CN110498857B

CN110498857B - 一种抗vegf-抗pd1双特异性抗体

Info

Publication number: CN110498857B
Application number: CN201910734971.1A
Authority: CN
Inventors: 汪国兴; 程联胜; 胡思怡; 袁红; 武婷; 樊丽
Original assignee: Anhui Rubiox Vision Biotechnology Co ltd
Current assignee: Anhui Rubiox Vision Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-08-09
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2039-08-09
Also published as: CN110498857A

Abstract

本发明涉及一种抗VEGF‑抗PD‑1双特异性抗体，属于分子免疫学技术领域。该抗体的重链可变区的CDR‑H1为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，CDR‑H2为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和CDR‑H3为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；以及该抗体的轻链可变区的CDR‑L为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。双特异性抗体Ps3Vm能够有效地与PD‑1和VEGF蛋白结合，且能有效地与PDL‑1竞争结合PD‑1蛋白、与VEGF‑A竞争结合VEGF蛋白，同时可有效刺激T细胞功能并分泌细胞因子IL‑2和IFN‑γ，而同型对照抗体不能促进T细胞增殖和IL‑2、IFN‑γ分泌，此外双特异性抗体Ps3Vm还可明显抑制小鼠肿瘤生长。

Description

一种抗VEGF-抗PD1双特异性抗体

技术领域

本发明涉及一种抗VEGF-抗PD-1双特异性抗体Ps3Vm，属于分子免疫学技术领域。

背景技术

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，又称血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。血管内皮生长因子是一个家族，包括VEGF-A、VEGF-B、 VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PGF)。通常VEGF即VEGF-A。 VEGF-A可促进新生血管形成和使血管通透性增加，VEGF-B在非新生血管形成的肿瘤中起作用，VEGF-C和VEGF-D在癌组织的新生血管和新生淋巴管的形成过程中起作用，VEGF-E也是一种潜在的新生血管形成因子，PGF促进新生血管形成，使血管通透性增加，在实验性脉络膜新生血管中PGF的表达明显增高。与血管内皮生长因子进行特异性结合的高亲和力受体称为血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，VEGFR)，主要分为3类VEGFR-1、 VEGFR-2、VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2主要分布在肿瘤血管内皮表面，调节肿瘤血管的生成；VEGFR-3主要分布在淋巴内皮表面，调节肿瘤淋巴管的生成。VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白。二条分子量各为24kDa的单链以二硫键组成二聚体。VEGF分解的单体无活性，去除N2糖基对生物效应无影响, 但可能在细胞分泌中起作用。由于mRNA不同的剪切方式，产生出VEGF121、 VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、 VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。1990年，美国哈佛大学Folkman博士提出著名的Folkman理论，即肿瘤组织生长，必须依靠新生血管生成来提供足够的氧气和营养物质来维持。被认为是VEGF临床应用的基础。抗VEGF与VEGFR结合的单克隆抗体，可抑制血管内皮生长因子，用于治疗各类转移性癌症。

程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)，是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族，是一个268氨基酸残基的膜蛋白。其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。其配体PD-L1也可作为靶点，相应的抗体也可以起到相同的作用。PD-1和PD-L1结合启动T细胞的程序性死亡，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。PD-1至少有两个配体，一个是PD-L1，一个是PD-L2；PD-L1至少有两个配体，一个是PD-1，一个是CD80；PD-L2至少有两个配体，一个PD-1，一个是RGMB。PD-L1/L2在抗原递呈细胞都表达， PD-L1在多种组织也有表达。PD-1与PD-L1的结合介导T细胞活化的共抑制信号，调节T细胞活化和增殖，起到类似于CTLA-4的负调节作用。华裔科学家陈列平实验室首先发现PD-L1在肿瘤组织高表达，而且调节肿瘤浸润CD8T细胞的功能。因此，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对抗肿瘤有重要的意义。近年来，已有多种抗PD-1/PD-L1抗体在肿瘤免疫治疗的临床研究迅速开展。目前 Pembrolizumab和Nivolumab已被FDA批准用于晚期黑色素瘤，最近Nivolumab 也已被美国FDA批准用于晚期鳞状非小细胞肺癌的治疗。另外，MPDL3280A(抗 PD-L1单抗)，Avelumab(抗PD-L1单抗)等也已进入多个晚期临床研究中，覆盖非小细胞癌、黑色素瘤、膀胱癌等多个瘤种。由于PD-1抗体的广谱抗肿瘤前景和惊人的药效，业界普遍认为针对PD-1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性的进展：用于治疗非小细胞性肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、黑色素瘤、白血病以及贫血病等等。在2012年和2013年的美国癌症协会(AACR)年会以及美国临床肿瘤协会(ASCO)年会上揭晓的关于PD-1抗体药物的临床药效数据后，PD-1抗体成为全球制药行业最炙手可热的在研抗体药物。

