CN112852839B - 编码调控胞外多糖合成的调控因子的基因及工程菌和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码调控胞外多糖合成的调控因子的基因及工程菌和应用，该调控因子能够负调控胞外多糖的合成，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示，本发明通过同源双交换的技术原理构建了高产胞外多糖的基因工程菌株，该编码调控因子的基因可用于定向改良胞外多糖生产菌株，该基因工程菌株的胞外多糖产量比野生型菌株的产量高出2倍，所产生的胞外多糖可广泛应用于食品、化工、医药、纺织、石油、化妆品等多个领域。

Description

编码调控胞外多糖合成的调控因子的基因及工程菌和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种编码调控胞外多糖合成的调控因子的基因及工程菌和应用，具体为一种编码转录调控因子的基因在定向改造胞外多糖高产菌株中的应用。

背景技术

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)是能够通过气孔或伤口侵染水稻叶片，使水稻叶片形成条斑病症的一类黄单胞菌，能够产生大量的胞外多糖(extracellular polysaccharides，EPS)，EPS分布于细胞的最外层，是由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸组成的“五糖重复单元”结构聚合体。EPS的主要成分是黄原胶(xanthan gum)，黄原胶具有良好的乳化性、增稠性、假塑性、稳定性(耐酸碱、耐高温、抗氧化、抗酶解、抗盐钙)、兼容性，可用于乳化剂、稳定剂、增稠剂、填充剂、浸润剂、膜成形剂、食品粘合剂，广泛应用于食品、化工、医药、纺织、石油、化妆品等多个领域。

我国黄原胶的生产始于20世纪80年代，尽管发展十分迅速，但是存在着生产规模小、生产工艺不成熟、产品纯度和分级水平较差等缺点。改良黄原胶生产菌株、提高黄原胶的产量和质量，是我国黄原胶生产工业面临的主要问题。由于传统的菌株选育方法需要很多的尝试，具有很多的不确定性、且费时耗力，随着基因工程育种技术的不断发展，通过基因工程技术来定向地改良黄原胶生产菌株受到了世界科研工作者的青睐。

微生物具有多种复杂的信号系统用来识别并应答外界环境的刺激，通过这些信号系统，细胞可以感受外界环境的改变，调控一些基因的表达，从而调控自身的生命活动。在微生物中有一类调控因子具有DNA-binding结构域能够与特定基因的启动子区域结合，启动或抑制某些基因的表达。因此，在黄单胞菌中有哪些转录调控因子能够调控相关EPS合成基因的表达是科研工作者一直关心并致力于解决的问题。对转录调控因子的研究，并通过基因工程等手段，可以用来定向改良菌株，为实际生产带来效益、降低成本、节约资源。目前，尚未有对于该基因的报道。

发明内容

本发明目的旨在提供一种编码调控因子的基因，通过构建该基因的缺失突变体来定向地提高胞外多糖的产量，并且本发明提供的基因工程菌株所产生的胞外多糖可以应用于食品、化工、医药、纺织、石油、化妆品等多个领域，降低生产成本、节约资源。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种编码调控胞外多糖合成的调控因子的基因XOC_gx2507，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

所述胞外多糖调控因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的另一方面，提供了一种高产胞外多糖的基因工程菌，所述的工程菌包含上述基因XOC_gx2507。

所述工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1)根据XOC_gx2507基因的DNA序列，设计引物2507_LF/LR和2507_RF/RR；

2)以水稻条斑病菌GX01菌株总DNA为模板，进行PCR扩增，酶切扩增产物和质粒pK18mobsacB并连接；

3)连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α中，提取重组质粒，转入野生型菌株XocGX01中，同源重组筛选双交换子，即得到XOC_gx2507基因的缺失突变体。

进一步的，2507_LF/LR和2507_RF/RR的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

进一步的，所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃彻底延伸5min。

在本发明的另一方面，提供了所述基因XOC_gx2507在提高胞外多糖产量中的应用，通过将水稻条斑病菌GX01中的编码转录调控因子的基因敲除，来选育高产胞外多糖的基因工程菌株。

具体的，一种胞外多糖的发酵方法，采用上述基因工程菌，将OD₆₀₀为1.0的菌液按照5％(w/v)接种量接入含有4％(w/v)蔗糖的NB培养基中，温度控制在28℃，转速200rpm，发酵周期6天。

本发明的有益效果为：

1)本发明中提供的一种编码转录调控因子的基因，是首次被发现，此前并无该基因的相关报道。

2)利用同源双交换的原理构建了编码该调控因子的基因的缺失突变体菌株，经6天的摇瓶发酵，突变体菌株的胞外多糖产量达到12.96g/L，野生型菌株Xoc GX01胞外多糖产量达到6.383g/L。XOC_gx2507基因缺失突变体菌株的胞外多糖产量比野生型菌株高2倍。

