CN112831520B - R1r6基因型苹果作为受体材料在制备红肉转基因苹果中的应用 - Google Patents

R1r6基因型苹果作为受体材料在制备红肉转基因苹果中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了R1R6基因型苹果作为受体材料在制备红肉转基因苹果中的应用。本发明提供了R1R6基因型苹果作为受体材料在制备转基因苹果中的应用。本发明还提供了苹果(Malus sp.)BCF2作为受体材料在制备转基因苹果中的应用。本发明还提供了一种制备转基因苹果的方法，包括如下步骤：苹果(Malus sp.)BCF2作为受体材料进行遗传转化，得到转基因苹果。本发明的发明人发现，以“紫红一号”苹果和“嘎啦”苹果为亲本得到的F2代中，基因型为R1R6的株系更容易得到组培苗，且作为遗传转化受体具有更高的转化效率，其中G2株系的转化率最高。本发明对于转基因红肉苹果的创制具有重大的应用价值。

Description

R1R6基因型苹果作为受体材料在制备红肉转基因苹果中的 应用
技术领域
本发明涉及R1R6基因型苹果作为受体材料在制备红肉转基因苹果中的应用。
背景技术
苹果是我国落叶果树的第一大树种，据2016年统计数据显示，我国苹果栽培面积和产量分别达到246.69万hm2和4388.23万t，居世界首位，是世界上最大的苹果资源、生产和消费国。苹果耐贮性好，供应周期长，其果实含有较高比例的、人体比较容易吸收的游离多酚，具有很好的抗氧化、抗肿瘤、预防心脑血管疾病及保肝等作用，营养保健价值高。
近几年，随着苹果全基因组测序的完成，国内外有关苹果的基础研究取得了长足的进步，越来越多的与苹果产量、抗性、品质、发育等相关的功能基因被克隆、鉴定。但是，受限于转基因苹果材料极难获得，很多基因的功能无法得到全面的验证。目前，国内外用于转基因功能验证的苹果材料仅有一个‘嘎啦’的组培苗‘GL3’，其转化效率较低。此外，‘嘎啦’的组培苗‘GL3’属于普通白肉苹果，果肉中的类黄酮、花青苷等营养保健成分极低，不适于开展相关研究。国内外仍未有可用于基因编辑的红肉苹果组培苗。
发明内容
本发明的目的是提供R1R6基因型苹果作为受体材料在制备红肉转基因苹果中的应用。
本发明提供了R1R6基因型苹果作为受体材料在制备转基因苹果中的应用。
本发明还提供了R1R6基因型苹果作为转基因受体材料在苹果育种中的应用。
本发明还提供了一种制备转基因苹果的方法，包括如下步骤：将R1R6基因型苹果作为受体材料进行遗传转化，得到转基因苹果。
所述R1R6基因型苹果为从F2代苹果中筛选得到的；
所述F2代苹果为F1代苹果的后代；
所述F1代苹果为“紫红一号”苹果和“嘎啦”苹果的杂交后代；
筛选R1R6基因型苹果的方法如下：以苹果的基因组DNA为模板，采用序列表的序列1所示的引物R6F和序列表的序列2所示的引物R6R组成的引物对进行PCR扩增，如果得到大小分别为483-503bp和382-402bp的两种扩增产物，待测苹果为R1R6基因型苹果。
所述F2代苹果为F1代苹果的直接后代，即第一代后代。
所述F2代苹果为F1代苹果自然授粉得到的后代。
所述F1代苹果为“紫红一号”苹果和“嘎啦”苹果的直接杂交后代，即第一代后代。
“紫红一号”苹果作为父本，“嘎啦”苹果作为母本。
所述苹果的基因组DNA具体可为苹果的叶片的基因组DNA。
所述转基因苹果为红肉转基因苹果。红肉转基因苹果为叶片总类黄酮含量为2000mg/kg以上的转基因苹果。
所述转基因苹果为高类黄酮含量的转基因苹果。高类黄酮含量的转基因苹果为叶片总类黄酮含量为2000mg/kg以上的转基因苹果。
所述苹果育种为红肉苹果育种。红肉苹果为叶片总类黄酮含量为2000mg/kg以上的苹果。
所述苹果育种为高类黄酮含量苹果育种。高类黄酮含量苹果为叶片总类黄酮含量为2000mg/kg以上的苹果。
本发明还提供了苹果(Malus sp.)BCF2作为受体材料在制备转基因苹果中的应用。
本发明还提供了苹果(Malus sp.)BCF2作为转基因受体材料在苹果育种中的应用。
本发明还提供了一种制备转基因苹果的方法，包括如下步骤：将苹果(Malus sp.)BCF2作为受体材料进行遗传转化，得到转基因苹果。
苹果(Malus sp.)BCF2，即G2株系，已于2020年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.20162。
