CN112813139A - 用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法 - Google Patents

用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112813139A
CN112813139A CN202110187693.XA CN202110187693A CN112813139A CN 112813139 A CN112813139 A CN 112813139A CN 202110187693 A CN202110187693 A CN 202110187693A CN 112813139 A CN112813139 A CN 112813139A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
nucleic acid
feed additive
throughput sequencing
microbial feed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110187693.XA
Other languages
English (en)
Inventor
饶正华
李明
孟庆石
冯潇慧
刘娜
焦京琳
谢秀兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Science of CAAS
Original Assignee
Institute of Animal Science of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Animal Science of CAAS filed Critical Institute of Animal Science of CAAS
Priority to CN202110187693.XA priority Critical patent/CN112813139A/zh
Publication of CN112813139A publication Critical patent/CN112813139A/zh
Priority to CN202111555975.7A priority patent/CN114214390B/zh
Priority to CN202111554053.4A priority patent/CN113981042B/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于农业技术领域，具体涉及用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法。本发明用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，包括以下步骤：取样品后进行清洗；裂解样品中的微生物；去除样品中的RNA；去除样品中的蛋白质；吸附DNA，进行清洗。本发明方法提取微生物饲料添加剂得到的核酸纯度高、完整度高,可用于后续的高通量测序分析。

Description

用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法。
背景技术
在全面禁止使用抗生素的背景下，我国药物饲料添加剂将在2020年全部退出，微生物饲料添加剂是抗生素的最佳替代品。然而，微生物饲料添加剂产品普遍存在如下安全问题：(1)产品中功能菌比例不高，含有杂菌、甚至致病菌；(2)菌种(甚至是菌属)标识错误；(3)功能菌含有耐药基因；(4)功能菌含有毒力基因；(5)功能菌在生产过程中发生突变、退化，失去原有功效。
现有技术评估微生物饲料添加剂安全性方法尚未成熟，传统的检测手段存在劳动量大、效率低、准确度差、通量不高等缺点。因此，建立轻松、高效、精准、高通的评估方法，迫在眉睫。
高通量测序作为新一代测序技术，能够有效评估上述微生物饲料添加剂产品的安全问题，从而为微生物饲料添加剂市场的规范和管理提供保障。然而，由于微生物饲料添加剂的组成成分比较复杂，其中包括大量的宿主DNA、蛋白质、多糖、脂质、无机盐等，建立高通量测序方法首先面临的棘手问题是饲料中微生物核酸的提取。
现有的核酸提取方法主要是针对土壤、动物、植物、微生物等样品建立的通用方法。面对微生物饲料添加剂这种复杂基质无法获得纯度高、完整度高的核酸，不能满足后续的高通量测序的建库要求。现有技术所使用的微生物饲料添加剂的核酸提取方法多为进口试剂盒，而试剂盒提取的效果差，样品无法进行测序分析，限制了微生物饲料添加剂安全性的评估，大大阻碍了该市场的管理和行业发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，包括以下步骤：
(1)取样品，用TE缓冲液清洗样品；
(2)裂解样品中的微生物；
(3)向步骤(2)所得的样品中加入核糖核酸酶，去除样品中的RNA；
(4)向步骤(3)所得的样品中加入蛋白酶，去除样品中的蛋白质；
(5)向步骤(4)所得样品中加入磁珠混合液，吸附细菌DNA，其中，磁珠混合液包括磁珠和PEG，磁珠和PEG的体积比为1：1～4。
(6)清洗步骤(5)所得的DNA。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(1)中，用10×TE缓冲液清洗样品。
其中，TE缓冲液是Tris+EDTA缓冲液，10×TE缓冲液为TE缓冲液的10倍浓度液，试剂组成为Tris-HCl(100mM)，EDTA(10mM)，pH8.0。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(2)中，向步骤(1)所得样品中加入生理盐水，震荡悬起沉淀，再加入40～60mg/mL溶菌酶混匀，37℃反应0.5～4.5h后，离心，取上清液。
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(2)中，向收集的菌体中加入锆珠及裂解液，裂解样品中的微生物，样品与裂解液的体积比为1：3～7，所述裂解液的组成为包括1～5％SDS、0.5～10×TE缓冲液及0.3～3MNaCl，裂解液的pH为7.0～9.0。
