CN112851810A - Cd20抗体及其治疗癌症的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种CD20抗体及其治疗癌症的应用，本发明提供一种新的CD20抗体及其制备和用途。其中所述抗体能够更好地结合人CD20蛋白，诱导强烈的CDC杀伤活性，同时能够增强抗肿瘤活性。

Description

CD20抗体及其治疗癌症的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的涉及一种CD20抗体及其治疗癌症的应用。
技术背景
细胞淋巴瘤是发生在细胞的实体肿瘤，主要可以分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’slymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s lymphoma,NHL)。在血液系统恶性肿瘤中十分常见，对人类生命健康造成极其严重的威胁。B淋巴细胞抗原CD20是人类B淋巴细胞表面上所特有的标识，主要由297个氨基酸构成。根据不同的磷酸化水平，CD20的分子量为33-37KD，属于非糖基化磷蛋白。CD20分子是一种有四个跨膜区的跨膜蛋白，它的N端和C端都位于细胞质内侧。CD20分子的主要抗原表位位于第三、四跨膜区之间，是一个由43个氨基酸组成的环状区域。从前体B细胞到后来的分化过程，CD20广泛表达于B细胞的表面，但是不表达于晚期分化的浆细胞中。CD20表达于B细胞发展的除了最初和最后以外的所有阶段。在B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和黑色素瘤肿瘤干细胞中均被发现。CD20分子位于细胞膜表面，抗体接近的空间位阻较小，因此CD20分子成为治疗细胞淋巴瘤的理想靶点。
利妥昔单抗(Rituxiamb)是第一个被美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市并用于治疗NHL的单抗药物。但因Rituximab分子中含有30％的鼠源序列，患者在长期用药以后，易引起人抗鼠抗体免疫应答(HAMA)而产生严重的不良反应。同时，Rituximab的临床反应率只有50％，完全缓解率仅有10％。因此，严重制约了Rituximab在临床中的长期应用。
发明内容
基于上述发现，本发明提供一种人源化的抗体,其免疫原性低，能够更好地结合人CD20蛋白，同时具有良好的抗肿瘤活性。
本发明提供以下技术方案：
一种分离的单克隆抗体(例如，人源化抗体)含有轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含SEQ ID NO:3、4和5；此外还含有重链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含SEQ ID NO:6、7和8；其中该抗体或其抗原结合部分与CD20结合。
在一些实施方案中，本发明所述的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中轻链可变区序列为SEQ ID NO:1，重链可变区序列为SEQ ID NO:2；其中该抗体或其抗原结合部分与CD20结合。
在一些实施方案中，本发明所述的抗体包含重链和轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中，重链可变区和轻链可变区含有上述的氨基酸序列，轻链恒定区和重链恒定区分别包含SEQ ID NO:9和10的氨基酸序列,其中该抗体或其抗原结合部分与CD20结合。
在一些实施方案中，本发明所述的抗体包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本发明的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4亚型。在一些实施方式中，本发明的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或Fab’2片段。
在一些实施方案中，本发明所述CD20抗体轻链恒定区进一步优选为κ链。所述抗体重链恒定区进一步优选为IgG1。
在一些实施方案中,本发明的抗CD20抗体或其片段与人CD20特异结合。
在一些实施方案中,本发明的抗CD20抗体能够诱导强烈的CDC活性。
在一些实施方案中,本发明的抗CD20抗体具有诱导表达CD20的细胞死亡的能力。
在一些实施方案中,本发明的抗CD20抗体能够抑制肿瘤细胞的生长、增殖，发挥抗肿瘤活性。
在一些实施方案中,本发明所述CD20抗体对人CD20的结合通过Elisa或流式细胞术(例如FACS)测定法进行测定。
本发明提供了一种药物组合，包括本发明所述的CD20抗体，此外还可包括第二药物或活性剂。第二药物可以抗肿瘤药物，如铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等、丝裂霉素(MMC)、二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)、三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦、氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等、诺雷德、依那通、白细胞介素-2；胸腺肽类、抗PD-1抗体、抗HER2抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体和/或抗PD-L1抗体。
本发明所述的CD20抗体可应用于制备治疗CD20相关疾病的药物中，所述疾病选自血液肿瘤、实体瘤或其组合，包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。
本文所用的术语“抗CD20抗体”是指能够以足够的亲合力结合人CD20蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向人CD20的诊断剂和/或治疗剂。
