CN112858248A - 一种农药残留快速检测的定量表达方法 - Google Patents

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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N21/643—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" non-biological material

Abstract

本发明公开了一种农药残留快速检测的定量表达方法，所述农药残留为有机磷、氨基甲酸酯类农药，具体步骤如下：步骤一、试样前处理制备；步骤二、空白样品荧光值测定ΔF0，空白样品反应12min荧光的变化值；步骤三、待测液荧光值测定ΔFt，待测样品反应12min荧光的变化值；步骤四、根据抑制率标定标准曲线抑制率，抑制率(％)＝[(ΔF0‑ΔFt)/ΔF0]×100；步骤五、根据待测液抑制率，推算农药残留浓度。该方法通过在荧光条件下读取农药残留的酶抑制率，不仅可以实现农药残留的定性判读，检出限也更低，配合农药对酶抑制率的曲线能够推算出农残的含量，可以定量的显示农药超标的程度，提高检测精度，计算结果可以形象的表达。

Description

一种农药残留快速检测的定量表达方法
技术领域
本发明方法涉及用于食用农产品的快速检测，属于生物技术领域，具体为一种农药残留快速检测的定量表达方法。
背景技术
现在普通的农药残留(有机磷、氨基甲酸酯类)快速检测方法通常是用可见光下酶抑制率法来表示农药残留是否超标，超过50％的为阳性，小于50％的为阴性；此种判定方式比较抽象也不能定量的显示农药超标的程度，即只能定性不能定量或半定量；此判定方式灵敏度较低，不能检测较低含量的有机磷、氨基甲酸酯类农药残留。
我们采用的胆碱酯酶可催化专一选择性的荧光探针水解，水解产物在一定波长的激发光照射下发射特定波长的荧光，在一定范围内，荧光强度值与胆碱酯酶的活性成正比。氨基甲酸酯和有机磷类农药对胆碱酯酶活性有抑制作用，酶与样品作用后，再利用荧光探针检测酶的残余活性，从而推算出农残的含量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种农药残留快速检测的定量表达方法，通过在荧光条件下读取农药残留的酶抑制率，不仅可以实现农药残留的定性判读，检出限也更低，配合农药对酶抑制率的曲线能够推算出农残的含量，可以定量的显示农药超标的程度，提高检测精度，计算结果可以形象的表达，本发明提供如下技术方案：
一种农药残留快速检测的定量表达方法，所述农药残留为有机磷、氨基甲酸酯类农药，具体步骤如下：
步骤一、试样前处理制备；
步骤二、空白样品荧光值测定ΔF0，空白样品反应12min荧光的变化值；
步骤三、待测液荧光值测定ΔFt，待测样品反应12min荧光的变化值；
步骤四、根据抑制率标定标准曲线抑制率，抑制率(％)＝[(ΔF0-ΔFt)/ΔF0]×100；
步骤五、根据抑制率与农药的浓度对数成线性关系，推算农药残留浓度。
优选的，步骤一中试样前处理制备包括固体式样或者液体式样，其中：
固体式样制备方式如下：
将谷物、水产品、茶叶、咖啡等磨碎，或蔬菜、水果的可食用部分，尽量取整块，称取0.30g放入2.0mL离心管，加入1500μL专用萃取剂D，在震荡混合器萃取10min，如萃取液浑浊，需离心分离，得到萃取清液，待测；
液体式样制备方式如下：
1)、清澈液体样品可直接检测；
2)、含固体浑浊液体样品，需先离心分离出清澈液体后，再检测；
3)、颜色较深液体样品，需先过滤等方法脱色后，再检测。
优选的，步骤二中空白样品荧光值测定ΔF0，空白样品反应12min荧光的变化值测定方法、以及步骤三中待测液荧光值测定ΔFt，待测样品反应12min荧光的变化值测定方法，包括：
a、空白测试：向2.0mL离心管加入500μL萃取剂D，再加入30μL酶剂，在25～30℃室温下，预孵反应7min；
b、向2.0mL离心管加入500μL上述前处理制备的待测萃取剂磷酸盐缓冲溶液(PH＝6～7.5)，再加入30μL酶剂，在25～30℃室温下，预孵反应5～7min；
c、取n+1个比色皿试剂盒，第一个比色皿作为空白酶活性检测，加入20～60μL(1～20mM)荧光探针溶液，震荡3min以上，使显色剂充分溶解；
d、取预孵溶液300μL，加入比色皿，在25～30℃下，震荡反应12min；
e、向比色皿加入200μL终止剂乙腈，混匀，待测。