量取锆珠的体积与样品体积相等，锆珠的终浓度为0.1g/mL-0.85g/mL。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(2)中加入裂解液后，进行研磨震荡，在65～75℃条件下裂解5～200min，离心，取上清液。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(3)中，向步骤(2)所得样品中加入1～5mg/mL核糖核酸酶，在36.5～37.5℃条件下孵育5分钟-12小时。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(4)中，向步骤(3)所得样品中加入1～5mg/mL蛋白酶K，在65～75℃条件下孵育5分钟-2小时。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(5)中，磁珠的终浓度为0.5～5mg/mL。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(6)中，依次使用70％乙醇、水进行清洗和洗脱。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(6)中，吸附得到的DNA中加入70％乙醇，清洗后，使用纯水，震荡悬浮磁珠，70℃孵育后，离心，磁吸附，即得。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(1)中，使用PCR管量取样品。
本发明的有益效果：
本发明的提取方法，使用TE缓冲液清洗微生物饲料添加剂样品中的游离DNA和杂质，使终产物的产量增加，并降低宿主DNA的污染；本发明的提取方法中核糖核酸酶和蛋白酶的使用量均较大，不但可以省去核酸沉淀、核酸洗涤等传统步骤，节约操作时间，而且能够得到更为纯净的总DNA；本发明的提取方法分别使用PCR管量取样品和磁珠，不但操作简单，而且称取量固定。
本发明方法提取得到的核酸纯度高、完整度高；可用于后续的高通量测序分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明方法DNA提取效果与市售试剂盒提取DNA的效果对比情况；
图2为不同样品中所含的耐药基因种类和个数情况；
图3为不同样品中所含的毒力基因种类和个数情况。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1提取饲料添加剂中的微生物核酸
1、PCR管取样品200μL，加入2mL管中；
2、向步骤(1)所得样品中加1mL 10xTE，研磨器震荡1min，对菌体进行清洗2次；向菌体中加入生理盐水，震荡悬起沉淀，再加入50mg/mL溶菌酶母液混匀，37℃反应1h后，离心，弃清液，收集菌体；
3、PCR管取锆珠200μL，加入样品中，再加入1mL裂解液，研磨器震荡3min；
4、70℃裂解15min，期间每隔5min颠倒6次；
5、13000g 4℃离心15min；
6、取上清到新的1.5mL管中，加入40μL RNase A 37℃孵育15min；
7、加入40μL蛋白酶K，70℃孵育10min，70℃孵育10min；
8、加入磁珠混合液(磁珠与40％PEG按照体积比为1:2混合)300μL，颠倒混匀后静置3-5min；
9、用磁力架磁吸附2-5min，倒掉液体；
10、加入70％乙醇700微升1mL，颠倒几次进行清洗，磁吸附1min，倒掉液体，清洗两次；
11、通风橱干燥4min；
12、加入100μL纯水，震荡悬浮磁珠，70℃孵育5min；
13、微离心后磁吸附1-3min，将液体转移到新的1.5mL管中。
上述方法中，
10x TE(pH 8.0)配制方法：200ML 500mM的Tris-HCl(pH 8.0)、100ML0.1M的EDTA(pH 8.0)，定容至1L。
裂解液的配制方法为：取1.2g SDS、4mL 10xTE、4mL 5M NaCl加入纯水32mL，即得。
加入RNase的终浓度为1～5mg/mL，可选浓度包括1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL，样品中加入RNase后，可在36.5、37或37.5℃条件下孵育5、10或15min,最多孵育12小时。
加入蛋白酶K的终浓度为1～5mg/mL，可选浓度包括1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL，样品中加入蛋白酶K后，可在65、70或75℃条件下孵育5、10或15min，最多孵育2小时。
磁珠和PEG的体积比为1:1～4，磁珠与PEG的体积比可选1:1、1:2、1:3或1:4，PEG的浓度可选为30％、35％、40％、45％或50％。
磁珠的终浓度为0.5～5mg/mL，磁珠的终浓度优选为0.5mg/mL、1mg/mL或1.5mg/mL,最多5mg/mL。
溶菌酶的浓度为40～60mg/mL，溶菌酶的终浓度优选为40mg/mL、40.5mg/mL、41mg/mL、41.5mg/mL、42mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL或60mg/mL。
实施例2
2.1对比本发明方法与现有试剂盒的效果
利用本发明实施例1的方法提取市售乳酸菌微生物饲料添加剂样本中的DNA，提取结果与DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit(QIAGEN)和FASTDNA TM Spin Kit for soil(MPbio)两款国外核酸提取试剂盒的比较。
结果如图1所示，相比Qiagen和MP核酸提取试剂盒，本发明方法提取的DNA，在大于2000bp的区域，均有明显的条带，说明本发明方法提取的核酸完整、纯净，适合用于高通量检测中DNA文库的构建。
2.2本发明方法提取DNA用于高通量检测
为了验证方法的可靠性，本发明选取了市场上19个微生物饲料添加剂产品的分装样品，分别对每个样品进行了菌成分分析、耐药基因分析和毒力基因分析。
使用试剂盒
Figure BDA0002943690600000061
DNA Library Prep Kit V2
Figure BDA0002943690600000062
对提取的总DNA进行建库，大致过程如下。
1、室温解冻5×TTBL，上下颠倒混匀后备用。确认5×TS是否处于室温，并轻弹管壁确认有无沉淀。如有沉淀，37℃加热并涡旋振荡混匀，沉淀即可溶解。
2、在灭菌PCR管中配制如下反应体系：
Figure BDA0002943690600000063
3、使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
4、将反应管置于PCR仪中，运行如下反应程序：
Figure BDA0002943690600000064
5、片段化产物使用VAHTS DNA Clean Beads进行纯化
①涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads并吸取50μL至50μL片段化产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
②将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心移除上清。
③保持反应管始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
④重复步骤③，总计漂洗两次。
⑤保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。
⑥将反应管从磁力架上取出，加入26μL灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
⑦将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取24μL上清至新的灭菌PCR管中。
6、将PCR管置于冰上，配制如下反应体系：
试剂盒货号 TD501 TD502/TD503
ddH<sub>2</sub>O ------ 4μL
步骤09-1产物 24μL 25μL
5×TAB 10μL 10μL
PPM 5μL ------
N5XX* 5μL 5μL
N7XX* 5μL 5μL
TAE 1μL 1μL
7、使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管置于PCR仪中，运行如下反应程序：
Figure BDA0002943690600000071
8、涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads并吸取30.0μL体积至50μL PCR产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
9、将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心转移上清至新的灭菌PCR管中，丢弃磁珠。
10、涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads并吸取7.5μL体积至上清中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
11、将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心移除上清。
12、保持反应管始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30sec，小心移除上清。
13、重复步骤5，总计漂洗两次。
14、保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠约5min。
15、将反应管从磁力架上取出，加入22μL灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
16、将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取20μL上清至新的灭菌PCR管中，-20℃保存。
通过高通量分析，19个微生物饲料添加剂产品的分装样品的菌成分分析结果见表1：
表1 19个微生物饲料添加剂的菌成分分析结果
Figure BDA0002943690600000081
Figure BDA0002943690600000091
Figure BDA0002943690600000101
如表1所示，本发明的核酸提取方法得到的DNA完整、纯净可以用于高通量检测，不但可以获得功能菌的含量，对于添加剂中的含量较少的杂菌也检出。
2.3分析微生物饲料添加剂产品中耐药基因
在实施例2.2对19个样品进行了菌成分分析的基础上，进一步进行样品中耐药基因的检测，具体步骤如下：
(1)过滤数据：利用fastp或Soapnuke对数据进行过滤，删除N碱基含量超过10％或Q值小于5的碱基超过50％的序列。
(2)序列拼接：利用megahit对过滤后的数据进行序列拼接；
(3)耐药基因的分析：利用abricate程序和CARD或Resfinder数据库分析组装后数据中的毒力基因。
毒力分析结果见表2：
表2不同样品中所含的抗性基因种类和个数
Figure BDA0002943690600000102
Figure BDA0002943690600000111
如图2所示，实施例2.2中所有样品包含的全部耐药基因共有16大类，分别为Aminocoumarins(氨基香豆素类)、Aminoglycosides(氨基糖苷类)、Bacitracin(杆菌肽)、betalactams(β内酰胺类)、Cationic antimicrobial peptides(阳离子抗菌肽类)、Elfamycins、Fluoroquinolones(氟喹诺酮类)、Fosfomycin(磷霉素)、Lipopeptides(脂肽类)、MLS、Multi-drug resistance(多药抗性)、Phenicol(苯丙醇)、Rifampin(利福平)、Sulfonamides(磺胺类)、Tetracyclines(四环素类)、Tunicamycin(衣霉素)。
样品1和样品9含有的耐药性基因较多，数目分别为46和57，说明安全性很差。而样品10和样品16并未检出任何耐药基因，说明安全性较好。利用本发明方法提取微生物饲料添加中的DNA后，利用高通量测序技术进行分析，可有效评价不同样品中耐药基因的风险性，而且区分度好，克服了传统方法工作量大、通量和效率不高等缺点。
2.4分析微生物饲料添加剂产品中毒力基因
在实施例2.2对19个样品进行了菌成分分析的基础上，进一步进行样品中毒力基因的检测，具体步骤如下：
(1)数据的过滤：利用fastp或Soapnuke对数据进行过滤，删除N碱基含量超过10％或Q值小于5的碱基超过50％的序列；
(2)序列拼接：利用megahit对过滤后的数据进行序列拼接；
(3)毒力基因的分析：利用abricate程序和VFDB数据库分析组装后数据中的毒力基因。
如图3所示，不同样品包含毒力基因总数目差异很大，如样品18和样品19，所含的毒力基因均在150以上，说明其对应的产品安全性很差，而样品10和11并未检出任何毒力基因，说明安全性较好。
