。

对比文件1的“pH值调整”的工艺

过滤液用10％盐酸溶液调节pH值2，静置1小时，过滤，滤液用10％氢氧化钠溶液调节 pH值8，得到碱性提取液；

取碱性提取液在60度条件下加热水解30min后，得到水解后溶液，水解后溶液用10％盐酸溶液调节pH值至4.5。

通过小试对比实验，本发明与对比文件1丹参提取液工艺的各道工序，分别取样进行丹参素含量的测定。含量对比结果如下表2：

表2本发明与对比文献1丹参提取过程相关节点丹参素含量对比结果

结论：本发明所制备得到的丹参提取液中丹参素含量明显高于对比文献1所制备得到的丹参提取液中丹参素含量。

实验例2.5本发明的“成品”的优选过程1

向稀配罐中补加经过滤后的注射用水至约总配制量的80％，加入生物材料溶液、甘油、依地酸二钠、亚硫酸氢钠、盐酸川芎嗪、搅拌至少3分钟，使之溶解混匀。

实验例2.6本发明的“成品”的优选过程2

向稀配罐中补加经过滤后的注射用水至约总配制量的80％，加入生物材料溶液、甘油、依地酸二钠、亚硫酸氢钠、维生素B1、搅拌至少3分钟，使之溶解混匀。

实验例2.7本发明的“成品”的优选过程3

向稀配罐中补加经过滤后的注射用水至约总配制量的80％，加入生物材料溶液、甘油、依地酸二钠、亚硫酸氢钠、维生素B6、搅拌至少3分钟，使之溶解混匀。

实验例2.8本发明的“成品”的优选过程4

向稀配罐中补加经过滤后的注射用水至约总配制量的80％，加入生物材料溶液、甘油、搅拌至少3分钟，使之溶解混匀。

具体实施方式：

实施例1：

丹参素的高效液相的优选过程

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.2％冰醋酸溶液(15:85)为流动相，检测波长为280nm。理论板数在丹参素峰计算不低于1500。

测定法：精密称取丹参素对照品，加75％甲醇溶液并稀释至刻度，制成每1ml约含丹参素钠90ug的溶液(1mg丹参素钠相当于0.90mg丹参素)，作为对照品溶液。精密量取丹参提取液1ml至100ml容量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密量取对照品与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。即得。

实施例2：

丹参提取液生产工艺过程

提取(水提)：将丹参药材加水提取两次，第一次加入药材量10倍的纯化水，加热至98-105℃，加热过程循环两次，每次循环至少5分钟，直至温度不再明显下降，保沸提取2 小时；第二次加药材量8倍的纯化水，加热至98-105℃，保沸提取1.5小时。将过滤后的水提液进行浓缩，浓缩至药材量的5－6倍量体积；

可选择步骤，优选的丹参素的检测方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇- 0.2％冰醋酸溶液(15：85)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按丹参素峰计算不低于 1500。测定法精密量取本品适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含丹参素80μg的溶液，作为供试品溶液；另取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含丹参素钠90μg的溶液(1mg丹参素钠相当于0.90mg丹参素)，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。供试品溶液为浓缩液。

石硫法处理：将浓缩液冷却至40-45℃，在搅拌下缓慢加入20％的氢氧化钙混悬液，调节pH值至9.5-10.0(25±2℃测)，继续搅拌30-40分钟，静置1小时。在搅拌下缓慢加入20％硫酸溶液调节pH值至5.0-5.5(25±2℃测)，继续搅拌30-40分钟，静置8小时以上。抽取上清液浓缩至相对密度1.15-1.20(50±2℃测)。

可选择步骤，优选的丹参素的检测方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇- 0.2％冰醋酸溶液(15：85)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按丹参素峰计算不低于 1500。测定法精密量取本品适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含丹参素80μg的溶液，作为供试品溶液；另取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含丹参素钠90μg的溶液(1mg丹参素钠相当于0.90mg丹参素)，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。供试品溶液为浓缩液。