所述转基因苹果为红肉转基因苹果。红肉转基因苹果为叶片总类黄酮含量为2000mg/kg以上的转基因苹果。
所述转基因苹果为高类黄酮含量的转基因苹果。高类黄酮含量的转基因苹果为叶片总类黄酮含量为2000mg/kg以上的转基因苹果。
所述苹果育种为红肉苹果育种。红肉苹果为叶片总类黄酮含量为2000mg/kg以上的苹果。
所述苹果育种为高类黄酮含量苹果育种。高类黄酮含量苹果为叶片总类黄酮含量为2000mg/kg以上的苹果。
示例性的，以上任一所述遗传转化为导入促进类黄酮积累相关基因的遗传转化。
示例性的，以上任一所述遗传转化为导入MdMYB10基因或者导入PpMYB15基因的遗传转化。
MdMYB10基因具体如序列表的序列5所示。
PpMYB15基因具体如序列表的序列6所示。
现有技术中，转基因苹果材料极难获得，很多基因的功能无法得到全面的验证。目前，国内外用于转基因功能验证的苹果材料仅有一个‘嘎啦’的组培苗‘GL3’，其转化效率较低。此外，‘嘎啦’的组培苗‘GL3’属于普通白肉苹果。国内外仍未有可用于基因编辑的红肉苹果组培苗。本发明的发明人发现，以“紫红一号”苹果和“嘎啦”苹果为亲本得到的F2代中，基因型为R1R6的株系更容易得到组培苗，且作为遗传转化受体具有更高的转化效率，其中G2株系的转化率最高。本发明对于转基因红肉苹果的创制具有重大的应用价值。
附图说明
图1为实施例2中乳白色的种胚的照片。
图2为实施例2中制备组培苗的步骤1的照片。
图3为实施例2中制备组培苗的步骤2的照片。
图4为实施例2中制备组培苗的步骤3的照片(可以正常分化并继代)。
图5为实施例2中制备组培苗的步骤3的照片(不能正常分化并继代)。
图6为实施例2中幼苗照片和基因型检测的电泳图。
图7为实施例2中生根培养的照片。
图8为实施例2中温室培养的照片。
图9为实施例3中制备转基因株系过程中的照片和可以正常生长的植株的照片。
图10为实施例3中死亡植株的示例性照片。
图11为实施例3中不能正常分化形成丛生芽的组织的照片。
图12为实施例3中G2株系为受体材料得到的部分转基因株系的PCR鉴定结果。
图13为实施例3中MdMYB10基因表达量鉴定的结果。
图14为实施例3中在筛选培养基上正常生长10-15天的照片。
图15位实施例4中G2株系为受体材料得到的部分转基因株系的PCR鉴定结果。
图16为实施例4中PpMYB15基因表达量鉴定的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
“紫红一号”苹果，又称为“紫红1号'”红肉苹果，记载于如下文献：王燕等，‘紫红1号'红肉苹果果肉抗氧化性及花色苷分析。
pRI101载体(该载体中具有卡那霉素抗性基因)(即文献中的pRI101-ANplasmid)，记载于如下文献：N Wang，etc,HEAT SHOCK FACTOR A8a Modulates FlavonoidSynthesis and Drought Tolerance。
鉴定苹果植株为R1R1基因型、R6R6基因型还是R1R6基因型的方法如下：从待测苹果植株上取叶片，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物R6F和引物R6R组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并按如下标准判读基因型：如果PCR扩增产物显示为一条带且大小为483-503bp，待测苹果植株为R6R6基因型；如果PCR扩增产物显示为一条带且大小为382-402bp，待测苹果植株为R1R1基因型；如果PCR扩增产物显示为两条带且大小分别为483-503bp和382-402bp，待测苹果植株为R1R6基因型。引物R6F和引物R6R的靶序列位于MYB10启动子。
引物R6F(序列表的序列1)：5'-GGAGGGGAATGAAGAAGAGG-3'；
引物R6R(序列表的序列2)：5'-TCCACAGAAGCAAACACTGAC-3'。
运用吸光光度法测定叶片总类黄酮含量：
