CN112852978B - 一种黄河鲤抗嗜水气单胞菌感染相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黄河鲤抗嗜水气单胞菌感染相关的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记包括Carp0366630、Carp0413293、Carp0795057、Carp1175625、Carp0745237、Carp0943001、Carp1277494和Carp1848978中的至少一种；本发明中SNP分子标记为8个，分别位于不同的染色体上，此8个SNP分子标记所在位点的所有基因型中，有4种基因型在抗病系个体中特有，有4种基因型在易感系个体中特有，借助本发明的SNP分子标记，通过PCR扩增的方法，针对SNP分子标记所在区域扩增并测序后，检测该位点的基因型，从而依据生产实际的需求来筛选出具有较强抗性的个体或者剔除抗性较弱的个体，大大缩短了抗病家系的选育时间。

Description

一种黄河鲤抗嗜水气单胞菌感染相关的SNP分子标记及其 应用
技术领域
本发明涉及黄河鲤选育技术领域，具体涉及一种黄河鲤抗嗜水气单胞菌感染相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
黄河鲤是中国黄河流域长期自然形成的特有经济鱼类，同松江鲈鱼、兴凯湖鲌鱼、松花江鲑鱼并称为我国四大名鱼，自古以来被视为食之上品，以金鳞赤尾、体态优美、肉质细嫩鲜美而驰名。近年来由于高密度集约化的养殖条件，鲤受病害的威胁越来越严重。其中，嗜水气单胞菌是影响鲤鱼产业最严重的病原菌之一，是引发出血性败血症等疾病的主要致病菌。水产养殖中治疗嗜水气单胞菌病最常用的方法是使用诺氟沙星、四环素等抗生素。但是抗生素的长期使用不仅容易使病原菌产生耐药性，而且作为一种生态系统污染源，会对环境和水产品质量安全造成严重威胁。因此，培养出自身具备较强抗病能力的个体及家系，是水产养殖可持续性健康发展的重要手段之一。
目前黄河鲤抗病家系的培育主要采用传统的选育方法，首先挑选较为壮实的个体作为父母本进行繁育，培养出来的子代通过人工感染病原菌，将存活个体留作新一代父母本进行繁育，如此反复多代来获得抗病家系。黄河鲤性成熟周期较长，一般为2-3年，所以传统的选育方法耗时很长。而且，传统方法对优良性状的选育往往具有随机性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄河鲤抗嗜水气单胞菌感染相关的SNP分子标记及其应用，本发明通过利用SNP分子标记能快速地筛选出具有较强抗病能力的黄河鲤，并用作亲本进行繁育培养出高品质的能一定程度上抵抗嗜水气单胞菌感染的家系，大大缩短抗病家系的选育时间。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种黄河鲤抗嗜水气单胞菌感染相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括Carp0366630、Carp0413293、Carp0795057、Carp1175625、Carp0745237、Carp0943001、Carp1277494和Carp1848978中的至少一种；
所述Carp0366630的物理位置位于LG9染色体的30,777,954bp，其抗病基因型为CC；
所述Carp0413293的物理位置位于LG10染色体的31,705,120bp，其抗病基因型为TC；
所述Carp0795057的物理位置位于LG20染色体的10,999,307bp，其抗病基因型为AA；
所述Carp1175625的物理位置位于LG31染色体的8,238,176bp，其抗病基因型为TT；
所述Carp0745237的物理位置位于LG18染色体的27,587,525bp，其易感基因型为CC；
所述Carp0943001的物理位置位于LG24染色体的21,135,602bp，其易感基因型为TT；
所述Carp1277494的物理位置位于LG34染色体的707,283bp，其易感基因型为TT；
所述Carp1848978的物理位置位于LG50染色体的13,748,395bp，其易感基因型为AA。
本发明第二方面提供一种上述SNP分子标记在抗嗜水气单胞菌感染的黄河鲤选育中的应用。
本发明第三方面提供一种抗嗜水气单胞菌感染的黄河鲤的选育方法，所述选育方法包括如下步骤：
(a)提取黄河鲤样本DNA；
(b)对权利要求1或2中的SNP分子标记位点进行扩增；
(c)将扩增产物进行测序，并根据SNP所在位点的序列信息获得基因型；
(d)根据获得的基因型筛选抗嗜水气单胞菌感染的黄河鲤。
在本发明中，对样本DNA的质量要求并不需要很高，即使总DNA降解厉害，对后续工作并没有影响；采集鱼鳍、血液或者其它任何鱼体组织，采用本领域常规的DNA提取试剂盒提取DNA即可。
优选地，所述步骤(b)中，不同SNP标记位点采用的扩增引物如下：
Figure BDA0002990292550000031
优选地，所述步骤(b)中，扩增体系如下：
2×Es Taq MasterMix 20μl，样本DNA 2μl，浓度为10μM的上游引物1μl，浓度为10μM的下游引物1μl，无菌水16μl。
优选地，所述步骤(b)中，PCR过程如下：
94℃4min变性，(94℃30s预热、60℃30s偶联、72℃45s延伸)×30个循环，72℃10min延伸；4℃保存。
优选地，所述步骤(d)中，根据获得的基因型筛选抗嗜水气单胞菌感染的黄河鲤具体包括：
筛选具有抗病系SNP分子标记的个体和/或剔除具有易感系SNP分子标记的个体。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明提供的一组SNP分子标记与黄河鲤抗嗜水气单胞菌感染显著相关，利用本组SNP分子标记能快速地筛选出具有较强抗病能力的黄河鲤，并用作亲本进行繁育培养出高品质的能一定程度上抵抗嗜水气单胞菌感染的家系，大大缩短抗病家系的选育时间；具体地，本发明包含了8个SNP分子标记，分别位于不同的染色体上，此8个SNP分子标记所在位点的所有基因型中，有4种基因型在抗病系个体中特有，有4种基因型在易感系个体中特有，借助本发明的SNP分子标记，通过PCR扩增的方法，针对SNP分子标记所在区域扩增并测序后，检测该位点的基因型，从而依据生产实际的需求来筛选出具有较强抗性的个体或者剔除抗性较弱的个体，大大缩短了抗病家系的选育时间。
本发明中SNP分子标记分布在不同染色体上，有效地避免了连锁不平衡，使得选育方法具有准确度高，而且操作简单，容易应用于生产实践中。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例
本实施例为一种抗嗜水气单胞菌感染的黄河鲤的选育方法，该选育方法包括如下步骤：
(a)采用DNA提取试剂盒提取黄河鲤样本DNA；
(b)对SNP分子标记位点进行扩增，具体地，不同SNP标记位点采用的扩增引物及扩增产物如下：
Figure BDA0002990292550000051
PCR体系为：2×Es Taq MasterMix 20微升，样本DNA 2微升，上游引物(浓度为10μM)1微升，下游引物(浓度为10μM)1微升，无菌水16微升。
Figure BDA0002990292550000052
(c)将扩增产物进行测序，通过检测SNP所在位点的序列信息获得基因型；
(d)根据获得的基因型筛选具有抗病系SNP分子标记的个体和剔除具有易感系SNP分子标记的个体，得到抗嗜水气单胞菌感染的黄河鲤。
实验例1
采用一批来自不同家系的6月龄的黄河鲤进行人工攻毒实验。每条鱼采用腹腔注射100微升浓度为1x107CFU/mL的嗜水气单胞菌菌液。本实验中，注射菌液后48小时内死亡的视为易感个体，整个攻毒实验结束后依然存活的视为抗病个体。总共采集了100尾鱼的样本用来提取DNA，其中66尾为易感个体，34尾为抗病个体。针对本发明的8个SNP分子标记进行PCR扩增，并检测了各位点上的特有基因型(抗病系特有基因型或者易感系特有基因型)，具体检测结果如表1所示，统计结果如表2所示：
表1
Figure BDA0002990292550000061
Figure BDA0002990292550000071
Figure BDA0002990292550000081
表2
Figure BDA0002990292550000082
由上述表1、表2数据可知，本发明SNP分子标记准确率为82％以上。
实验例2
为了验证本发明8个SNP分子标记是否与黄河鲤抗嗜水气单胞菌感染显著关联，将100尾样品的DNA分别进行了全基因组重测序，在全基因组范围内进行扫描以及发掘SNP，并且利用基因组上所有的SNP进行了全基因组关联分析。经严格的Bonferroni校正法后的分析结果如表3所示；
表3
Figure BDA0002990292550000091
由表3可知：
本发明的8个SNP分子标记全部与黄河鲤抗嗜水气单胞菌感染显著关联(P<0.05)。因此进一步验证了本发明的数据可靠性高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (5)