醇沉：

一次醇沉：将石硫法处理后的浓缩液降温至40-45℃,搅拌下加入约浓缩液体积2倍量的 95％以上乙醇，使含醇量至60％-65％(加醇时间控制在0.5-1小时，实际加醇体积控制在理论加醇量的±10L以内)，继续搅拌30-40分钟，降温至0-5℃，静置12小时以上，抽取上清液回收乙醇，浓缩至相对密度1.15-1.20(50±2℃测)。

二次醇沉：将一次醇沉的浓缩液降温至40-45℃,搅拌下加入约浓缩液体积3.5倍量的95％以上乙醇，使含醇量至70％-75％(加醇时间控制在0.5-1小时，实际加醇体积控制在理论加醇量的±5L以内)，继续搅拌30-40分钟，降温至0-5℃，静置12小时以上。抽取上清液进行乙醇回收，浓缩至相对密度1.10-1.15(50±2℃测)。

可选择步骤，优选的丹参素的检测方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇- 0.2％冰醋酸溶液(15：85)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按丹参素峰计算不低于 1500。测定法精密量取本品适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含丹参素80μg的溶液，作为供试品溶液；另取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含丹参素钠90μg的溶液(1mg丹参素钠相当于0.90mg丹参素)，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。供试品溶液为浓缩液。

加水溶解：往第二次醇沉的浓缩液中加入浓缩液15倍量体积水。煮沸溶解20-30分钟，降温至1-5℃，静置12小时以上。药液用装有2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤，浓缩至相对密度1.05－1.10(50±2℃测)。

将浓缩液转移至洁区醇沉罐内，降温至1-5℃，搅拌15-20分钟，静置1小时以上，用装有2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤，使成为澄明液体，输送至收膏罐内。

调pH值、精制:

用10％盐酸溶液，调pH值至2.0-2.5(25±2℃测)，静置1小时以上，经2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤。

用10％氢氧化钠溶液，调pH值至9.0-9.5(25±2℃测)，煮沸溶解60分钟，冷却至50-60℃。

用10％盐酸溶液调pH值至5.0-5.5(25±2℃测)；加热升温到115至115+2℃，进行热处理30分钟(热处理加热时间不超过70分钟)，冷却降温至2-5℃；

用10％盐酸溶液，调pH值至2.0-2.5(25±2℃测)，静置1小时以上，经2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤；

用10％氢氧化钠溶液，调pH值至5.0-5.5(25±2℃测)。

加入此时药液体积0.4％的针用活性炭，煮沸30分钟，将温度降至50-60℃，经2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤。

将药液降温至2-5℃，分装至周转桶称量密封后，转入冷库内0-5℃条件下储存,备用。

可选择步骤，优选的丹参素的检测方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇- 0.2％冰醋酸溶液(15：85)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按丹参素峰计算不低于 1500。测定法精密量取本品适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含丹参素80μg的溶液，作为供试品溶液；另取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含丹参素钠90μg的溶液(1mg丹参素钠相当于0.90mg丹参素)，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。供试品溶液为备用液。

实施例3：

组合物产品1生产工艺过程

组合物产品的原料组成：丹参100g、盐酸川芎嗪1.00g、葡萄糖50g、甘油10ml、其他辅料适量、注射用水1000ml。

将葡萄糖加入约总配制量50％的注射用水中，搅拌至少3分钟使之溶解，用稀盐酸调节药液pH值至3.8-4.0；加入总配制体积0.3‰的针用活性炭，搅拌煮沸15-18分钟，药液降温至50-60℃，经钛棒脱炭过滤至稀配罐中。

向稀配罐中补加经过滤后的注射用水至约总配制量的80％，加入处方中的甘油、丹参提取液、依地酸二钠、亚硫酸氢钠、盐酸川芎嗪，搅拌至少3分钟，使之溶解混匀。补加经过滤的注射用水至约配制量，用枸橼酸钠溶液调节pH值至5.0-5.4，定容(采用称重模块进行称重，所定容的总重量根据所要配制药液的总体积与药液的密度进行计算：药液总重量＝药液总体积×药液密度；药液密度为1.022g/cm3)，搅拌至少5分钟，取样，得到。