优选的，所述荧光探针为以下化合物：
Figure BDA0002989272450000031
4-位可以是CF3，也可以是硝基、乙酰基，5-位可以是乙酰基或氢原子。
优选的，所述酶剂可以是乙酰胆碱酯酶，也可以是丁酰胆碱酯酶。
优选的，所述荧光探针的浓度为1～20mM，优选于10mM。
与现有技术相比，本发明提供了一种农药残留快速检测的定量表达方法，具备以下有益效果：
通过在荧光条件下读取农药残留的酶抑制率，不仅可以实现农药残留的定性判读，检出限也更低，配合农药对酶抑制率的曲线能够推算出农残的含量，可以定量的显示农药超标的程度，提高检测精度，计算结果可以形象的表达，例如：阳性相当于甲胺磷20ug/kg，而非目前酶抑制率法采用的阴性/阳性。
附图说明
图1为本发明一种农药残留快速检测的定量表达方法的流程图；
图2为呋喃丹对酶抑制率的曲线，线性浓度范围：0.2～2.5μg/L；
图3为灭多威酶抑制率的定量曲线，线性浓度范围：50～800μg/L。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-图3，一种农药残留快速检测的定量表达方法，所述农药残留为有机磷、氨基甲酸酯类农药，具体步骤如下：
步骤一、试样前处理制备；
步骤二、空白样品荧光值测定ΔF0，空白样品反应12min荧光的变化值；
步骤三、待测液荧光值测定ΔFt，待测样品反应12min荧光的变化值；
步骤四、根据抑制率标定标准曲线抑制率，抑制率(％)＝[(ΔF0-ΔFt)/ΔF0]×100；
步骤五、根据抑制率与农药的浓度对数成线性关系，推算农药残留浓度。
进一步的，步骤一中试样前处理制备包括固体式样或者液体式样，其中：
固体式样制备方式如下：
将谷物、水产品、茶叶、咖啡等磨碎，或蔬菜、水果的可食用部分，尽量取整块，称取0.30g放入2.0mL离心管，加入1500μL专用萃取剂D，在震荡混合器萃取10min，如萃取液浑浊，需离心分离，得到萃取清液，待测；
液体式样制备方式如下：
1)、清澈液体样品可直接检测；
2)、含固体浑浊液体样品，需先离心分离出清澈液体后，再检测；
3)、颜色较深液体样品，需先过滤等方法脱色后，再检测。
进一步的，步骤二中空白样品荧光值测定ΔF0，空白样品反应12min荧光的变化值测定方法、以及步骤三中待测液荧光值测定ΔFt，待测样品反应12min荧光的变化值测定方法，包括：
a、空白测试：向2.0mL离心管加入500μL萃取剂D，再加入30μL酶剂，在25～30℃室温下，预孵反应7min；
b、向2.0mL离心管加入500μL上述前处理制备的待测萃取剂磷酸盐缓冲溶液(PH＝6～7.5)溶液，再加入30μL酶剂，在25～30℃室温下，预孵反应5～7min；
c、取n+1个比色皿试剂盒，第一个比色皿作为空白酶活性检测，加入20～60μL(1～20mM)荧光探针溶液，震荡3min以上，使显色剂充分溶解；
d、取预孵溶液300μL，加入比色皿，在25～30℃下，震荡反应12min；
e、向比色皿加入200μL终止剂乙腈，混匀，待测。
进一步的，所述荧光探针为以下化合物：
Figure BDA0002989272450000051
4-位可以是CF3，也可以是硝基、乙酰基，5-位可以是乙酰基或氢原子。
进一步的，所述酶剂可以是乙酰胆碱酯酶，也可以是丁酰胆碱酯酶。
进一步的，所述荧光探针的浓度为1-20mM，优选于10mM。
实施例1
将谷物、水产品、茶叶、咖啡等磨碎，或蔬菜、水果的可食用部分，尽量取整块，称取0.30g放入2.0mL离心管，加入1500μL专用萃取剂D，在震荡混合器萃取10min，如萃取液浑浊，需离心分离，得到萃取清液，备用，之后向2.0mL离心管加入500μL萃取剂D，再加入30μL酶剂，在25～30℃室温下，预孵反应7min，作空白测试，之后再向2.0mL离心管加入500μL上述前处理制备的待测萃取剂磷酸盐缓冲溶液(PH＝6～7.5)，再加入30μL酶剂，在25～30℃室温下，预孵反应5～7min，取n+1个比色皿试剂盒，第一个比色皿作为空白酶活性检测，加入20～60μL(1～20mM)荧光探针溶液，震荡3min以上，使显色剂充分溶解，再取预孵溶液300μL，加入比色皿，在25～30℃下，震荡反应12min，之后向比色皿加入200μL终止剂乙腈，混匀，利用荧光探针检测酶的残余活性，根据酶的残余活性，配合呋喃丹对酶抑制率的曲线，从而推算出农残的含量。
实施例2