1.SNP分子标记在抗嗜水气单胞菌感染的黄河鲤选育中的应用；所述SNP分子标记包括Carp0366630、Carp0413293、Carp0795057、Carp1175625、Carp0745237、Carp0943001、Carp1277494和Carp1848978中的至少一种；
所述Carp0366630的物理位置位于LG9染色体的30,777,954bp，其抗病基因型为CC；
所述Carp0413293的物理位置位于LG10染色体的31,705,120bp，其抗病基因型为TC；
所述Carp0795057的物理位置位于LG20染色体的10,999,307bp，其抗病基因型为AA；
所述Carp1175625的物理位置位于LG31染色体的8,238,176bp，其抗病基因型为TT；
所述Carp0745237的物理位置位于LG18染色体的27,587,525bp，其易感基因型为CC；
所述Carp0943001的物理位置位于LG24染色体的21,135,602bp，其易感基因型为TT；
所述Carp1277494的物理位置位于LG34染色体的707,283bp，其易感基因型为TT；
所述Carp1848978的物理位置位于LG50染色体的13,748,395bp，其易感基因型为AA。
2.一种抗嗜水气单胞菌感染的黄河鲤的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)提取黄河鲤样本DNA；
(b)对权利要求1中的SNP分子标记位点进行扩增；
(c)将扩增产物进行测序，并根据SNP所在位点的序列信息获得基因型；
(d)根据获得的基因型筛选抗嗜水气单胞菌感染的黄河鲤。
3.根据权利要求2所述的选育方法，其特征在于，所述步骤(b)中，扩增体系如下：
2×Es Taq MasterMix 20μl，样本DNA 2μl，浓度为10μM的上游引物1μl，浓度为10μM的下游引物1μl，无菌水16μl。
4.根据权利要求2所述的选育方法，其特征在于，所述步骤(b)中，PCR过程如下：
94℃4min变性，(94℃30s预热、60℃30s偶联、72℃45s延伸)×30个循环，72℃10min延伸；4℃保存。
5.根据权利要求2所述的选育方法，其特征在于，所述步骤(d)中，根据获得的基因型筛选抗嗜水气单胞菌感染的黄河鲤具体包括：
筛选具有抗病系SNP分子标记的个体和/或剔除具有易感系SNP分子标记的个体。
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