CN112877222A - 一种拮抗细辛菌核病的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拮抗细辛菌核病的菌株及其应用，属于植物保护技术领域。该菌株为拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)JLAUWZQ‑2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.21465。该菌株具有高拮抗性、强专化性等优点，主要应用于拮抗细辛菌核病，包括菌液灌根、菌液浸种和菌液喷洒种苗等，能够有效抑制细辛菌核病菌的生长，防效高，且环境安全性好，具有良好的开发应用前景。

Description

一种拮抗细辛菌核病的菌株及其应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，涉及一种拮抗细辛菌核病的菌株及其应用，具体涉及一种高效防治细辛菌核病的拟康氏木霉菌JLAUWZQ-2及其应用。

背景技术

细辛(Asarum heterotropoides Fr.Schmidt Var.mandshuricum(Maxim)kitag.)为东北道地大宗中药材，是《中华人民共和国药典》收录的正品之首，以根及根茎入药，临床上常用于治疗风寒头痛、痰饮咳喘、关节疼痛、鼻塞、牙痛等；化工上常用于靶向药物、日用品、香精、杀虫剂、绿色农药等的产品开发。除药用部位外，细辛叶中含有大量肉桂酸、香豆酸等苯丙烷类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、免疫调节等作用。在细辛深度开发推动下，细辛的需求日益增长,细辛在黑、吉、辽三省种植面积超过二十万亩，既促进了农民增收和出口创汇，又对地方农业产业结构调整具有积极作用。

细辛为多年生药用植物，种植6年方可采收，由于生长周期长，导致根部病害发生严重。菌核病是细辛的主要根部病害之一，其致病菌为细辛核盘菌(Sclerotinia Asari.)，传播途径主要依靠土壤传播。细辛感染核盘菌后，先从地下部开始发病，逐渐侵染至地上部分。在发病初期，地上植株无明显变化，只是叶片由绿逐渐变为淡黄绿色，后期出现萎蔫，此时，地下根系内部组织已腐烂溃解，只存在外表皮。在生产上，植株感染菌核病严重时，可使细辛大面积枯死，重者造成绝产绝收。因此，菌核病在生产上被称为“细辛癌症”。

目前，细辛菌核病的防治仍以化学防治为主，主要采用多菌灵、代森铵等灌根或喷洒土壤表面进行杀菌或者在细辛移栽前，用多菌灵、代森铵浸泡种苗防治菌核病的发生。然而，应用化学防治虽然可以起到一定的防治效果，但直接后果是不仅使病原菌的抗药性不断增加，而且还造成农药残留和污染环境，而且化学农药还能杀死土壤中的有益微生物，不利于生态环境的保持和土壤可持续利用。因此，寻找安全、有效的生物防治措施成为目前解决细辛菌核病的迫切需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是发掘生防菌并验证其防治效果，克服现有防治菌核病技术中仅使用化学农药、污染环境和阻碍环境可持续利用等的不足，提供一种新型拮抗细辛菌核病的菌株及其应用，本发明提供的木霉菌菌株具有高拮抗性、强专化性等优点，应用该菌株生产的生物菌剂，能够有效防治土传病害。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

一种拮抗细辛菌核病的菌株，所述拮抗细辛菌核病的菌株名称为拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)JLAUWZQ-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.21465。

上述的拮抗细辛菌核病的菌株，优选的，所述拟康氏木霉JLAUWZQ-2是在细辛种植区的健康植株土壤根际分离出来的。

上述的拮抗细辛菌核病的菌株，优选的，所述细辛为北细辛。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的拮抗细辛菌核病的菌株在拮抗细辛菌核病中的应用。