双功能抗体就是双特异性的抗体，是一种非天然抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。双功能抗体的构建通常采用生物学方法和化学交联法，随着抗体工程及分子生物学技术的发展，最近几年又发展了一类新的构建双功能抗体的方法——基因工程法。采用基因工程法不仅能构建多种功能、多种用途的双功能抗体，而且使人源化双功能抗体的构建成为现实。双功能抗体作为一种新的二次导向系统在临床治疗中具有潜在的应用价值。2014年12月03日美国FDA审批安进公司研发的双特异性抗体Blincyto(Blinatumomab)上市，用于急性淋巴细胞白血病的治疗。Blinatumomab为CD19、CD3双特异性抗体，Blincyto(Blinatumomab)是美国FDA审批的第一个双特性抗体。目前，开发存在的双功能抗体形式已被证明有超过40余种，但是由于生产效率低和药代动力学性能差等问题，一直以来双特异性抗体的研发困难重重。

中国发明专利申请号2015106924845.5、专利名称“一种抗VEGF-抗PD-1 双功能抗体及其应用”提供了一种抗VEGF-抗PD-1的双功能抗体，该双功能抗体是以PD1抗体为骨架，VEGF抗体为单链结合而成的。本发明是在此双功能抗体的基础上，进行结构和序列优化。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定的、全新的抗VEGF-抗PD1双特异性抗体 Ps3Vm，此抗体具有高度亲和力和高度特异性，能特异性识别VEGF和PD1两种靶点，解决现有抗体效果单一，不能适应复杂病症等缺陷。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种新型结构的抗VEGF-抗PD1双特异性抗体Ps3Vm，所述抗体的重链可变区的CDR-H1为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，CDR-H2为SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列，和CDR-H3为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；以及所述抗体的轻链可变区的CDR-L为SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。

优选地，所述抗体的重链可变区的CDR-H1为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，CDR-H2为SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，和CDR-H3为SEQ ID NO:7 所示的核苷酸序列；以及所述抗体的轻链可变区的CDR-L为SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

优选地，所述抗体的重链恒定区序列是人IgG1的重链恒定区序列，轻链恒定区序列是人κ抗体轻链恒定区序列。

优选地，所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

优选地，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

优选地，所述抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

优选地，所述抗体的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

一种药物组合物，该组合物含有上述的抗体和药物学上可接受的载体。

上述的抗体在制备抑制或中和VEGF和PD1活性的药物中的用途。

优选地，所述抑制或中和VEGF和PD1活性的药物用于治疗癌症。

本发明的有益效果在于：

双特异性抗体Ps3Vm能够有效地与PD-1和VEGF蛋白结合，且能有效地与PDL-1竞争结合PD-1蛋白、与VEGF-A竞争结合VEGF蛋白，同时可有效刺激T细胞功能并分泌细胞因子IL-2和IFN-γ，而同型对照抗体不能促进T细胞增殖和IL-2、IFN-γ分泌，此外双特异性抗体Ps3Vm还可明显抑制小鼠肿瘤生长，拥有最佳的试验效果。

附图说明

图1为PD-1和VEGF抗原的SDS-PAGE电泳结果图(其中，A为VEGF 抗原；B为PD-1抗原)；

图2为抗PD-1人源化抗体PDAB的电泳检测结果图；

图3为抗VEGF人源化抗体Avastin的电泳检测结果图；

图4为双特异性抗体A3P4的电泳检测结果图；

图5为双特异性抗体A3P4的SEC检测结果图；

图6为双特异性抗体Vs3P4的蛋白结构示意图；

图7为双特异性抗体Vs3P4的电泳检测结果图；

图8为双特异性抗体Vs3P4的SEC检测结果图；

图9为双特异性抗体Ps3Vm的蛋白结构示意图；

图10为双特异性抗体Ps3Vm的电泳检测结果图；

图11为双特异性抗体Ps3Vm的SEC检测结果图；

图12为ELISA比较PDAB、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm对PD1-His的相对结合活性图；

图13为ELISA比较Avastin、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm对rHuVEGF的相对结合活性图；

图14为竞争ELISA鉴定PDAB、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm、Avastin与PD1 结合表位的特异性；

图15为竞争ELISA鉴定PDAB、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm、Avastin与VEGF 结合表位的特异性；

图16为Nivolumab、PDAB、Vs3P4、Ps3Vm和IgG1体外诱导T细胞分泌 IL-2的量随抗体浓度的变化图；

图17为Nivolumab、PDAB、Vs3P4、Ps3Vm和IgG1体外诱导T细胞分泌 IFN-γ的量随抗体浓度的变化图；

图18为初步构建的小鼠模型体重变化图；

图19为初步构建的小鼠模型肿瘤体积变化图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

实施例1 PD1和VEGF抗原、抗体的制备

1、PD-1抗原的表达载体构建

从南京金斯瑞公司合成人的PD-1的cDNA，GeneID为5133，cDNAID为 NM_005018.2，在合成胞外区PD-1基因后加上Fc纯化标签得到PD-1-mFc，并在两端引入Xba I，Bam H I两个限制性酶切位点连接到pTT5表达质粒，经测序验证正确。测序完的质粒转染Trans10(购自北京全式金生物技术有限公司)，挑取单克隆，接种到1升LB液体培养基，至OD₆₀₀为1时，离心收集菌体，用质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)提取质粒。