取1g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨，然后加入10ml 65％(体积比)乙醇水溶液4℃黑暗浸提4h，然后12000rpm离心20min，收集上清液；吸取0.5ml上清液，按照顺序依次加入1mL5g/100ml NaNO2水溶液、1ml 10g/100ml Al(NO3)3水溶液和4mL 2M NaOH水溶液，静置15min，然后在510nm下测定吸光值；
以芦丁(rutin,Sigma chemical,ST,Loiuis,USA)作为标样，制作分别以吸光值和标样浓度为坐标轴的标准曲线；
将待测样本的吸光值代入标准曲线，然后计算得到其叶片总类黄酮含量(单位为mg/kg，其中分母为叶片湿重)。
实施例1、基础性研究工作
发明人前期通过与美国康奈尔大学的Fei Zhangjun教授合作，对新疆野苹果及欧洲森林苹果等世界范围内的117份苹果资源进行了基因组重测序与生物信息学分析。研究表明，原产我国的新疆红肉苹果(Malus sieversii f.niedzwetzkyana)因天山山脉的地理隔离保存较高的同源一致性，未受到外源基因的渗透。因此，构建了新疆红肉苹果与苹果品种杂种一代及回交一、二代分离群体，研究明确了新疆野苹果群体遗传结构与遗传多样性特征、核心种质构建的技术参数、类黄酮含量等性状的遗传变异特点及发育机理，以新疆红肉苹果及其杂种后代为试材，围绕“红肉苹果组培苗的诱导及其转基因功能验证”进行了联合攻关，旨在获得国际首个可用于基因编辑的红肉苹果组培苗，以进一步促进苹果基础研究的发展。目前，已授权和申报发明专利10余项，定植杂种实生苗4万余株，育成红肉苹果新品种(系)6个；发表相关研究论文120篇，其中SCI论文20余篇，这些研究成果总体处在国际同类研究的领先水平。
实施例2、制备组培苗
一、获得F1代群体
以“紫红一号”苹果植株(作为父本)和“嘎啦”苹果植株(作为母本)进行杂交，收获成熟果实的种子，即为F1代种子。F1代种子播种，发育得到的植株即为F1代植株，F1代植株组成的群体即为F1代群体。
“紫红一号”苹果植株为R6R6基因型。“嘎啦”苹果植株为R1R1基因型。F1代群体的各个植株均为R1R6基因型。某一“紫红一号”苹果植株鉴定上述基因型时的PCR扩增产物的测序结果如序列表的序列3所示。某一“嘎啦”苹果植株鉴定上述基因型时的PCR扩增产物的测序结果如序列表的序列4所示。
“紫红一号”苹果植株上的成熟果实均为红肉苹果。“嘎啦”苹果植株上的成熟果实均为白肉苹果。F1代群体的各个植株上的成熟果实均为红肉苹果。
“紫红一号”苹果植株的叶片总类黄酮含量为(5470±31)mg/kg。“嘎啦”苹果植株的叶片总类黄酮含量为(420±18)mg/kg。F1代后代群体的各个植株的叶片总类黄酮含量为(3360±138)mg/kg。将叶片总类黄酮含量为2000mg/kg以上的苹果植株定义为红肉苹果。
二、获得苹果种子
步骤一得到的F1代群体通过自然授粉成功结出果实，收集成熟果实的种子(即F2代种子)，进行步骤三。F2代种子得到的植株即为F2代植株。
三、获取苹果种子的种胚
1、选取饱满、无损伤的苹果种子，置于盛有无菌水的培养皿中浸泡一夜，然后用无菌水多次冲洗，然后用70％酒精水溶液消毒30-50s,然后用无菌水冲洗三遍，然后用3％次氯酸钠水溶液浸泡10-15min，然后用无菌水冲洗3-5次。
2、完成步骤1后，将种子置于带有滤纸的培养皿中，镊子压住种子后部，用带有利尖的小镊子从后至前轻轻划破种皮两侧，小心去掉种皮，只保留乳白色的种胚(见图1)。
3、取步骤2得到的种胚，用70％酒精水溶液消毒10-20s，然后用无菌水冲洗三次，然后用1％次氯酸钠水溶液消毒3-5min，然后用无菌水冲洗3-5次。
四、制备组培苗
培养条件均为：光照强度为120-150μmol m-2s-1，光照周期为光照14h/黑暗10h，温度为24℃。
1、完成步骤三后，将种胚转移到三角瓶中，在三角瓶中加入少量无菌水，以水量不完全没过种胚为宜；然后培养5-7d，直至种胚子叶变绿、胚轴有伸长趋势。培养起始时的照片见图2的A，培养结束时的照片见图2的B。本步骤对150个种胚进行操作。
2、完成步骤1后，取种胚，转移至固体MS培养基中，培养至种胚长出3-4片真叶。67个种胚可以完成本步骤，即实现了长出3-4片真叶。培养过程中，长出2片真叶的照片见图3的A，长出4片真叶的照片见图3的B。