3)本发明中提供的基因工程菌株能够产生比野生型菌株高出2倍的胞外多糖，可广泛应用于食品、化工、医药、纺织、石油、化妆品等多个领域，降低生产成本、节约资源。

附图说明

图1是本发明中水稻条斑病菌GX01菌株XOC_gx2507基因的缺失突变体构建验证图；M1：GenStar 1kb DNA Ladder；M2：GenStar100bp Plus DNALadder；1：Xoc GX01总DNA为模板的外引验证，片段大小为1598bp；2：XOC_gx2507基因的缺失突变体菌株总DNA为模板的外引验证，片段大小为1015bp；3：野生型菌株Xoc GX01总DNA为模板的内引验证，片段大小为482bp；4：XOC_gx2507基因的缺失突变体菌株总DNA为模板的内引验证。

图2是本发明野生型菌株Xoc GX01和XOC_gx2507基因的缺失突变体胞外多糖的定性检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

微生物中存在一系列通过调节自身基因的表达来适应外界环境变化的机制。在基因表达的过程中有一类称为转录调控因子的蛋白质分子通过结合在特定的DNA区域，调控特定基因的表达。本发明从水稻条斑病菌GX01中的调控因子LuxR入手，从野生型菌株XocGX01筛选到7个LuxR调控因子，并最终获得一个调控胞外多糖合成的调控因子。该基因首次被发现并鉴定可以大大提高胞外多糖的合成能力。

实施例1 XOC_gx2507基因的缺失突变体菌株

基于同源双交换的方法构建XOC_gx2507基因的缺失突变体菌株，具体方法如下：

1)根据XOC_gx2507基因的DNA序列，设计引物2507_LF/LR和2507_RF/RR，2507_LF5’端添加BamHⅠ酶切位点及保护碱基CGGGATCC，2507_LR3’端添加XbaⅠ酶切位点及保护碱基GCTCTAGA，2507_RF5’端添加XbaⅠ酶切位点及保护碱基GCTCTAGA，2507_RR3’端添加HindⅢ酶切位点及保护碱基CCCAAGCTT，引物序列见序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6。以Xoc GX01菌株的总DNA为模板，进行PCR扩增。扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃彻底延伸5min。

2)纯化上一步得到的扩增产物，使用相同的限制性内切酶分别切左右臂的扩增产物和质粒pK18mobsacB，然后使用纯化试剂盒进行纯化。

3)使用T4连接酶将酶切纯化后的左右臂与自杀质粒pK18mobsacB于室温下连接4～5h或置于4℃冰箱过夜连接。

4)将连接产物进行化学转化，转入大肠杆菌感受态DH5α中，然后进行蓝白斑筛选，挑选白斑，使用2507_LF和2507_RR进行菌体PCR验证，若结果为阳性的，进一步提取重组质粒。

5)第一次同源重组：将提取好的重组质粒通过电转化实验或三亲本结合实验，转入到野生型菌株Xoc GX01中，由于自杀质粒pK18mobsacB中含有蔗糖致死基因sacB，因此要将转入重组质粒的Xoc GX01涂布到含有Rif(50μg/mL)、Kan(25μg/mL)的NA平板上，放置在28℃培养箱中培养5天左右。

6)筛选单交换子：使用的是含有Rif(50μg/mL)、Kan(25μg/mL)的NA平板以及含有Rif(50μg/mL)、Kan(25μg/mL)、10％(w/v)蔗糖的NA平板，在这两种板上平行划线，在含有10％(w/v)蔗糖的平板上死掉且在不含10％蔗糖的平板上存活的菌，即为单交换子。

7)第二次同源重组：挑取单交换子，接种到含有Rif(50μg/mL)的无菌NB培养基中，置于28℃、200rpm的摇床中培养16h左右。将培养好的菌稀释涂布于含有Rif(50μg/mL)、10％(w/v)蔗糖的NA平板，放置在28℃培养箱中培养3天左右。

8)筛选双交换子：使用的是含有Rif(50μg/mL)、10％(w/v)蔗糖的NA平板以及含有Rif(50μg/mL)、Kan(25μg/mL)、10％蔗糖的NA平板，在这两种板上平行划线，在含有Kan的平板上死掉且在不含Kan(25μg/mL)的平板上存活的菌，即为双交换子或者是野生型菌株。

采用内外引验证方法，外引即为2507_LF和2507_RR，引物序列见序列表SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.6；内引为2507_inF和2507_inR，引物序列见序列表SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8。若菌株PCR验证结果为使用内引扩增不出产物并且使用外引扩增出左右臂引物长度之和，则该菌株即为已缺失掉XOC_gx2507基因的缺失突变体。验证结果如附图1所示。

实施例2 XOC_gx2507基因缺失突变体菌株胞外多糖产量检测

1)定性检测

将野生型菌株Xoc GX01与XOC_gx2507基因缺失突变体菌株接种到含有Rif(50μg/mL)的NB培养基中，置于28℃、200rpm摇床中培养16h，使用灭菌的去离子水将OD₆₀₀调至0.2，用移液器精确吸取2微升的菌液接种到含有2％蔗糖的NA培养基平板上，并以野生型菌株Xoc GX01作为对照，28℃培养箱倒置培养3天。

如附图2所示，XOC_gx2507基因缺失突变体菌株菌落形态比野生型菌株Xoc GX01更大、更圆润饱满。这表明与野生型菌株Xoc GX01相比，XOC_gx2507基因缺失突变体菌株的胞外多糖产量增加。