2、VEGF抗原的表达载体构建

对基因VEGF(NCBI Gene ID:7422)所对应的氨基酸与小鼠IgG的Fc蛋白片段mFc(Ig gamma-2A chain C region)进行融合设计得到VEGF-mFc。为提高目的基因在293F细胞表达系统中的表达效率，将序列进行优化，并在两端引入 Xba I，Bam H I两个限制性酶切位点连接到pTT5表达质粒，经测序验证正确。测序完的质粒转染Trans10(购自北京全式金生物技术有限公司)，挑取单克隆，接种到1升LB液体培养基，至OD₆₀₀为1时，离心收集菌体，用质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)提取质粒。

3、PD-1和VEGF抗原的表达及纯化

将测序鉴定正确的表达载体转染293F细胞(购自Invitrogen公司)，37度， 5％CO₂，130rpm/min培养7天后，离心收集上清。将上清于4000rpm离心10min，再用0.45μm滤膜过滤；滤液加入400mM NaCl；调整pH至8.0。样品经0.2μm 滤膜再次过滤后，上样至已用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄， 2mM KH₂PO₄，pH7.4)平衡好的5mL HiTrapProtein A柱；待样品上完后用PBS 冲洗，流速5mL/min，紫外监测为水平。Buffer B(1MGlycine，pH 3.5)洗脱，流速1mL/min，收集流出峰用Tris中和至pH7.5，并进行SDS-PAGE检测， SDS-PAGE电泳结果如图1所示。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰换液至PBS中，由此得到抗原。

4、抗PD1人源化抗体的构建

(1)抗原免疫小鼠和杂交瘤筛选

本实验选用8周龄雌性BALB/c小鼠3只，采用腹腔注射法，用PD-1胞外区抗原与弗氏完全佐剂混合免疫小鼠，每周1次，共3次。最后一次免疫后一周测量小鼠血清效价，满足条件效价大于8K后加强免疫一次，结果显示3只小鼠全部满足效价(大于阴性对照2倍且大于0.25的OD450值对应的稀释度值即为该抗体的效价，效价大于等于8K即满足要求)，3天后处死小鼠，取小鼠脾脏，经碾磨后获得脾细胞群。小鼠血清效价ELISA检测结果见表1。

表1 20871小鼠免疫血清ELISA检测

利用流式细胞术(FACS)筛选出抗人PD-1抗体的B细胞，置于RPMI1640 培养基中，加入骨髓瘤细胞(SP2/0)混匀，采用50％PEG溶液进行细胞融合。融合后的细胞经过适当稀释，分置于多块96孔培养板中培养，加入HAT选择性培养基，使未融合的B细胞和骨髓瘤细胞死亡，得到杂交瘤细胞。培养2周后收集96孔板细胞培养上清，与铺有PD-1抗原的96孔酶标板结合1小时，加入抗鼠/HRP二抗孵育1小时，最后加入TMB显色试剂反应10分钟，用酶标仪测定450nm处的光吸收值，选出与PD-1具有结合活性的杂交瘤细胞(初筛：12 块96孔板，得到OD值≥0.5的孔数42个)。随后进行流式细胞术(FACS)筛选，选出具有PD-1/PD-L1阻断活性的杂交瘤细胞。再进行有限稀释法亚克隆，将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中，如上述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100％，建株成功，最终得到一株抗PD-1鼠源单克隆抗体细胞株，有限稀释法亚克隆结果见表2，亲和力鉴定结果见表3。

表2阳性克隆孔板位

序号	阳性克隆	96孔板位	384孔板位	OD值
					1	2G8-1N8	2G8	1N8	1.022

表3亲和力鉴定

(2)抗PD-1鼠源抗体可变区基因调取

选取抗PD-1杂交瘤克隆，采用Trizol方法抽提总RNA，利用抗体亚型 (Isotype)特异性引物或者通用引物进行反转录PCR，分别扩增抗体轻链可变区 (VL)和重链可变区(VH)基因，随后连接至克隆载体进行DNA测序分析。最终获得完整VL和VH的DNA序列，并翻译成相应的氨基酸序列。抗PD-1 鼠源抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:13-14；其中，重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3氨基酸序列分别为SEQ ID NO:15-17，轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO:18-20。