3、取完成步骤2的种胚，切除子叶及下胚轴部分，然后转移至增殖培养基中进行培养，每培养20-30天继代一次(从基部切取丛生芽进行继代，均采用增殖培养基进行培养)。增殖培养基(pH5.8-6.0)：含6-BA 0.5mg/L、IAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7.0g/L，余量为水。
部分种胚可以正常分化并继代，培养过程第15天的照片见图4的A，培养第25天的照片见图4的B。
部分种胚不能正常分化并继代。部分种胚在分化或继代时表现为：生长势差、增殖速度较慢甚至不增殖、叶片黄化、叶片卷曲不够伸展等。示例性的，不能正常分化并继代的种胚的照片见图5。
67个种胚中，10个种胚可以正常分化并继代。
该10个种胚，每个种胚的继代后代为同一株系。
五、检测组培苗的基因型
步骤四中可以正常分化并继代的10个株系，分别取继代培养第25天的幼苗，拍照并检测基因型。
幼苗照片和基因型检测的电泳图见图6。
3个株系为R6R6基因型，分别命名为H1株系、H2株系或H3株系。
7个株系为R1R6基因型，分别命名为G1株系、G2株系、G3株系、G4株系、G5株系、G6株系或G7株系。
六、检测组培苗的叶片的总类黄酮含量
步骤四中可以正常分化并继代的10个株系，分别取继代培养第25天的幼苗，检测叶片总类黄酮含量。每个株系至少检测5株幼苗。
H1株系的叶片总类黄酮含量为(4480±19)mg/kg，H2株系的叶片总类黄酮含量为(4980±27)mg/kg，H3株系的叶片总类黄酮含量为(3890±19)mg/kg。G1株系的叶片总类黄酮含量为(2030±15)mg/kg，G2株系的叶片总类黄酮含量为(2830±20)mg/kg，G3株系的叶片总类黄酮含量为(2700±15)mg/kg，G4株系的叶片总类黄酮含量为(3250±31)mg/g，G5株系的叶片总类黄酮含量为(2560±18)mg/kg，G6株系的叶片总类黄酮含量为(4660±34)mg/kg，G7株系的叶片总类黄酮含量为(3040±25)mg/kg。即，10个株系均为红肉苹果。
七、生根培养
供试苗：步骤四中可以正常分化并继代的10个株系，继代培养第25天的幼苗。
1、将供试苗转移到生根培养基中，培养至根数量为10个以上(照片见图7)。
生根培养基(pH5.8-6.0)：含1/2MS培养基基盐((海博生物，货号HB8469-12)2.46g/L、蔗糖25g/L、植物凝胶2.4g/L、IAA 0.1mg/L，余量为水。
2、完成步骤1后，在温室中炼苗10-20天，然后移栽至培养基质(培养基质由1体积份蛭石和3体积份基肥混匀得到，基肥购自山东科尚生物科技有限公司)中，在温室里进行培养。培养20天的照片见图8。
10个株系的幼苗均可正常生根和生长。
实施例3、以MdMYB10基因为例验证是否可以作为有效的转基因受体材料
MdMYB10基因如序列表的序列5所示。
一、制备重组农杆菌
将序列表的序列5中第1-729位核苷酸所示的双链DNA分子插入pRI101载体的SalI和BamHI酶切位点之间，得到重组质粒。将重组质粒导入农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。
二、对红肉苹果组培苗进行农杆菌侵染转化
供试苗：实施例1中可以正常分化并继代的10个株系(H1株系、H2株系、H3株系、G1株系、G2株系、G3株系、G4株系、G5株系、G6株系或G7株系)，在增殖培养基中培养25天的幼苗。
1、切取供试苗顶端幼嫩的叶片，去除叶尖和叶柄部分，从叶片中间横切两至三刀，切断叶脉而使叶片边缘保持连接状态，将切好的叶片背面紧贴分化培养基，24℃黑暗培养2-3d。每株供试苗取3-5个叶片，每个株系共取40个叶片。
分化培养基：含2mg/L TDZ和0.2mg/L IAA的固体MS培养基。
2、取重组农杆菌，用无菌MS液体培养基悬浮，使OD600nm值为1.0，然后每30ml加入30μL乙酰丁香酮，即为浸染液。
3、取完成步骤1的叶片，浸没到浸染液中，160rpm振荡孵育30min，将侵染后的叶片用灭菌滤纸吸干，然后平铺到分化培养基中，24℃黑暗培养24-48h。
4、完成步骤3后，将叶片转移到到含有250mg/L羧卞青霉素的分化培养基中，24℃黑暗培养10-15天。培养7天时的照片见图9的A。可以观察到叶片形成愈伤组织。