上述的应用，优选的，所述应用为所述拮抗细辛菌核病的菌株在菌液灌根中的应用。

上述的应用，优选的，所述应用为所述拮抗细辛菌核病的菌株在菌液浸种中的应用。

上述的应用，优选的，所述应用为所述拮抗细辛菌核病的菌株在菌液喷洒种苗中的应用。

木霉菌(Trichoderma spp.)属于真菌门，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，木霉属，是世界上公认的植物真菌性病害生物防治菌，其优势在于对多种植物病原真菌具有广谱的抗性，木霉菌种类繁多，生防机制复杂，主要包括竞争作用、重寄生作用、抗生作用以及诱导植物产生抗性等，且不同菌株的作用机制也存在差异。申请人认为，从细辛根际土壤分离筛选获得对细辛菌核病菌具有拮抗作用的木霉菌株，对细辛菌核病的防治具有重要的意义，但目前还未见防治细辛菌核病的拮抗木霉菌报道。本发明通过分离纯化菌株的筛选、平板对峙培养测定、非挥发性物质抑制率测定、液体发酵液抑制测定的抑菌率验证，提供了一种新型拮抗细辛(优选北细辛)菌核病的木霉菌菌株，即拟康氏木霉(Trichodermakoningiopsis)JLAUWZQ-2，该木霉菌菌株具有高拮抗性、强专化性等优点，应用该菌株生产的生物菌剂，能够有效拮抗细辛菌核病，防治土传病害。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明提供了一种防治细辛菌核病的生防菌株拟康氏木霉(Trichodermakoningiopsis)JLAUWZQ-2，该木霉菌菌株生长速度快、产孢量大，平板对峙培养对细辛菌核病菌的抑制率为91.32％，非挥发性物质对细辛菌核病菌的抑制率为100％，因此，本发明提供的木霉菌菌株具有高拮抗性、强专化性等优点，应用该菌株生产的生物菌剂能够有效防治土传病害，保证农作物、蔬菜产量的稳定增长。该防治细辛菌核病的拟康氏木霉JLAUWZQ-2从土壤中来，到土壤中去防病，原生态无污染。

一种拮抗细辛菌核病的菌株，所述拮抗细辛菌核病的菌株名称为拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)JLAUWZQ-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.21465，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年1月29日。

附图说明

图1为本发明实施例1中拟康氏木霉JLAUWZQ-2在PDA培养基上的形态照片(显微镜)。

图2为本发明实施例1中拟康氏木霉JLAUWZQ-2在40×显微镜下的孢子梗、孢子形态照片。

图3为本发明实施例1中拟康氏木霉JLAUWZQ-2与Per.Ident值为100％的MH651375.1、MH651373.1序列的比较结果。

图4为本发明实施例1中拟康氏木霉JLAUWZQ-2的fRPB序列与MT118250fRPB的比较结果。

图5为本发明实施例1中拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌株对细辛核盘菌的抑制效果照片，其中，A为对照核盘菌的生长状况，B为JLAUWZQ-2菌株抑制核盘菌的效果(正面照)，C为JLAUWZQ-2菌株抑制核盘菌的效果(背面照)。

图6为本发明实施例1中拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌株非挥发性代谢物对细辛菌核病菌的抑制效果照片，其中，A为对照核盘菌的生长状况，B为非挥发性物质抑制核盘菌的效果。

图7为本发明实施例2中拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌株正丁醇提取物对细辛菌核病菌的抑制效果照片，其中，A为对照核盘菌生长状况，B为正丁醇提取抑制核盘菌的效果。

图8为本发明实施例3中拟康氏木霉JLAUWZQ-2代谢物正丁醇相中抑菌物质对核盘菌的抑菌效果照片，其中，A为对照核盘菌生长状况，B为阿维菌素抑菌效果，C为二十二烷酸抑菌效果，D为红霉素抑菌效果，E为甲基丁香酚抑菌效果，F为米诺环素抑菌效果。

图9为本发明实施例4中拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌液的灌根效果照片，其中，A为7月份菌液灌根时植株生长效果，B为菌液灌根后发病区周围植株继续生长效果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1

一种本发明的拮抗细辛菌核病的菌株，该菌株名称为拟康氏木霉(Trichodermakoningiopsis)JLAUWZQ-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.21465，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年1月29日。

如图1和图2所示，该拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)JLAUWZQ-2显示出以下形态特征：在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，呈草坪状，分生孢子均匀分布于气生菌丝上，呈颗粒状，绿色，边缘为白色气生菌丝，分生孢子直径为0.5mm～2mm，分生孢子梗上有明显主轴，宽度为2.8μm～3.5μm，分枝与主轴的夹角小于90°。