(3)抗PD-1鼠源单抗可变区基因人源化改造

(a)重链人源化

首先使用Ig Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)分析与小鼠PD-1抗体的VH基因同源性较高的人种系基因(germline gene)。结果显示重链IGHV3-23 在氨基酸水平具有83％同源性，因此选为重链可变区候选基因模板。将小鼠PD-1 抗体的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3按照Kabat编号规则进行编号，将相应的 CDR区氨基酸序列引入IGHV3-23的框架区中。将框架区氨基酸No.49(S->T)， No.78(T->N)回复突变为小鼠PD-1抗体原始序列。然后，将重链CDR H1No.33 (G->D)，H2No.56(S->R)进行额外突变，由此完成重链可变区人源化。抗 PD-1人源化抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:21；其中，重链可变区的 CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3氨基酸序列分别为SEQ ID NO:22-24。

(b)轻链人源化

首先使用Ig Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)分析与小鼠PD-1抗体的VL基因同源性较高的人种系基因。结果显示轻链IGKV1-16在氨基酸水平具有86％同源性，因此选为轻链可变区候选基因模板。将小鼠PD-1抗体的 CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3按照Kabat编号规则进行编号，将相应的CDR区氨基酸序列引入IGKV1-16的框架区中。将框架区氨基酸No.83(F->M)回复突变为小鼠PD-1抗体原始序列。然后，将轻链CDR L1No.31(S->T)和No.34(S->A)， L2No.56(D->L)进行额外突变，由此完成轻链链可变区人源化。抗PD-1人源化抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:25；其中，轻链可变区的CDR-L1、 CDR-L2和CDR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO:26-28。

(4)抗PD-1人源化抗体的亲和力成熟

针对抗PD-1人源化抗体的5个CDR区(L1，L3，H1，H2和H3)分别设计了抗体突变体库，突变位点覆盖了所有CDR区的非保守位点。采用SOE-PCR 反应获得单链抗体(scFv)基因，经DNA凝胶回收和酶切之后，与酶切后的 pCANTAB-5E噬菌体展示载体连接，电转化TG1感受态细菌，获得5个含有CDR 突变的单链抗体库。通过感染M13KO7辅助噬菌体，制作重组噬菌体，共进行了三轮淘洗，保留并富集结合能力强的抗体突变体。每轮淘洗分别将重组噬菌体与生物素标记的重组人PD-1抗原结合2小时，再加入链亲和素磁珠结合30分钟，先后用2％TPBS、1％TPBS和PBS清洗5次，每次5分钟，淘洗之后立刻感染TG1细胞，用于下一轮重组噬菌体制备。挑选三轮淘洗后富集的TG1单克隆，制备重组噬菌体上清，与铺有1μg/mL PD-1抗原的96孔酶标板结合1小时，加入M13/HRP二抗孵育1小时，最后加入OPD进行显色反应10分钟，用酶标仪测定490nm处的光吸收值。对数据进行分析后，计算含有抗体突变体的相对亲和力，分别从L3，H1，H3突变体库中筛选得到3个，6个，5个亲和力有明显提高的克隆，最终从H3突变体库中选择1个亲和力最高的克隆PDAB开展下一步研究，电泳结果如图2所示。

5、抗VEGF人源化抗体的构建

本实验所用抗VEGF人源化抗体为Roche(Genentech)公司2004年上市的贝伐单抗(Avastin，bevacizumab)，自专利网站等公开的蛋白序列网站获得抗体序列(CN101210051A)，人工合成VEGF抗体的轻链和重链的cDNA，将合成的 cDNA分别克隆到pTT5质粒中，并通过测序确定质粒构建正确。测序完的质粒转染Trans10(购自北京全式金生物技术有限公司)，挑取单克隆，接种到1升 LB液体培养基，至OD₆₀₀为1时，离心收集菌体，用质粒大提试剂盒(购自Qiagen 公司)提取质粒。将测序鉴定正确的VEGF重链表达载体和轻链表达载体(1:1) 共转染到293F细胞中，37度，5％CO₂，130rpm/min培养7天后，离心收集上清。将上清4000rpm离心10min，并用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；滤液加入 400mM NaCl；调整pH至8.0。样品经0.2μm滤膜再次过滤后，上样至已用PBS (137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa₂HPO₄，2mMKH₂PO₄，pH7.4)平衡好的5mL HiTrap MabSelect柱(购自GE公司)；待样品上完后用PBS冲洗，流速 5mL/min，紫外监测为水平。Buffer B(1M Glycine，pH3.5)洗脱，流速1mL/min，收集流出峰用Tris中和至pH7.5，并进行SDS-PAGE检测，SDS-PAGE非还原电泳检测结果见图3。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰，用脱盐柱换液至PBS中，由此得到抗体VEGF蛋白。

实施例2候选双特异性抗体的制备

1.scFv-VEGF-linker-PD1-H chain结构双特异性抗体(A3P4)的制备：

在已有抗VEGF人源化抗体的基础上，提取重链和轻链可变区基因用肽段连接成单链抗体scFv-VEGF。将scFv-VEGF克隆到抗PD1抗体重链N端，构建 scFv-VEGF-linker-PD1-Hchain结构的双特异性抗体。将此重链表达载体与抗PD1 抗体的轻链表达载体共转化293F细胞，收集上清、纯化，SDS-PAGE鉴定分子量和纯度(图4)，SEC检测此序列抗体二聚体较多(图5)。