因此，利用本发明方法提取微生物饲料添加中的DNA后，再利用高通量测序技术进行分析，可有效评价不同样品中毒力基因的风险性，而且区分度好，克服了传统方法工作量大、通量和效率不高等缺点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)取样品，用TE缓冲液清洗样品；
(2)裂解样品中的微生物；
(3)向步骤(2)所得的样品中加入核糖核酸酶，去除样品中的RNA；
(4)向步骤(3)所得的样品中加入蛋白酶，去除样品中的蛋白质；
(5)向步骤(4)所得样品中加入磁珠混合液，吸附细菌DNA，其中，磁珠混合液包括磁珠和PEG，磁珠与PEG的体积比为1：1～4。
(6)清洗步骤(5)所得的DNA。
2.根据权利要求1所述的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，其特征在于，步骤(1)中，用10×TE缓冲液清洗样品。
3.根据权利要求1所述的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，其特征在于，步骤(2)中，向步骤(1)所得样品中加入生理盐水，震荡悬起沉淀，再加入40～60mg/mL溶菌酶混匀，37℃反应0.5～4.5h后，离心，弃清液，收集菌体。
4.根据权利要求3所述的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，其特征在于，步骤(2)中，向收集的菌体中加入锆珠及裂解液，裂解样品中的微生物，其中，样品与裂解液的体积比为1：3～7，所述裂解液的组成为包括1～5％SDS、0.5～10×TE缓冲液及0.3～3M NaCl，裂解液的pH为7.0～9.0。
5.根据权利要求4所述的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，其特征在于，步骤(2)中加入裂解液后，进行研磨震荡，在65～75℃条件下裂解5～200min，离心，取上清液。
6.根据权利要求1所述的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，其特征在于，步骤(3)中，向步骤(2)所得样品中加入终浓度为1～5mg/mL核糖核酸酶，在36.5～37.5℃条件下孵育5分钟-12小时。
7.根据权利要求1所述的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，其特征在于，步骤(4)中，向步骤(3)所得样品中加入终浓度1～5mg/mL蛋白酶K，在65～75℃条件下孵育5分钟-2小时。
8.根据权利要求1所述的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，其特征在于，步骤(5)中，磁珠的终浓度为0.5～5mg/mL。
9.根据权利要求1所述的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，其特征在于，步骤(6)中，依次使用70％乙醇、水对提取的核酸进行清洗和洗脱。
10.根据权利要求1所述的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，其特征在于，步骤(1)中，使用PCR管量取样品，量取样品的体积为200μL。
CN202110187693.XA 2021-02-18 2021-02-18 用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法 Pending CN112813139A (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110187693.XA CN112813139A (zh) 2021-02-18 2021-02-18 用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法
CN202111555975.7A CN114214390B (zh) 2021-02-18 2021-12-17 用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法
CN202111554053.4A CN113981042B (zh) 2021-02-18 2021-12-17 饲用微生物产品中菌种及风险基因的高通量检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110187693.XA CN112813139A (zh) 2021-02-18 2021-02-18 用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112813139A true CN112813139A (zh) 2021-05-18

Family

ID=75865539

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110187693.XA Pending CN112813139A (zh) 2021-02-18 2021-02-18 用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法
CN202111554053.4A Active CN113981042B (zh) 2021-02-18 2021-12-17 饲用微生物产品中菌种及风险基因的高通量检测方法
CN202111555975.7A Active CN114214390B (zh) 2021-02-18 2021-12-17 用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111554053.4A Active CN113981042B (zh) 2021-02-18 2021-12-17 饲用微生物产品中菌种及风险基因的高通量检测方法
CN202111555975.7A Active CN114214390B (zh) 2021-02-18 2021-12-17 用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (3) CN112813139A (zh)

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050048515A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-03 Garner Bryan E. Methods for detecting and quantifying specific probiotic microorganisms in animal feed