可选择步骤，优选的，1ml丹参提取液含0.1-0.8g药材。

可选择步骤，优选的，1ml丹参提取液含0.4g药材。

可选择步骤，优选的丹参素的检测方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇- 0.2％冰醋酸溶液(15：85)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按丹参素峰计算不低于 1500。测定法精密量取本品适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含丹参素80μg的溶液，作为供试品溶液；另取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含丹参素钠90μg的溶液(1mg丹参素钠相当于0.90mg丹参素)，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

实施例4：

组合物产品2生产工艺过程

组合物产品的原料组成优选为：丹参提取液、盐酸川芎嗪1.00g、葡萄糖50g、甘油10ml、其他辅料适量、注射用水1000ml。

将葡萄糖加入约总配制量50％的注射用水中，搅拌至少3分钟使之溶解，用稀盐酸调节药液pH值至3.8-4.0；加入总配制体积0.3‰的针用活性炭，搅拌煮沸15-18分钟，药液降温至50-60℃，经钛棒脱炭过滤至稀配罐中。

向稀配罐中补加经过滤后的注射用水至约总配制量的80％，加入处方中的甘油、丹参提取液、依地酸二钠、亚硫酸氢钠、盐酸川芎嗪，搅拌至少3分钟，使之溶解混匀。补加经过滤的注射用水至约配制量，用枸橼酸钠溶液调节pH值至5.0-5.4，定容(采用称重模块进行称重，所定容的总重量根据所要配制药液的总体积与药液的密度进行计算：药液总重量＝药液总体积×药液密度；药液密度为1.022g/cm3)，搅拌至少5分钟，取样，得到。

可选择步骤，优选的，1ml丹参提取液含0.1-0.8g药材。

可选择步骤，优选的，1ml丹参提取液含0.4g药材。

可选择步骤，优选的丹参素的检测方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇- 0.2％冰醋酸溶液(15：85)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按丹参素峰计算不低于 1500。测定法精密量取本品适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含丹参素80μg的溶液，作为供试品溶液；另取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含丹参素钠90μg的溶液(1mg丹参素钠相当于0.90mg丹参素)，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

实施例5：

丹参素高效液相分离条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2％冰醋酸溶液(15：85)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按丹参素峰计算不低于1500。

测定法精密量取组合物产品1适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含丹参素80μg的溶液，作为供试品溶液；

另取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含丹参素钠90μg的溶液(1mg丹参素钠相当于0.90mg丹参素)，作为对照品溶液。

精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

实施例6：

分析方法耐用性检查记录

实施例7：

分析方法线性与范围检查记录

实施例8：

分析方法重复性检查记录

Claims (3)

1.一种丹参提取液的制备方法 ，其特征在于，包括如下步骤：

提取：将丹参药材加水提取两次，第一次加入药材量10倍的纯化水，加热至98-105℃，加热过程循环两次，每次循环至少5分钟，直至温度不再明显下降，保沸提取2小时；第二次加药材量8倍的纯化水，加热至98-105℃，保沸提取1.5小时，将过滤后的水提液进行浓缩，浓缩至药材量的5－6倍量体积；

石硫法处理：将浓缩液冷却至40-45℃，在搅拌下缓慢加入20％的氢氧化钙混悬液，调节pH值至9.5-10.0，25±2℃测，继续搅拌30-40分钟，静置1小时，在搅拌下缓慢加入20％硫酸溶液调节pH值至5.0-5.5，25±2℃测，继续搅拌30-40分钟，静置8小时以上，抽取上清液浓缩至相对密度1.15-1.20，50±2℃测；

醇沉：

一次醇沉：将石硫法处理后的浓缩液降温至40-45℃,搅拌下加入约浓缩液体积2倍量的95％以上乙醇，使含醇量至60％-65％，加醇时间控制在0.5-1小时，实际加醇体积控制在理论加醇量的±10L以内，继续搅拌30-40分钟，降温至0-5℃，静置12小时以上，抽取上清液回收乙醇，浓缩至相对密度1.15-1.20，50±2℃测；