2.dsFv-VEGF-linker-PD1-H chain结构双特异性抗体(Vs3P4)的制备：

在原有实验基础上，重新设计新的结构。提取抗VEGF人源化抗体重链和轻链可变区基因并进行VH44cys和VL100cys突变(增加链内二硫键改善聚集)，用肽链连接成单链抗体dsFv-VEGF。将dsFv-VEGF克隆到抗PD1抗体重链N端，构建dsFv-VEGF-linker-PD1-Hchain结构的双特异性抗体(图6)。将此重链表达载体与抗PD1抗体的轻链表达载体共转化293F细胞，收集上清、纯化，SDS-PAGE 鉴定分子量和纯度(图7)，并进行SEC检测(图8)。

3.dsFv-PD1-linker-VEGF-H chain结构双特异性抗体(Ps3Vm)的制备：

第三次结构优化设计，在已有抗PD1人源化抗体的基础上，提取重链和轻链可变区基因并进行VH44cys和VL100cys突变(增加链内二硫键改善聚集)，用肽链连接成单链抗体dsFv-PD1。将dsFv-PD1克隆到抗VEGF抗体重链N端，构建dsFv-PD1-linker-VEGF-H chain结构的双特异性抗体(图9)。将此重链表达载体与抗VEGF抗体的轻链表达载体共转化293F细胞，收集上清、纯化， SDS-PAGE鉴定分子量和纯度(图10)，并进行SEC检测(图11)。Ps3Vm抗体的重链氨基酸和核苷酸序列分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11，重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸和核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1-3 和SEQ ID NO:5-7；Ps3Vm抗体的轻链氨基酸和核苷酸序列分别为SEQ ID NO:10 和SEQ ID NO:12，轻链可变区的CDR-L的氨基酸和核苷酸序列分别为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8。

实施例3双特异性抗体亲和力测定

1.双特异性抗体与PD-1的亲和力

用PD-1-mFc包被酶标板，1％BSA封闭，分别将不同浓度的抗体PDAB、 A3P4、Vs3P4、Ps3Vm加入酶标板，37℃孵育后加入酶标二抗37℃孵育30分钟。在酶标仪上检测450nm的吸光值。抗体PDAB、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm与抗原 PD-1结合结果显示，抗体PDAB、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm均能有效地与PD-1 蛋白结合，并且其结合效率呈剂量依赖关系，结果见图12和表4。

表4抗体PDAB、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm与PD-1蛋白的结合效率

2.双特异性抗体与VEGF的亲和力

用VEGF-mFc包被酶标板，1％BSA封闭，分别将不同浓度的抗体Avastin、 A3P4、Vs3P4、Ps3Vm加入酶标板，37℃孵育后加入酶标二抗37℃孵育30分钟。在酶标仪上检测450nm的吸光值。抗体Avastin、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm与抗原 VEGF结合结果显示，抗体Avastin、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm均能有效地与VEGF 蛋白结合，并且其结合效率呈剂量依赖关系，结果见图13和表5。

表5抗体Avastin、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm与VEGF蛋白的结合效率

实施例4双特异性抗体特异性测定

1.双特异性抗体针对PD-1的特异性

用PD-1-mFc包被酶标板，1％BSA封闭，分别将不同浓度的抗体PDAB、 A3P4、Vs3P4、Ps3Vm、Avastin与PDL-1-hFc混合，37℃孵育后加入酶标二抗37℃孵育30分钟。在酶标仪上检测450nm的吸光值。抗体PDAB、A3P4、Vs3P4、 Ps3Vm、Avastin与抗原PD-1结合结果显示，抗体PDAB、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm、 Avastin均能有效地与PDL-1竞争结合PD-1蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系，结果见图14。

2.双特异性抗体针对VEGF的特异性

用VEGF-mFc包被酶标板，1％BSA封闭，分别将不同浓度的抗体Avastin、 A3P4、Vs3P4、Ps3Vm、PDAB与VEGF-A-hFc混合，37℃孵育后加入酶标二抗 37℃孵育30分钟。在酶标仪上检测450nm的吸光值。抗体Avastin、A3P4、Vs3P4、 Ps3Vm、PDAB与抗原VEGF结合结果显示，抗体Avastin、A3P4、Vs3P4、Ps3Vm、 PDAB均能有效地与VEGF-A竞争结合VEGF蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系，结果见图15。