本文所用术语术语“抗体”包括具有免疫球蛋白样结合功能的任何部分。该术语包括完整的抗体分子和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链，骆驼科抗体包括例如纳米抗体，噬菌体展示结合构建体等等。天然“抗体”包含至少一条重(H)链和一条轻(L)链。每条重链均由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，CH1、CH2以及CH3组成。每条轻链均由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变区、其中夹杂着称为框架区(FR)或连接(J)区(分别存重链和轻链中的JH或JL)的更加保守的区域。
本文所用术语“单克隆抗体”是指来源于例如真核生物的、原核生物的或噬菌体克隆的单一拷贝或克隆的抗体,而不指其产生的方法。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它。
本领域已知五个主要类别的抗体:IgA，IgD，IgE，IgG和IgM,并且这些抗体中的数个可以进一步被划分为亚类(同种型),例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。
本文所用术语“CDR区”或“互补决定区”，是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。CDR区序列可以由Kabat、Chothia方法来定义或本领域熟知的任何CDR区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。本发明所用的方法可利用或根据这些方法中的任一种所定义的CDR，包括但不限于Kabat定义、Chothia定义中的任一者来定义。具体地，本发明提供的CDR序列根据Kabat定义。
本文所用术语“人源化抗体”通常是指获得抗CD20特异抗体(例如，鼠类抗体或由杂交瘤产生的抗体)VH-CDR和VL-CDR序列将其移植到所选的人抗体框架编码序列上来产生人源化抗体。任选地，可通过随机诱变或在特定位置诱变来优化CDR区，以在将CDR区移植到框架区中之前用不同的氨基酸置换CDR中的一个或更多个氨基酸。或者，可使用本领域技术人员可获得的方法在将CDR区插入人框架区后对其进行优化。优选地,“人源化抗体”具有起源于或来自亲本抗体(即非人抗体，优选小鼠单克隆抗体)的CDR，而在其存在的程度上框架区和恒定区(或其主要部分或基本部分，即至少约90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同人类种系免疫球蛋白区或其重组或突变形式中，无论所述抗体是否在人类细胞中产生。
本文所用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的缔合比率，本文所用的术语“Kdis”或“Kd”，意指特定抗体-抗原相互作用的解离比率。本文所用的术语“KD”意指获自Kd对Ka(即Kd/Ka)比率并表示为摩尔浓度(M)的解离常数。可以利用本领域公认的方法测定抗体的KD值。如使用表面等离子体共振测定、细胞结合测定或平衡透析测定测量。
本文所用的术语“亲和性”或“亲和力”是指在单一抗原性位点上抗体和称作“表位”的抗原部分之间相互作用的强度。在每一个抗原性位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在抗体的多个原子位置或氨基酸残基原子上相互作用；一般地，这种相互作用的数目越大，抗体对抗原的亲和性就越强。
有益效果
本发明的有益效果主要体现在：提供一种新的CD20抗体,其能够更好地结合人CD20蛋白，诱导强烈的CDC杀伤活性，同时能够增强抗肿瘤活性。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1人源化CD20抗体的CDC杀伤活性
图2人源化CD20抗体诱导细胞死亡活性
图3人源化CD20抗体的小鼠体内抗肿瘤活性
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1.抗CD20抗体制备
用转染人CD20的NS/0对BALB/C小鼠进行免疫。将细胞用PBS重悬后，以1:1与完全弗氏佐剂混合，初次免疫的接种方式为腹腔注射，免疫剂量为每只小鼠1X107个细胞。随后每3天以相同剂量的无佐剂细胞通过腹腔注射加强免疫。在细胞融合的前三天，以0.5X107个细胞通过静脉注射进行冲击免疫。3天后，将小鼠脱颈处死，取出脾脏，在PBS中制备成单细胞混悬液。脾细胞用DMEM培养基清洗3次。取处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与上述分离的小鼠脾细胞按1：4的比例混匀后用DMEM清洗2次。细胞融合通过PEG融合的方式进行。融合后的细胞用DEME清洗3次，并重悬在细胞生长培养基中(RPMI 1640+10％FBS+1XHAT)。将细胞混悬液在96孔培养板上铺板，每孔200μl，5×104细胞每孔，将细胞放于37℃、5％CO 2的潮湿细胞培养箱培养7天。在第7天时，将培养基换成新鲜培养基(DMEM+10％FBS+1XHAT)。2-3天以后，吸取细胞培养液上清，通过高通量的ELISA结合检测来筛选与人CD20蛋白结合的杂交瘤克隆。取阳性克隆，利用有限稀释法筛选单克隆化阳性杂交瘤细胞株。取ELISA实验中与人CD20结合的阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，冻存保种。将最终筛选出的阳性杂交瘤细胞株命名为12H7。
实施例2.抗体人源化
取实施例1中获得的杂交瘤细胞5×107个，加入1ml Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟；加0.2ml氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5ml离心管中；加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g离心15分钟，弃上清；加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC水溶解，即获得总RNA。取总RNA，随后用反转录试剂盒(PrimeScript RT Master Mix，购自Takara)合成cDNA第一条链；以cDNA为模板，利用PCR扩增出含有抗体重链可变区和轻链可变区的DNA产物，取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品使用柱回收试剂盒(TIANGEN)纯化。酶切后将其连接到pGEM-T载体上，取5μl连接产物转化感受态细胞，取感受态细胞涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养；次日挑取单菌落扩增并进行菌落PCR，选取阳性克隆测序，根据测序结果获得12H7克隆的可变区氨基酸序列。