本发明采集中国吉林省通化市细辛根际土壤并于4℃保藏、分离纯化菌株、平板对峙细辛菌核病菌抑制试验、非挥发性物质抑制试验、正丁醇提取物抑菌实验，经过以上步骤的反复筛选与验证，最终选出高拮抗性、强专化性的拮抗细辛菌核病菌的木霉菌菌株-拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)JLAUWZQ-2。通过形态特征鉴定以及ITS-fRPB2双基因序列测定和分析，确定了该菌株的分类地位：木霉属(Trichoderma Pers.ex Fr.)，拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)，该鉴定结果与中国微生物菌种保藏管理委员会鉴定结果一致。该拟康氏木霉菌菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示，菌株的fRPB2序列如SEQ IDNO.2所示。

将NCBI中与拟康氏木霉JLAUWZQ-2ITS序列比对时，如图3所示，Per.Ident值为100％的MH651375.1、MH651373.1与本实验室分离的菌株序列用DNA MAN进行比对，idenity为99.73％，MH651375.1序列如SEQ ID NO.3所示，MH651373.1序列如SEQ ID NO.4所示。

将JLAUWZQ-2的fRPB序列与NCBI中其它RPB序列比对，如图4所示，结果并无100％。综合选择在NCBI BLAST比对结果中与JLAUWZQ-2fRPB per.ident和Query.cover值均最高的拟康氏木霉RPB序列MT118250.，相似度为95.22％。

本实施例中，拟康氏木霉JLAUWZQ-2主要通过以下过程筛选并验证：

(1)木霉菌的分离

采集北细辛健康植株根际土壤，将10g土样加入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至装有9mL无菌水的试管中，稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释度，分别吸取0.1mL均匀涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，每个稀释度重复3次，放入培养箱中28℃培养，48h根据菌落形态、颜色和大小选取，在平板上进行纯化，4℃保存。

(2)拮抗木霉菌的筛选和抑菌率测试

平板对峙培养法：用灭过菌的Φ5mm的打孔器打取培养4d左右的木霉菌和细辛菌核病菌饼，将细辛菌核病菌饼置于直径90mm的培养皿平板一侧，另一侧接种木霉菌菌饼，两菌饼相距4cm，并以单独细辛菌核病为对照，3个重复，于25℃恒温培养。培养5d后，采用十字交叉法分别测量处理组和对照组的病原真菌菌落直径，分别计算出培养5d后抑制率。

菌落生长直径(mm)＝菌落直径平均值－5.0mm；

菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落生长直径－处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100。

经测试，如图5所示，拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌株对细辛菌核病菌的抑制率为91.32％，抑菌作用明显。

木霉菌非挥发性代谢产物抑菌活性测定

在PDA培养基上铺上无菌双层玻璃纸，于平板中央接种木霉菌饼，待菌丝长至玻璃纸边缘时用无菌镊子移去玻璃纸，然后在平板中央接种病原菌菌丝块，以只接种菌核病菌菌饼的PDA培养基为对照，每处理设3次重复，于25℃恒温培养5d后，采用十字交叉法分别测量处理组和对照组的病原真菌菌落直径，分别计算出培养5d后抑制率。

菌落生长直径(mm)＝菌落直径平均值－5.0mm；

菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落生长直径－处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100。

如图6所示，拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌株非挥发性代谢物对细辛菌核病菌抑制率为100％，具有显著抑菌效果。

木霉菌发酵液对细辛菌核病菌的抑制效果

分别将筛选出的木霉菌菌株接种于PDB培养基中，于28℃条件下120r·min^-1振荡培养7d左右，过滤除去木霉菌丝体及孢子，即得木霉发酵液。将发酵液与PDA培养基按1∶6混匀，制成含有发酵液的固体平板。将活化后的菌核病菌菌饼接种至含发酵液的培养基中央，以含等体积无菌水的培养基为对照，每处理重复3次，于25℃恒温培养5d后，采用十字交叉法分别测量处理组和对照组的病原真菌菌落直径，分别计算出培养5d后抑制率。

菌落生长直径(mm)＝菌落直径平均值－5.0mm；

菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落生长直径－处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100。