实施例5候选双特异性抗体体外诱导T细胞分泌IL-2

采用Ficoll离心法(购自GE公司)和CD4+T细胞富集柱(购自R&D Systems 公司)，制备新鲜的PBMC，纯化人T细胞。将细胞铺板至96孔平底板中，培养过夜后，加入0.0096、0.048、0.24、1.2、6、30μg/mL六种不同浓度抗体NIVO、 PDAB、Vs3P4、Ps3Vm，加入相同六种浓度的同种型对照抗体IgG1作为阴性对照，培养3天后收集上清液，用Luminex仪(购自LifeTechnology公司)和细胞因子IL-2检测试剂盒(购自BD Biosciences公司)检测上清IL-2的分泌水平。结果如图16所示，结果表明：双特异性抗体Vs3P4和Ps3Vm均可有效刺激T细胞功能并分泌细胞因子IL-2，且与抗体浓度相关，而同型对照抗体不能促进T 细胞增值及IL-2的分泌。

实施例6候选双特异性抗体体外诱导T细胞分泌IFN-γ

用Ficoll离心法(购自GE公司)和CD4+T细胞富集柱(购自R&D Systems 公司)，制备新鲜的的PBMC，纯化人T细胞。使用Miltenyi CD14单核细胞纯化试剂盒纯化单核细胞，并在单核细胞与GM-CSF和IL-4(均购自PeproTech 公司)一起培养7天后生成DC细胞。将细胞铺板至96孔平底板中，培养过夜后，每份培养物在200μL的总体积中包含10e5个纯化的T细胞和10e4个树突细胞。加入0.0096、0.048、0.24、1.2、6、30μg/mL六种不同浓度抗体NIVO、PDAB、Vs3P4、Ps3Vm，加入六种浓度的同种型对照抗体IgG1作为阴性对照。将细胞于37℃培养5天。5天后，从每份培养物中取出100μL培养基用于细胞因子IFN-γ测量。利用OptEIAELISA试剂盒(购自BD Biosciences公司)来测定IFN-γ的水平。结果如图17所示：双特异性抗体Vs3P4和Ps3Vm均可有效刺激T细胞的功能分泌细胞因子IFN-γ，且与浓度有关，而同型对照抗体不能促进 T细胞增殖和IFN-γ分泌。

实施例7候选双特异性抗体抑制小鼠肿瘤生长

1.初步构建小鼠模型，选取适合实验的PBMC细胞

本实验采用的PBMC细胞、人结肠癌Colo-205细胞、B-NDG小鼠均为市场常见种类。

将购自中国科学院的人结肠癌Colo-205细胞培养至6.0*10⁷以上，皮下接种购自百奥塞图公司的B-NDG小鼠(每只2.0*10⁶个细胞，共30只小鼠)。小鼠正常饲养，等肿瘤长至100mm³大小时，将购得的不同来源的人PBMC细胞按 1*10⁷每只腹腔注射入购自百奥塞图的B-NDG重度免疫缺陷小鼠体内，观察肿瘤生长情况，直至顺利成瘤(选取10组PBMC细胞，每组注射3只小鼠做平行实验)。

实验结果如下表6和图18、19所示(图表中均为平均数)：

表6初步构建的小鼠模型体重和肿瘤体积变化

2.用选取的PBMC细胞构建动物模型

选取上述配型成功的PBMC细胞(G1、G2、G8、G10)，注射入购自百奥塞图公司的B-NDG-b2m敲除MHC之重度免疫缺陷小鼠体内(每只1*10⁷个细胞)，同时皮下接种人结肠癌Colo-205细胞，观察是否顺利成瘤。此为预实验，只接种注射8只小鼠(做2组平行实验)，观察成瘤性。选取顺利成瘤的PBMC 细胞进行下一阶段实验。

肿瘤体积变化如下表7(表中均为平均数)：Tumor Voiume(mm³)

表7选取的PBMC细胞构建的动物模型肿瘤体积变化

DAY	0	3	7	10	15	18	21
								G1	100.23	230.56	548.73	668.39	1268.45	1684.54	2025.68
G2	108.35	203.21	502.72	851.94	1054.26	1563.81	1954.29
								G8	113.51	211.55	465.84	712.43	946.25	1458.48	1743.65
G10	100.62	198.36	600.26	900.25	1356.31	1965.32	2200.25

3.实验用动物模型构建

选取上述PBMC细胞(G10)，注射入购自百奥塞图公司的B-NDG-b2m敲除MHC之重度免疫缺陷小鼠体内(每只1*10⁷个细胞，共4组，每组6只小鼠)，同时皮下接种人结肠癌Colo-205细胞，观察是否顺利成瘤。根据肿瘤生长情况将小鼠随机分为4组。阴性对照组(腹腔注射生理盐水)、Vs3P4组(尾静脉注射Vs3P4抗体3mg/kg)、Ps3Vm组(尾静脉注射Ps3Vm抗体3mg/kg)、阳性对照组贝伐珠单抗(尾静脉注射3mg/kg)。每3天给药1次，一共21天。肿瘤体积变化如下表：Tumor Voiume(mm³)