H1株系，24个叶片上形成了愈伤组织。H2株系，21个叶片上形成了愈伤组织。H3株系，26个叶片上形成了愈伤组织。G1株系，40个叶片上形成了愈伤组织。G2株系，40个叶片上形成了愈伤组织。G3株系，38个叶片上形成了愈伤组织。G4株系，38个叶片上形成了愈伤组织。G5株系，39个叶片上形成了愈伤组织。G6株系，37个叶片上形成了愈伤组织。G7株系，39个叶片上形成了愈伤组织。
5、完成步骤4后，更换培养条件，培养至分化出丛生芽。本步骤采用如下培养条件：光强为120-150μmol m-2s-1，光周期为光照14h/黑暗10h，温度为24℃。
培养1个月的照片见图9的B，其中某个叶片的放大图见图9的C。
部分愈伤组织不能正常分化，即不能形成丛生芽。
H1株系，4个叶片上的愈伤组织可以形成丛生芽。H2株系，0个叶片上的愈伤组织可以形成丛生芽。H3株系，0个叶片上的愈伤组织可以形成丛生芽。G1株系，28个叶片上的愈伤组织可以形成丛生芽。G2株系，39个叶片上的愈伤组织可以形成丛生芽。G3株系，31个叶片上的愈伤组织可以形成丛生芽。G4株系，19个叶片上的愈伤组织可以形成丛生芽。G5株系，29个叶片上的愈伤组织可以形成丛生芽。G6株系，23个叶片上的愈伤组织可以形成丛生芽。G7株系，38个叶片上的愈伤组织可以形成丛生芽。
6、完成步骤5后，切取叶片上的丛生芽，然后转移至增殖培养基中进行培养，每25-30天继代一次(从基部切取丛生芽进行继代，均采用增殖培养基进行培养)，连续继代2-3次；将继代培养基上高度约为1-2cm的植株转移到筛选培养基中进行培养，部分植株死亡，部分植株可以正常生长。
每个丛生芽的继代后代作为一个遗传转化株系。
增殖培养基：含6-BA 0.5mg/L、IAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7.0g/L，余量为水。
筛选培养基：含50mg/L卡那霉素的增殖培养基。
在增殖培养基上培养25天的可以正常生长的植株的照片见图9的D。
死亡植株的示例性照片见图10。
统计不能通过筛选的遗传转化株系的数量，即死亡株系数量。
7、将可以在筛选培养基上正常生长10-15天的植株进行PCR鉴定，统计转化效率。
PCR鉴定的方法：取植株叶片，提取基因组DNA，采用35S-F1和MdMYB10-R1组成的引物对进行PCR扩增，如果具有扩增产物，为PCR鉴定阳性。
35S-F1：5'-TATCCTTCGCAAGACCCTT-3'；
MdMYB10-R1：5'-GGATCC TTCTTCTTTTGAATGATTCCAAAG-3'。
PCR鉴定为阳性的遗传转化株系又称为转基因株系。
统计转基因株系的数量。
转化率＝转基因株系的数量÷遗传转化株系总数量×100％。
结果见表1。
表1
遗传转化株系总数量 死亡株系数量 转基因株系的数量 转化率(％)
H1 12 12 0 0
H2 0 0 0 0
H3 0 0 0 0
G1 91 77 4 4.3
G2 136 114 10 7.35
G3 112 94 2 1.78
G4 67 44 3 4.47
G5 98 75 5 5.10
G6 58 54 0 0
G7 128 89 4 3.12
H2株系和H3株系作为受体材料进行遗传转化后只能生成愈伤组织，不能正常分化形成丛生芽(见图11)。
H1株系作为受体材料进行遗传转化后虽然能正常分化形成丛生芽但没有得到PCR鉴定阳性株系。
G6株系作为受体材料进行遗传转化后虽然能正常分化形成丛生芽但没有得到PCR鉴定阳性株系。
G2株系作为受体材料进行遗传转化后转化率高达7.35％，说明G2株系作为转基因受体材料具有极佳的优势。G2株系为受体材料得到的部分转基因株系的PCR鉴定结果见图12(每个泳道代表1个转基因株系)。
结果表明，相比于R6R6基因型，R1R6基因型的植株具有更大的基因编辑潜力，这可能是因为基因型为R6R6的株系更多遗传了它们的祖先品种“新疆野苹果”的基因，使得它们保持对外界刺激较强的抵抗能力。
三、MdMYB10基因表达量鉴定
供试植株：G2株系作为受体材料进行步骤二得到的转基因株系植株，G2株系植株。
提取在筛选培养基上正常生长10-15天的植株的总RNA，反转录得到cDNA；以cDNA为模板，采用MdMYB10-F2和MdMYB10-R2组成的引物对进行荧光定量PCR。
MdMYB10-F2：5'-AGACCAATGTGATAAGACCT-3'；