表1拟康氏木霉JLAUWZQ-2的平板对峙、非挥发性代谢物和发酵液抑菌率

实施例2

一种本发明的拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌株正丁醇提取物(混合物)对细辛菌核病菌的抑制，包括以下步骤：将50mL拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌株发酵液，用50mL乙酸乙酯萃取3次，分离乙酸乙酯相和水相，分离出水相再用等体积的水饱和正丁醇萃取3次，分离出的正丁醇相在旋转蒸发仪上55℃蒸干，10mL甲醇溶解。取300μL甲醇溶液于培养基中，进行抑菌实验，经测定，抑菌率为100％。如图7所示，本实施例利用水-水饱和正丁醇-乙酸乙酯对JLAUWZQ-2菌株代谢产物进行分离提取后，其正丁醇相混合物对细辛菌核病菌抑制率为100％，抑菌作用显著。

实施例3

一种本发明的拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌株正丁醇提取物(单体)对细辛菌核病菌的抑制，前期过程同实施例2，得到正丁醇提取物后，对正丁醇提取物进行LC-MS分析后发现，JLAUWZQ-2中有多种抑菌活性成分，如图8所示，其成分中单体化合物阿维菌素或甲基丁香酚的浓度大于等于300μg·mL^-1时抑菌率达100％，单体化合物二十二烷酸、米诺环素或红霉素等的浓度大于等于500μg·mL^-1时抑菌率达100％，抑菌作用显著。

实施例4

一种本发明的拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌株在拮抗细辛菌核病中的应用，具体为菌液灌根，包括以下过程：

(1)将木霉菌接种于PDA培养基中，28℃下培养5d。向长满木霉菌的PDA平板中加入10mL的无菌水，用接种针将表面培养物剖下，分生孢子悬浮，获得孢子悬浮液。将孢子悬浮液接种含到察氏液体培养基的培养瓶(330mL/瓶)中，于28℃条件下120r/min振荡培养7d。用血球计数板测定发酵培养液中孢子的数量，待孢子密度达1×10⁶个mL^-1时停止发酵培养，过滤除去木霉菌丝体，即得生防菌液。

(2)将生防菌液与水1:5混合后，在细辛果初期进行灌根处理，每株病株灌根300mL，每30天灌根一次，共灌根3次，植株菌核病抑制率约为75.3％，考察JLAUWZQ-2菌株发酵液在菌核病发病植株根际周围灌根的效果，如图9所示，7-9月份进行菌液灌根，菌液灌根后，发病区周围植株继续生长，9月末自然枯萎，植株未有发病枯死现象，发酵液对细辛菌核病菌的拮抗率为75.3％，由此可知，JLAUWZQ-2菌株发酵液在菌核病发病植株根际周围灌根后，可以有效防止周围植株感染细辛菌核病，具有显著防治效果。

实施例5

一种本发明的拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌株在拮抗细辛菌核病中的应用，具体为菌液浸种，包括以下过程：

(1)将木霉菌接种于PDA培养基中，28℃下培养5d。向长满木霉菌的PDA平板中加入10mL的无菌水，用接种针将表面培养物剖下，分生孢子悬浮，获得孢子悬浮液。将孢子悬浮液接种含到察氏液体培养基的培养瓶(330mL/瓶)中，于28℃条件下120r/min振荡培养7d。用血球计数板测定发酵培养液中孢子的数量，待孢子密度达1×10⁶个mL^-1时停止发酵培养，过滤除去木霉菌丝体，即得生防菌液。

(2)将生防菌液与水1:3混合后，每kg种子采用200mL稀释液浸泡5h后直接以撒播方式播种，种苗菌核病发病率由11.4％降低至2.9％，具有显著的抑菌效果。

实施例6

一种本发明的拟康氏木霉JLAUWZQ-2菌株在拮抗细辛菌核病中的应用，具体为菌液喷洒种苗，包括以下过程：

(1)将木霉菌接种于PDA培养基中，28℃下培养5d。向长满木霉菌的PDA平板中加入10mL的无菌水，用接种针将表面培养物剖下，分生孢子悬浮，获得孢子悬浮液。将孢子悬浮液接种含到察氏液体培养基的培养瓶(330mL/瓶)中，于28℃条件下120r/min振荡培养7d。用血球计数板测定发酵培养液中孢子的数量，待孢子密度达1×10⁶个mL^-1时停止发酵培养，过滤除去木霉菌丝体，即得生防菌液。

(2)将生防菌液与水1:3混合后，种苗移栽前，每kg种苗喷洒30mL稀释液后直接移栽，菌核病发病率由11.9％降低至约为2.7％，具有显著的抑菌效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 一种拮抗细辛菌核病的菌株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 607