表8实验用动物模型肿瘤体积变化

天数	0	3	7	10	15	18	21
								生理盐水	400.23	609.56	812.26	1009.32	1478.26	1993.54	2365.82
Vs3P4	403.26	454.35	353.02	256.51	202.56	194.32	203.45
								Ps3Vm	400.24	469.35	260.24	134.87	108.46	156.36	147.51
Avastin抗体	408.58	498.69	338.56	305.45	289.5	306.43	324.62

本发明试验了3种不同结构的抗VEGF-抗PD1双特异性抗体，从分子、细胞、动物水平，分别验证了抗体效果，结果表明：双特异性抗体Ps3Vm(以VEGF 为骨架，插入dsFv-PD1单体)拥有最佳试验效果，能够有效地与PD-1和VEGF 蛋白结合，且能有效地与PDL-1竞争结合PD-1蛋白、与VEGF-A竞争结合VEGF 蛋白，同时可有效刺激T细胞功能并分泌细胞因子IL-2和IFN-γ，而同型对照抗体不能促进T细胞增殖和IL-2、IFN-γ分泌，此外双特异性抗体Ps3Vm还可明显抑制小鼠肿瘤生长。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽瀚海博兴生物技术有限公司

<120> 一种新型结构的抗VEGF-抗PD1双特异性抗体

<130> 2019

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Arg Tyr Gly Glu Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 3

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caggtgcagc tggtggagag tggaggagga ctggtccagc ctggaggctc tctgagactg 60

tcctgcgcag catccggatt cgccttttcc tcttacgaca tgtcctgggt gaggcaggca 120

ccaggcaagt gcctggagtg ggtagcaaca atctctggag gcggccggta cacctactat 180

cccgacagcg tgaagggcag gtttaccatc tctcgcgata acagcaagaa caatctgtat 240

ctgcagatga atagcctgcg ggccgaggat acagccgtgt actactgtgc cgtgagatac 300

ggcgagacct ggttcgccta ttggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag ctcc 354

<210> 6

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgca gggccagcca ggacatcaac acctacctgg cctggttcca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagagcct gatctacagg gccaacaggc tggtgagcgg cgtgcccagc 180

aggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacatgg ccacctacta ctgcctgcag tacgacgagt tccccctgac cttcggctgc 300

ggcaccaagc tggagctgaa g 321

<210> 7

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc caggaggctc cctgaggctg 60

tcttgtgcag ccagcggcta caccttcaca aactatggaa tgaattgggt gcgccaggca 120

ccaggcaagg gcctggagtg ggtgggctgg atcaacacct acacaggcga gcctacctat 180

gccgccgact ttaagcggag attcacattt tccctggata cctctaagag cacagcctac 240

ctgcagatga acagcctgag ggcagaggac accgccgtgt actattgcgc caagtacccc 300

cactactatg gcagctccca ctggtatttc gacgtgtggg gccagggcac cctggtgaca 360

gtgagctcc 369

<210> 8

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gacatccaga tgacacagag ccctagctcc ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60

atcacatgct ctgccagcca ggatatctcc aactacctga attggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaaggtgct gatctacttc acctctagcc tgcactccgg cgtgcccagc 180

cggttcagcg gctctggcag cggcaccgac tttaccctga caatctcctc tctgcagcca 240

gaggatttcg ccacatacta ttgtcagcag tattctaccg tgccctggac atttggccag 300

ggcacaaagg tggagatcaa g 321

<210> 9

<211> 732

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Asn Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Val Arg Tyr Gly Glu Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

165 170 175

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr Leu Ala Trp

180 185 190

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Arg Ala

195 200 205

Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Met

225 230 235 240

Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly

245 250 255

Cys Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

290 295 300

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro

305 310 315 320

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu

325 330 335

Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp

340 345 350

Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

355 360 365

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser

370 375 380

Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

385 390 395 400

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

405 410 415

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

420 425 430

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

435 440 445

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

450 455 460

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

485 490 495

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

500 505 510

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

515 520 525

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

530 535 540

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

545 550 555 560

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

565 570 575

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

580 585 590

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

595 600 605

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

610 615 620

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

625 630 635 640

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

645 650 655

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

660 665 670

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

675 680 685

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

690 695 700

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

705 710 715 720

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

725 730

<210> 10

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser

100 105 110

Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 11

<211> 2199

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atggagttcg gcctgagctg ggtgtttctg gtggccatcc tgaagggcgt gcagtgccag 60

gtgcagctgg tggagagtgg aggaggactg gtccagcctg gaggctctct gagactgtcc 120

tgcgcagcat ccggattcgc cttttcctct tacgacatgt cctgggtgag gcaggcacca 180

ggcaagtgcc tggagtgggt agcaacaatc tctggaggcg gccggtacac ctactatccc 240

gacagcgtga agggcaggtt taccatctct cgcgataaca gcaagaacaa tctgtatctg 300

cagatgaata gcctgcgggc cgaggataca gccgtgtact actgtgccgt gagatacggc 360

gagacctggt tcgcctattg gggccagggc accctggtga ccgtgagctc cggaggagga 420

ggatccggag gaggaggaag cggaggagga ggatctggcg gcggcggctc tgacatccag 480

atgacccaga gccccagcag cctgagcgcc agcgtgggcg acagggtgac catcacctgc 540

agggccagcc aggacatcaa cacctacctg gcctggttcc agcagaagcc cggcaaggcc 600

cccaagagcc tgatctacag ggccaacagg ctggtgagcg gcgtgcccag caggttcagc 660

ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg accatcagca gcctgcagcc cgaggacatg 720