MdMYB10-R2：5'-AGTATCCTCGCCTTCTAAC-3'。
结果见图13。与G2株系植株相比，转基因株系植株中MdMYB10基因具有高表达性。
四、表型比较以及叶片的总类黄酮含量
供试植株：G2株系作为受体材料进行步骤二得到的转基因株系植株，G2株系植株。
供试植株在筛选培养基上正常生长10-15天的照片见图14。
与G2株系植株相比，转基因株系植株的叶片和茎秆颜色更红。
G2株系作为受体材料进行遗传转化后得到的10个转基因株系的叶片的总类黄酮含量依次为(5310±17)mg/kg、(5260±24)mg/kg、(4690±30)mg/kg、(5340±29)mg/kg、(4040±18)mg/kg、(4750±28)mg/kg、(4960±31)mg/kg、(5480±23)mg/kg、(5420±26)mg/kg、(4750±26)mg/kg。
以上结果表明，MdMYB10基因被成功转入到红肉苹果组培苗中，促进了类黄酮的合成与积累。
五、G2株系的保藏
G2株系，又命名为BCF2，全称为苹果(Malus sp.)BCF2，已于2020年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.20162。
实施例4、以PpMYB15基因为例验证是否可以作为有效的转基因受体材料序列表的序列6所示的PpMYB15基因，来源于桃子，在桃中能够促进类黄酮的积累。
一、制备重组农杆菌
将序列表的序列6中第1-1593位核苷酸所示的双链DNA分子插入pRI101载体的SalI和BamHI酶切位点之间，得到重组质粒。将重组质粒导入农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。
二、对红肉苹果组培苗进行农杆菌侵染转化
供试苗：实施例1中可以正常分化并继代的G2株系，在增殖培养基中培养25天的幼苗。
方法基本同实施例4的步骤二。
差异仅在于PCR鉴定采用的引物对。
35S-F1：5'-TATCCTTCGCAAGACCCTT-3'；
PpMYB15-R1：5'-AGACAGAAGCCAAGCCACCA-3'。
部分PCR鉴定结果见图15。
结果见表2。G2株系作为受体材料进行遗传转化后转化率高达6.19％，说明G2株系作为转基因受体材料具有极佳的优势。
表2PpMYB15基因在红肉苹果组培苗中转化效率
遗传转化株系总数量 死亡株系数量 转基因株系的数量 转化率(％)
113 89 7 6.19
三、基因表达量鉴定
供试植株：G2株系作为受体材料进行步骤二得到的转基因株系植株，G2株系植株。
提取在筛选培养基上正常生长10-15天的植株的总RNA，反转录得到cDNA；以cDNA为模板，采用PpMYB15-F2和PpMYB15-R2组成的引物对进行荧光定量PCR。
PpMYB15-F2：5'-TGGGAGGAGGGTACTTGTTCT-3'；
PpMYB15-R2：5'-GGTCCACGGCCTTTCTCATC-3'。
结果见图16。桃PpMYB15基因能在红肉苹果组培苗中高表达。
四、叶片的总类黄酮含量
供试植株：G2株系作为受体材料进行步骤二得到的转基因株系植株，G2株系植株。
G2株系作为受体材料进行遗传转化后得到的7个转基因株系的叶片的总类黄酮含量依次为(4240±24)mg/kg、(4130±18)mg/kg、(4750±22)mg/kg、(3870±25)mg/kg、(4460±18)mg/kg、(4660±23)mg/kg、(5040±29)mg/kg。
以上结果表明，PpMYB15基因被成功转入到红肉苹果组培苗中，促进了类黄酮的合成与积累。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> R1R6基因型苹果作为受体材料在制备红肉转基因苹果中的应用
<130> GNCYX210094
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaggggaat gaagaagagg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccacagaag caaacactga c 21
<210> 3
<211> 493
<212> DNA
<213> Malus sp.