二次醇沉：将一次醇沉的浓缩液降温至40-45℃,搅拌下加入约浓缩液体积3.5倍量的95％以上乙醇，使含醇量至70％-75％，加醇时间控制在0.5-1小时，实际加醇体积控制在理论加醇量的±5L以内，继续搅拌30-40分钟，降温至0-5℃，静置12小时以上，抽取上清液进行乙醇回收，浓缩至相对密度1.10-1.15，50±2℃测；

加水溶解：往第二次醇沉的浓缩液中加入浓缩液15倍量体积水，煮沸溶解20-30分钟，降温至1-5℃，静置12小时以上，药液用装有2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤，浓缩至相对密度1.05－1.10，50±2℃测，将浓缩液转移至洁区醇沉罐内，降温至1-5℃，搅拌15-20分钟，静置1小时以上，用装有2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤，使成为澄明液体，输送至收膏罐内；

调pH值、精制：澄明液体用10％盐酸溶液，调pH值至2.0-2.5，25±2℃测，静置1小时以上，经2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤；用10％氢氧化钠溶液，调pH值至9.0-9.5，25±2℃测，煮沸溶解60分钟，冷却至50-60℃；用10％盐酸溶液调pH值至5.0-5.5，25±2℃测；加热升温到115至115+2℃，进行热处理30分钟，热处理加热时间不超过70分钟，冷却降温至2-5℃；用10％盐酸溶液，调pH值至2.0-2.5，25±2℃测，静置1小时以上，经2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤；用10％氢氧化钠溶液，调pH值至5.0-5.5，25±2℃测；加入此时药液体积0.4％的针用活性炭，煮沸30分钟，将温度降至50-60℃，经2层滤纸和1层0.22μm滤膜的板框过滤器过滤，得丹参提取液；将丹参提取液降温至2-5℃，分装至周转桶称量密封后，转入冷库内0-5℃条件下储存，备用。

2.一种含有权利要求1的丹参提取液的组合物的制备方法，其特征在于：

组合物产品的原料组成为：丹参100g、盐酸川芎嗪1.00g、葡萄糖50g、甘油10ml、其他辅料适量、注射用水1000ml；

将葡萄糖加入约总配制量50％的注射用水中，搅拌至少3分钟使之溶解，用稀盐酸调节药液pH值至3.8-4.0；加入总配制体积0.3‰的针用活性炭，搅拌煮沸15-18分钟，药液降温至50-60℃，经钛棒脱炭过滤至稀配罐中，向稀配罐中补加经过滤后的注射用水至约总配制量的80％，加入甘油、丹参提取液、依地酸二钠、亚硫酸氢钠、盐酸川芎嗪，搅拌至少3分钟，使之溶解混匀；

补加经过滤的注射用水至约配制量，用枸橼酸钠溶液调节pH值至5.0-5.4，定容，搅拌至少5分钟，取样，得到。

3.一种含有权利要求1的丹参提取液的组合物的制备方法，其特征在于：

组合物产品的原料组成为：丹参提取液、盐酸川芎嗪1.00g、葡萄糖50g、甘油10ml、其他辅料适量、注射用水1000ml；

1ml丹参提取液含0.1-0.8g药材，将葡萄糖加入约总配制量50％的注射用水中，搅拌至少3分钟使之溶解，用稀盐酸调节药液pH值至3.8-4.0；加入总配制体积0.3‰的针用活性炭，搅拌煮沸15-18分钟，药液降温至50-60℃，经钛棒脱炭过滤至稀配罐中，向稀配罐中补加经过滤后的注射用水至约总配制量的80％，加入处方中的甘油、丹参提取液、依地酸二钠、亚硫酸氢钠、盐酸川芎嗪，搅拌至少3分钟，使之溶解混匀；

补加经过滤的注射用水至约配制量，用枸橼酸钠溶液调节pH值至5.0-5.4，定容，搅拌至少5分钟，取样，得到。