gccacctact actgcctgca gtacgacgag ttccccctga ccttcggctg cggcaccaag 780

ctggagctga agggcggcgg cgctagcggc ggaggaggca gcggaggagg gggatctgag 840

gtgcagctgg tggagtccgg aggaggactg gtgcagccag gaggctccct gaggctgtct 900

tgtgcagcca gcggctacac cttcacaaac tatggaatga attgggtgcg ccaggcacca 960

ggcaagggcc tggagtgggt gggctggatc aacacctaca caggcgagcc tacctatgcc 1020

gccgacttta agcggagatt cacattttcc ctggatacct ctaagagcac agcctacctg 1080

cagatgaaca gcctgagggc agaggacacc gccgtgtact attgcgccaa gtacccccac 1140

tactatggca gctcccactg gtatttcgac gtgtggggcc agggcaccct ggtgacagtg 1200

agctccgcca gcaccaaggg gccctccgtg tttcctctgg ccccatcctc taagagcacc 1260

tccggaggaa cagccgccct gggctgtctg gtgaaggatt acttccctga gccagtgaca 1320

gtgtcttgga acagcggcgc cctgacctcc ggagtgcaca catttccagc cgtgctgcag 1380

agctccggac tgtatagcct gtctagcgtg gtgaccgtgc cttcctctag cctgggcacc 1440

cagacatata tctgcaacgt gaatcacaag ccatccaata caaaggtgga caagaaggtg 1500

gagcccaagt cttgtgataa gacccacaca tgcccaccat gtccagcacc tgaggccgcc 1560

ggcggaccta gcgtgttcct gtttcctcca aagccaaagg acaccctgat gatcagccgg 1620

accccagagg tgacatgcgt ggtggtggac gtgtcccacg aggaccccga ggtgaagttc 1680

aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcac aatgccaaga ccaagccccg ggaggagcag 1740

tacaactcta cctatagagt ggtgagcgtg ctgacagtgc tgcaccagga ctggctgaac 1800

ggcaaggagt ataagtgcaa ggtgtctaat aaggccctgc cagcccccat cgagaagacc 1860

atcagcaagg caaagggaca gcccagggag cctcaggtgt atacactgcc ccctagccgg 1920

gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acatgtctgg tgaagggctt ctatcccagc 1980

gacatcgccg tggagtggga gtccaatggc cagcctgaga acaattacaa gaccacacca 2040

cccgtgctgg actccgatgg ctctttcttt ctgtattcca agctgaccgt ggataagagc 2100

cggtggcagc agggcaacgt gttttcttgt agcgtgatgc acgaggccct gcacaatcac 2160

tacacacaga agtccctgtc tctgagccct ggcaagtga 2199

<210> 12

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg atccacaggc 60

gacatccaga tgacacagag ccctagctcc ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 120

atcacatgct ctgccagcca ggatatctcc aactacctga attggtatca gcagaagccc 180

ggcaaggccc ctaaggtgct gatctacttc acctctagcc tgcactccgg cgtgcccagc 240

cggttcagcg gctctggcag cggcaccgac tttaccctga caatctcctc tctgcagcca 300

gaggatttcg ccacatacta ttgtcagcag tattctaccg tgccctggac atttggccag 360

ggcacaaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gctaatga 708

<210> 13

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Arg Phe Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser

1 5 10

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Ala Ser Arg Phe Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 21

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 22

Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser

1 5 10

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 23

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 24

Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 25

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 28

Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr

1 5

Claims

1.一种抗VEGF-抗PD1双特异性抗体，其特征在于：所述抗体的重链氨基酸序列如SEQID NO:9所示，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗VEGF-抗PD1双特异性抗体，其特征在于：所述抗体的重链恒定区序列是人IgG1的重链恒定区序列，轻链恒定区序列是人κ抗体轻链恒定区序列。

3.根据权利要求1所述的一种抗VEGF-抗PD1双特异性抗体，其特征在于：所述抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

4.根据权利要求1所述的一种抗VEGF-抗PD1双特异性抗体，其特征在于：所述抗体的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

5.一种药物组合物，其特征在于：该组合物含有权利要求1~4任一项所述的抗体和药物学上可接受的载体。

6.权利要求1~4任一项所述的抗体在制备抑制或中和VEGF和PD1活性的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，所述抑制或中和VEGF和PD1活性的药物用于治疗癌症。