<400> 3
ggaggggaat gaagaagagg gaaaaaaagg agagaatcct actccataaa ttacaagcaa 60
acactttttt tttttttttg acaagcagaa gcaaacaaac acttgaaaaa gcagcgaaag 120
catgataaag gtatcttatg gtggtcaaag atgtgtgttg taactagtta cacgattctg 180
cattcacatt catagaatgt gcttttgaat attatattac agctagagaa ttttatgccc 240
tgggattgat ttcccttgtc aatgttgtcg tgcagaaatg ttagactggt agctattaac 300
aagttagact ggttagactg gtagctatta acaagttaga ctggtagcta ttaacaactg 360
gtagctatta acaagttaga ctggtagcta ttaacaagtt agactgtgtg tgtgtgtgta 420
tttcacaagt tagactggta gctattaaca actgttggaa tgttttaaac ttgtcagtgt 480
ttgcttctgt gga 493
<210> 4
<211> 392
<212> DNA
<213> Malus sp.
<400> 4
ggaggggaat gaagaagagg gaaaaaaagg agagaatcct actccataaa ttacaagcaa 60
acactttttt tttttttttg acaagcagaa gcaaacaaac acttgaaaaa gcagcgaaag 120
catgataaag gtatcttatg gtggtcaaag atgtgtgttg taactagtta cacgattctg 180
cattcacatt catagaatgt gcttttgaat attatattac agctagagaa ttttatgccc 240
tgggattgat ttcccttgtc aatgttgtcg tgcagaaatg ttagcttttc tatatatcga 300
gtgtgtgtgt gtgtgtgtat ttcacaagtt agactggtag ctaataacaa ctgttggaat 360
gttttaaact tgtcagtgtt tgcttctgtg ga 392
<210> 5
<211> 732
<212> DNA
<213> Malus sp.