<212> DNA

<213> 拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis的ITS序列)

<400> 1

ttccgtaggg tgaacctgcg gagggatcat taccgagttt acaactccca aacccaatgt 60

gaaccatacc aaactgttgc ctcggcgggg tcacgccccg ggtgcgtcgc agccccggaa 120

ccaggcgccc gccggaggga ccaaccaaac tctttctgta gtcccctcgc ggacgttatt 180

tcttacagct ctgagcaaaa attcaaaatg aatcaaaact ttcaacaacg gatctcttgg 240

ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag 300

tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gcccgccagt attctggcgg gcatgcctgt 360

ccgagcgtca tttcaaccct cgaacccctc cgggggtccg gcgttgggga tcgggaaccc 420

ctaagacggg atcccggccc cgaaatacag tggcggtctc gccgcagcct ctcctgcgca 480

gtagtttgca caactcgcac cgggagcgcg gcgcgtccac gtccgtaaaa cacccaactt 540

ctgaaatgtt gacctcggat caggtaggaa tacccgctga acttaagcat atcaataagc 600

ggaggaa 607

<210> 2

<211> 1212

<212> DNA

<213> 拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis的fRPB2序列)

<400> 2

cggagagttg gaactggcgg gtcattgctg gccagttgtt ccgtggtatc atgcgcagaa 60

tgaatactga gctggcaaac tacctgagac gatgtgttga gggcaaccgc cacttcaatc 120

ttgctgttgg catcaagccc ggcacgcttt ctaacggatt gaagtactca ctcgccactg 180

gaaactgggg tgaccagaag aaggcaatga gctcgaccgc aggtgtatca caggtgctta 240

accgttacac ttttgcttct acactatctc atttgcgtcg taccaataca cccattggaa 300

gagatggtaa gctggcgaag cctcgacagc tccacaacac acactggggc ttggtgtgcc 360

cggctgagac ccctgaagga caggcttgtg gtctggtcaa gaacctgtct ctgatgtgct 420

acgtcagtgt tggatctcca tctgagcctt tgatcgagtt tatgatcaac agaggcatgg 480

aagtcgttga ggagtacgag ccactgagat atccccatgc tacaaagatc tttgtgaacg 540

gtgtctgggt tggaatccac caagatccca agcatctggt aaaccaagtt ttggatactc 600

gtcgcaaatc ctatctgcag tacgaagtct ctctgattag agaaattcga gaccaagagt 660

tcaaaatctt ctctgatgcc ggacgtgtta tgcgtcctgt cttcactgta cagcaggaag 720

atgacccgga aacgggcatc aacaagggcc acctggtttt gaccaaagac ctcgtcaata 780

gattggctaa agagcaggct gagcctcctg aagacccaag ccagaagctt ggatgggaag 840

gattgatcag ggctggtgcg gtggaatatc tcgacgccga ggaagaagaa acgtctatga 900

tttgcatgac accggaagat cttgagcttt atcgtcttca gaaggcgggt attgccacgg 960

acgaagatat aggagataat ccgaaccagc gtctgaagac caagacaaat ccaacaactc 1020

acatgtatac acattgcgag attcacccga gtatgatctt gggtatctgt gccagtatta 1080

tccctttccc cgatcacaac caggtatgtc cacccgagag gctgtccttt cccattttgc 1140

ccaaattttt ctatatccta cgtccagatc gctaactgat gctatacatc caccccgaac 1200

acctccaccc cc 1212

Claims (7)

1.一种拮抗细辛菌核病的菌株，其特征在于，所述拮抗细辛菌核病的菌株名称为拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)JLAUWZQ-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.21465。

2.根据权利要求1所述的拮抗细辛菌核病的菌株，其特征在于，所述拟康氏木霉JLAUWZQ-2是在细辛种植区的健康植株土壤根际分离出来的。

3.根据权利要求1或2所述的拮抗细辛菌核病的菌株，其特征在于，所述细辛为北细辛。

4.一种如权利要求1～3中任一项所述的拮抗细辛菌核病的菌株在拮抗细辛菌核病中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为所述拮抗细辛菌核病的菌株在菌液灌根中的应用。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为所述拮抗细辛菌核病的菌株在菌液浸种中的应用。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为所述拮抗细辛菌核病的菌株在菌液喷洒种苗中的应用。

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