通过序列比对(NCBI-Ig blast)选择与12H7重链可变区，轻链可变区同源性最高的胚系基因序列作为可变区移植骨架。在选定人抗体骨架后，通过同源建模，预测在鼠抗恒定区中可能决定结构的关键氨基酸，对嫁接的骨架区进行回复突变设计，确定最终改造后的人源化抗体轻重链可变区序列。合成抗体VH结构域和VK结构域，通过PCR方法分别扩增轻链和重链的可变区，将重链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG1恒定区的表达载体(购自Invitrogen)，将轻链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体(购自Invitrogen)。将质粒转化感受态细胞，按照前述筛选方法筛选阳性克隆，并将阳性样品进行测序。
将序列正确的重组抗体重、轻链的表达载体进行扩增，随后瞬时转染HEK293F细胞。4天后收集细胞培养液，3000g离心细胞培养液30分钟，收集上清液，0.22μm滤器过滤。用1ml Mab SelectTM SuReTM column(购自GE Healthcare)纯化200ml澄清上清液中的单克隆抗体。Mab SelectTM SuReTM column先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)平衡。上样完毕后用平衡缓冲液清洗Mab SelectTM SuReTM column，平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的5倍。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH3.0)洗脱结合在Mab SelectTM SuReTM column上的单克隆抗体。收集洗脱的抗体，加入10％(v/v)1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH。然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜。收集透析后的单克隆抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得到纯化的CD20人源化抗体。
将人源化改造后的抗体命名为h12H7-IgG1，测序结果显示，上述单克隆抗体轻重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；按Kabat定义CDR序列，上述单克隆抗体的轻、重链的可变区CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；上述单克隆抗体轻重链的氨基酸序列为如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
实施例3.人源化CD20抗体与人CD20的亲和力
参照氨基偶联试剂盒和人抗捕获试剂盒说明书，将人抗体捕获抗体(AHC)通过氨基偶联的方式固定在S系列传感器芯片(Sereis S Sensor Chip CM5)表面。室温平衡20～30min，将芯片装入仪器。用平衡缓冲液稀释抗原，稀释抗原10nM起始稀释度5个浓度梯度，并设置2个零浓度(即平衡缓冲液)和一个重复浓度(一般为最低浓度重复)。用平衡缓冲液将CD20抗体h12H7-IgG1稀释至实验工作浓度，2～8℃密封备用。设置抗原的流速为50μL/min，结合时间为3min。设置HBS-EP+缓冲液流速为50μL/min，解离时间为10min。使用3MMgCl2作为再生缓冲液，按照再生程序对芯片进行再生。此后以同样的方法测定对照抗体Rituximab(其序列参照IMGT/mAb-DB ID:161)。通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(Ka)和解离速率(Kd)。平衡解离常数(Kd)用解离速率(Kd)/结合速率(Ka)计算。结果如表一所示：本发明的抗体亲和力明显优于对照抗体Rituximab。
表一
抗体 K<sub>a</sub>(1/Ms) K<sub>d</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
h12H7-IgG1 1.37x10<sup>5</sup> 4.21x10<sup>-5</sup> 3.07x10<sup>-10</sup>
Rituximab 6.31x10<sup>4</sup> 3.45x10<sup>-4</sup> 5.46x10<sup>-9</sup>
实施例4.人源化CD20抗体的CDC杀伤活性
收集生长力旺盛的Raji细胞悬液，1000rpm离心5min。将上清丢弃，并用1640培养基将细胞洗2遍后重悬，将细胞密度调为1×106/mL，取100μl细胞悬液到96孔板中，将CD20抗体稀释成浓度为5μg/mL、1μg/mL、0.2μg/mL三个浓度梯度，加入细胞中培养1h，同时设置无细胞的培养基空白背景孔和未加入抗体阴性对照组。按10％体积比加入人血清，于37℃继续培养4小时后，用非同位素细胞毒性试验检测试剂盒按产品说明书提供的方法进行分析，计算裂解细胞的百分数。如图1所示，h12H7-IgG1能够诱导更强烈的CDC杀伤。
实施例5.人源化CD20抗体诱导细胞死亡活性
收集生长力旺盛的Raji细胞悬液，1000rpm离心5min。将上清丢弃，并用1640培养基将细胞洗2遍后重悬，将细胞密度调为1×106/mL，取100μl细胞悬液到96孔板中，将CD20抗体稀释成浓度为5μg/mL、1μg/mL、0.2μg/mL、三个浓度梯度，加入细胞中共培养48h，同时设置无细胞的培养基空白背景孔和未加入抗体阴性对照组，将细胞洗两遍后用Annexin V/PI试剂盒(BD公司产品)按照产品说明书检测细胞死亡百分率。如图2所示，h12H7-IgG1和Rituximab能够诱导相同程度的细胞死亡诱导能力。