CN101824450A (zh) * 2010-04-23 2010-09-08 北京博迈世纪生物技术有限公司 基于磁珠提取细菌基因组试剂盒及其提取方法
CN103667509B (zh) * 2012-12-11 2016-05-18 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 检测食品中乳酸菌的方法及检测用引物
US11359249B2 (en) * 2014-05-06 2022-06-14 Is-Diagnostics Ltd Microbial population analysis
CN104997813B (zh) * 2015-06-26 2019-03-08 东南大学 益生微生态制剂的制备方法
CN106591284A (zh) * 2015-10-16 2017-04-26 中国检验检疫科学研究院 一种食品中常见病原菌基因组快速提取试剂盒及方法
CN105331722B (zh) * 2015-11-30 2019-02-22 武汉轻工大学 用于饲料中添加的屎肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用
CN106701912A (zh) * 2016-09-30 2017-05-24 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 一种Illumina Miseq测序平台检测奶粉中的益生菌的方法
CN106591458A (zh) * 2016-12-23 2017-04-26 深圳市前海金卓生物技术有限公司 生物饲料活性度的评价方法
CN107653306B (zh) * 2017-11-13 2020-05-08 江南大学 一种基于高通量测序的双歧杆菌快速检测方法及应用
CN111378646A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 北京贝瑞和康生物技术有限公司 一种快速单反应管提取长片段基因组dna的方法和试剂盒
US11851644B2 (en) * 2019-05-02 2023-12-26 University Of Rhode Island Board Of Trustees Marine bacteria formulation useful in aquaculture
CN111676214A (zh) * 2020-06-12 2020-09-18 河南金泰生物技术股份有限公司 一种磁珠法提取细菌基因组dna的试剂盒及提取方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114214390A (zh) 2022-03-22
CN114214390B (zh) 2024-04-02
CN113981042B (zh) 2024-09-10
CN113981042A (zh) 2022-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108624586B (zh) 一种核酸提取试剂盒及其应用方法
CN108624651B (zh) 一种构建Ribo-seq测序文库的方法
CN113151397A (zh) 一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒
CN110438199A (zh) 一种新型病原微生物检测的方法
CN101712953A (zh) 用于评价动物肠道微生物群落多样性的dna提取方法
CN111705053A (zh) 一种快速提取细菌dna的试剂盒及提取方法
CN112481254B (zh) 一步法去宿主dna并富集微生物的方法及试剂盒
CN109913445B (zh) 一步洗涤磁珠法血液dna提取试剂盒
EP3277809B1 (en) Isolation of nucleic acids
CN110938624A (zh) 一种用于基因组dna提取的试剂盒及其应用
CN112941067A (zh) 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
CN113564227A (zh) 基于CRISPR/dcas9的宿主与病原微生物DNA快速分离方法
CN111518869B (zh) 一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法及在高通量测序中的应用
CN112813139A (zh) 用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法
CN113308459A (zh) 一种磁珠法全血核酸提取裂解液、试剂盒及提取方法
CN114591945B (zh) Dna病毒核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用
CN111484976A (zh) 肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测系统
CN112852938B (zh) 一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用
CN107354233A (zh) 鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物、应用及鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的方法
CN111172159A (zh) 一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒
CN116926065B (zh) 一种适用于病原微生物和宿主残留检测的核酸提取试剂盒及其提取方法
CN111778237A (zh) 一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系
CN116162690B (zh) 一管式靶向高通量测序方法
CN111455021B (zh) 去除宏基因组中宿主dna的方法及试剂盒
CN109439658A (zh) 一种裂解液及其在液态奶中提取核酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20210518