2)定量检测

为了准确测定胞外多糖产量，本发明采用摇瓶发酵的方法进行测定。将OD₆₀₀为1.0的菌液按5％的接种量接种到添加有4％(w/v)蔗糖的NB培养基中，培养6天后，向发酵液中加入3倍体积的95％的乙醇，边加入边搅拌，室温静置30min，将絮状沉淀物取出，必要时进行离心，干燥后称重。每组实验重复三次，每次实验作三个平行实验。

结果如表1所示：XOC_gx2507基因缺失突变体菌株的胞外多糖产量比野生型菌株Xoc GX01的产量高出2倍。

表1 XOC_gx2507基因缺失突变体菌株胞外多糖产量检测

菌株名称	野生型菌株Xoc GX01	XOC_gx2507基因缺失突变体
			EPS产量(g/L)	6.383±0.194<sup>B</sup>	12.96±0.639<sup>A</sup>

注：差异分析采用T-TEST，P<0.01。

本发明鉴定的XOC_gx2507基因的缺失会直接使水稻条斑病菌GX01胞外多糖的产量增加2倍。因此，该基因可以用于通过基因工程技术手段改良胞外多糖生产菌株。本领域技术人员可以根据本说明书的教导和启示，定向改良高产的胞外多糖生产菌株。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 广西大学

<120> 编码调控胞外多糖合成的调控因子的基因及工程菌和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 633

<212> DNA

<213> 基因(XOC_gx2507)

<400> 1

gtgcgagtca tcatcgtcga cgatcacacc cttgtccgtg ccggcctgtc caggctgctg 60

caaactttcg ccggcatcga tgtcgtgggc gaggcgagca acgcgcaaca agccctggac 120

atgacgtccc tgcaccggcc cgacctggtg ttgatggacc tgtccctgcc tggccgtagc 180

ggcctggatg ccatgaccga cgtactgcgc gccgcgccgc gcacgcatgt ggtgatgatg 240

tcgatgcacg acgacccggt gcacgtgcgc gatgcgctcg atcgcggcgc tgtcggcttc 300

gtggtcaagg acgccgcacc gctggaactg gaactggcgt tgcgcgctgc cgctgctggt 360

caagtgttcc tgagcccgca gatctcgtcc aagatgattg cgccgatgct cggtcgcgaa 420

aagccggtcg gtattgccgc actgtcgcca cgccagcgcg agattctgcg cgaaattggc 480

cgcggccaaa gcaataagga aatcgccgcc gatctgggca tcagcgtcaa gacggtggaa 540

acccaccgcg cacgcatgat ggaatcgctc ggttgccgtc gcgccaacga tctggtgctg 600

ctggcggcca aacatcacaa cgaattggtc tga 633

<210> 2

<211> 210

<212> PRT

<213> 调控因子(XOC_gx2507)

<400> 2

Met Arg Val Ile Ile Val Asp Asp His Thr Leu Val Arg Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ser Arg Leu Leu Gln Thr Phe Ala Gly Ile Asp Val Val Gly Glu Ala

20 25 30

Ser Asn Ala Gln Gln Ala Leu Asp Met Thr Ser Leu His Arg Pro Asp

35 40 45

Leu Val Leu Met Asp Leu Ser Leu Pro Gly Arg Ser Gly Leu Asp Ala

50 55 60

Met Thr Asp Val Leu Arg Ala Ala Pro Arg Thr His Val Val Met Met

65 70 75 80

Ser Met His Asp Asp Pro Val His Val Arg Asp Ala Leu Asp Arg Gly

85 90 95

Ala Val Gly Phe Val Val Lys Asp Ala Ala Pro Leu Glu Leu Glu Leu

100 105 110

Ala Leu Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gln Val Phe Leu Ser Pro Gln Ile

115 120 125

Ser Ser Lys Met Ile Ala Pro Met Leu Gly Arg Glu Lys Pro Val Gly

130 135 140

Ile Ala Ala Leu Ser Pro Arg Gln Arg Glu Ile Leu Arg Glu Ile Gly

145 150 155 160

Arg Gly Gln Ser Asn Lys Glu Ile Ala Ala Asp Leu Gly Ile Ser Val

165 170 175

Lys Thr Val Glu Thr His Arg Ala Arg Met Met Glu Ser Leu Gly Cys

180 185 190

Arg Arg Ala Asn Asp Leu Val Leu Leu Ala Ala Lys His His Asn Glu

195 200 205

Leu Val

210

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatccgt agcgaggaaa ccagcgaa 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctctagagt cgacgatgat gactcgca 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctctagacg gccaaacatc acaacgaa 28

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaagcttc atcgttccaa ctgctgctc 29

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccaggctgct gcaaactttc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttgacgctg atgcccagat 20

Claims (1)

1.基因XOC_gx2507在提高胞外多糖产量中的应用，其特征在于，所述基因XOC_gx2507核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过将水稻条斑病菌GX01中编码转录调控因子的基因XOC_gx2507敲除，选育高产胞外多糖的基因工程菌株。

Images