实施例6.人源化CD20抗体的小鼠体内抗肿瘤活性
为了探讨CD20抗体h12H7-IgG1在体内的抗肿瘤效果，取6-8周的雌性SCID小鼠，通过尾静脉接种CD20阳性的B淋巴瘤细胞Raji。将小鼠随机分组，每组8只。5天后给荷瘤小鼠分别尾静脉注射CD20抗体h12H7-IgG1、Rituximab及阴性对照抗体IgG1，观察小鼠死亡率。结果如图3所示:CD20抗体h12H7-IgG1展现出比Rituximab更好的抗肿瘤活性。
序列表
<110> 北京广未生物科技有限公司
<120> CD20抗体及其治疗癌症的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Arg Val Ala Thr Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ile Gly Asn Arg Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ser Lys Ile Asp Ala
85 90 95
Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Gly Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Pro Thr Lys Gly Asn Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Phe Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ile Asp Gly Cys Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Ala Ser Gln Arg Val Ala Thr Gly Val Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Ala Ile Gly Asn Arg Thr
1 5
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Gln Ala Ser Lys Ile Asp Ala Tyr Pro Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Tyr Ala Gly Lys
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Ile Pro Thr Lys Gly Asn Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Phe Leu Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Ile Asp Gly Cys Asn Phe Asp Tyr
1 5
<210> 9
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Arg Val Ala Thr Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ile Gly Asn Arg Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ser Lys Ile Asp Ala
85 90 95
Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 10
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Gly Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Pro Thr Lys Gly Asn Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Phe Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ile Asp Gly Cys Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445

Claims (9)

1.一种抗CD20抗体，含有轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别如SEQ ID NO:3、4和5所示；该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别如SEQ ID NO:6、7和8所示。
2.根据权利要求1所述的抗CD20抗体，其包含如SEQ ID NO:1所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列。
3.根据权利要求1-2任一项所述的抗CD20抗体，其包含如SEQ ID NO:9所示的轻链9和如SEQ ID NO:10所示的重链。
4.根据权利要求1-2任一项所述的抗CD20抗体，其特征在于：所述抗体还包含选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和包含选自kappa或Lambda亚型的轻链恒定区。
5.根据权利要求1-2任一项所述的抗CD20抗体，其特征在于：所述抗体重链恒定区进一步优选为IgG1，抗体轻链恒定区进一步优选为kappa。
6.一种原核或真核细胞系中复制的表达载体，其特征在于：其编码权利要求1-5任一项所示的抗体。
7.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求1-5任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
8.权利要求1-5任一项的抗CD20抗体所述的药物组合物在制备用于治疗CD20相关疾病的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述癌症选自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。
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