<400> 5
atggagggat ataacgaaaa cctgagtgtg agaaaaggtg cctggactcg agaggaagac 60
aatcttctca ggcagtgcgt tgagattcat ggagagggaa agtggaacca agtttcatac 120
aaagcaggct taaacaggtg caggaagagc tgcagacaaa gatggttaaa ctatctgaag 180
ccaaatatca agagaggaga ctttaaagag gatgaagtag atcttataat tagacttcac 240
aggcttttgg gaaacaggtg gtcattgatt gctagaagac ttccaggaag aacagcaaat 300
gctgtgaaaa attattggaa cactcgattg cggatcgatt ctcgcatgaa aacggtgaaa 360
aataaatctc aagaaatgag aaagaccaat gtgataagac ctcagcccca aaaattcaac 420
agaagttcat attacttaag cagtaaagaa ccaattctag accatattca atcagcagaa 480
gatttaagta cgccaccaca aacgtcgtcg tcaacaaaga atggaaatga ttggtgggag 540
accttgttag aaggcgagga tacttttgaa agagctgcat atcccagcat tgagttagag 600
gaagaactct tcacaagttt ttggtttgat gatcgactgt cgccaagatc atgcgccaat 660
tttcctgaag gacaaagtag aagtgaattc tcctttagca cggacctttg gaatcattca 720
aaagaagaat ag 732
<210> 6
<211> 1596
<212> DNA
<213> Amygdalus persica
<400> 6
atggggaggg cttcatgctg taacaagatt gggctgaaga aggggaggtg gacagcagag 60
gaggatcaaa tcttaatcaa ctatatccag accaatgggg aaggctcctg gaggtcatta 120
cccaagaatg cagggttact gcggtgtggt aaaagttgca gactaagatg gattaattat 180
ttgagagccg acttgaagag gggaaatata tctgcccaag aggaagatat catcatcaaa 240
ttgcatgctt ctctgggaaa taggtggtct ttgatagcaa gtcaattacc aggaagaacg 300
gataatgaaa tcaagaacta ctggaactct catttgagta ggaaaattga caccttcaga 360
aggcctacta ctactactag tgatcaaatg agtagcctac cagcagctgc tagtaataat 420
attccttcca agcgaagagg cggtagaacc agtcgctggg ccatgaagaa gagcaaaaca 480
tacaccacta ctcattctac taattatacc caacgtcaca acaagcgaca gaaggacatt 540
acaaatattg ctgctgatga tgatgaggcg attgccctgg agacgaagac gcccttgcct 600
gggcctaatg ataatattga tactatgcac cacgattaca tggtattaat gactgaccca 660
gttgctgatg atcatgatca tcatcctcat cacatggacg actgcagggt cgacaacctt 720
gttaatcatg atcatgatca tcagcggcag gaggaagcag gaggactagc aatgccagcg 780
gtcctcatga gctcaactac tactattact gaggaggagg aggaggaggt ggaggtggag 840
aagaaggaga ctcgtgatca tgatgggcta tgccctgtca atattgatca gtgtcagaag 900
gaaagtcacg aaatgctttt aggaccacat ccacataacg acgagaacaa ggacgatgac 960
ttggatgaat ctggcggcat tgaatttgat ggtgggttgt tgggtacatt taatgaattg 1020
attgacaatg ttgagttact gcagaaggat ccaaattcaa atggggtttt gactttaagt 1080
gaccatcaac atgatcatgc catgggcgtt actcatgagg tagatcaggt agagactact 1140
actacttgtg gtcatttgag ctcgtcatca aacgaacaag tatgcttttc ttcaataatg 1200
tcaatgactg ctacttcaag tagttcagct tcagcttcag cagctgctgg tagttattat 1260
tttgatatgg aggatggtca agctgctgct gctgcaaatg gaaatgatcg tgatcataac 1320
aatcatatat tatgggattg ggagagtgtt gtcgaagcag ggcatgagtt atgggatcat 1380
gatgatgata aagaaaatat gctttcttgg ttgtgggagg agggtacttg ttcttcttct 1440
actactagta atactactgc tgctgctgct gctgcttcta ccattgatcg tcatcttaac 1500
tgggaaggag acactaccac tgatgataca tcgatgatga gaaaggccgt ggaccctgac 1560
aaacaaaatg cgatggtggc ttggcttctg tcttga 1596

Claims (3)

1.苹果(Malus sp.)BCF2作为受体材料在制备转基因苹果中的应用；苹果(Malus sp.)BCF2，其保藏登记号为CGMCC No.20162。
2.苹果(Malus sp.)BCF2作为转基因受体材料在苹果育种中的应用；苹果(Malus sp.)BCF2，其保藏登记号为CGMCC No.20162。
3.一种制备转基因苹果的方法，包括如下步骤：将苹果(Malus sp.)BCF2作为受体材料进行遗传转化，得到转基因苹果；苹果(Malus sp.)BCF2，其保藏登记号为CGMCC No.20162。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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IL181193A0 (en) * 2007-02-06 2007-07-04 Volcani Ct The State Of Israel Means and methods of producing fruits with high levels of anthocyanins and flavonols
CN105359963B (zh) * 2015-12-04 2017-05-24 山东农业大学 一种易着色苹果品种培育法
CN106480163B (zh) * 2016-10-19 2019-11-01 山东农业大学 一种联合苹果愈伤组织细胞培养和遗传转化鉴定苹果抗病基因的方法
CN106718835B (zh) * 2016-12-12 2018-04-24 山东农业大学 高类黄酮优异种质‘csr6r6-777’在功能型苹果育种中的应用

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