将谷物、水产品、茶叶、咖啡等磨碎，或蔬菜、水果的可食用部分，尽量取整块，称取0.30g放入2.0mL离心管，加入1500μL专用萃取剂D，在震荡混合器萃取10min，如萃取液浑浊，需离心分离，得到萃取清液，备用，之后向2.0mL离心管加入500μL萃取剂D，再加入30μL酶剂，在25～30℃室温下，预孵反应7min，作空白测试，之后再向2.0mL离心管加入500μL上述前处理制备的待测萃取剂磷酸盐缓冲溶液(PH＝6～7.5)，再加入30μL酶剂，在25～30℃室温下，预孵反应5～7min，取n+1个比色皿试剂盒，第一个比色皿作为空白酶活性检测，加入20～60μL(1～20mM)荧光探针溶液，震荡3min以上，使显色剂充分溶解，再取预孵溶液300μL，加入比色皿，在25～30℃下，震荡反应12min，之后向比色皿加入200μL终止剂乙腈，混匀，利用荧光探针检测酶的残余活性，根据酶的残余活性，配合灭多威酶抑制率的定量曲线，从而推算出农残的含量。
综上所述，本发明提供的一种农药残留快速检测的定量表达方法，通过在荧光条件下读取农药残留的酶抑制率，不仅可以实现农药残留的定性判读，检出限也更低，配合农药对酶抑制率的曲线能够推算出农残的含量，可以定量的显示农药超标的程度，提高检测精度，计算结果可以形象的表达，例如：阳性相当于甲胺磷20ug/kg，而非目前酶抑制率法采用的阴性/阳性。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序，而且，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制，还有，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，都应涵盖在本发明的保护范围之内，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种农药残留快速检测的定量表达方法，所述农药残留为有机磷、氨基甲酸酯类农药，其特征在于：具体步骤如下：
步骤一、试样前处理制备；
步骤二、空白样品荧光值测定ΔF0，空白样品反应12min荧光的变化值；
步骤三、待测液荧光值测定ΔFt，待测样品反应12min荧光的变化值；
步骤四、根据抑制率标定标准曲线抑制率，抑制率(％)＝[(ΔF0-ΔFt)/ΔF0]×100；
步骤五、根据抑制率与农药的浓度对数成线性关系，推算农药残留浓度。
2.根据权利要求1所述的一种农药残留快速检测的定量表达方法，其特征在于：步骤一中试样前处理制备包括固体式样或者液体式样，其中：
固体式样制备方式如下：
将谷物、水产品、茶叶、咖啡等磨碎，或蔬菜、水果的可食用部分，尽量取整块，称取0.30g放入2.0mL离心管，加入1500μL专用萃取剂D，在震荡混合器萃取10min，如萃取液浑浊，需离心分离，得到萃取清液，待测；
液体式样制备方式如下：
1)、清澈液体样品可直接检测；
2)、含固体浑浊液体样品，需先离心分离出清澈液体后，再检测；
3)、颜色较深液体样品，需先过滤等方法脱色后，再检测。
3.根据权利要求1所述的一种农药残留快速检测的定量表达方法，其特征在于：步骤二中空白样品荧光值测定ΔF0，空白样品反应12min荧光的变化值测定方法、以及步骤三中待测液荧光值测定ΔFt，待测样品反应12min荧光的变化值测定方法，包括：
a、空白测试：向2.0mL离心管加入500μL萃取剂D，再加入30μL酶剂，在25～30℃室温下，预孵反应7min；
b、向2.0mL离心管加入500μL上述前处理制备的待测萃取剂磷酸盐缓冲溶液，PH值为6～7.5，再加入30μL酶剂，在25～30℃室温下，预孵反应5～7min；
c、取n+1个比色皿试剂盒，第一个比色皿作为空白酶活性检测，加入20～60μL荧光探针溶液，震荡3min以上，使显色剂充分溶解；
d、取预孵溶液300μL，加入比色皿，在25～30℃下，震荡反应12min；
e、向比色皿加入200μL终止剂乙腈，混匀，待测。
4.根据权利要求3所述的一种农药残留快速检测的定量表达方法，其特征在于：所述荧光探针为以下化合物：
Figure FDA0002989272440000021
4-位可以是CF3，也可以是硝基、乙酰基，5-位可以是乙酰基或氢原子。
5.根据权利要求3所述的一种农药残留快速检测的定量表达方法，其特征在于：所述酶剂可以是乙酰胆碱酯酶，也可以是丁酰胆碱酯酶。
6.根据权利要求3所述的一种农药残留快速检测的定量表达方法，其特征在于：所述荧光探针的浓度为1～20mM，优选于10mM。
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