CN112808254B - 一种农药比率荧光分子印迹聚合微球的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种农药比率荧光分子印迹聚合微球的制备方法，涉及生物功能材料技术领域。所述制备方法包括(a)制备碳量子点‑荧光纳米硅球，(b)制备β‑环糊精修饰的CdTe量子点：(c)制备比率荧光分子印迹聚合微球。本发明提供的制备方法得到的比率荧光分子印迹微球分散好、荧光产率高、尺寸形貌均一，对新烟碱农药具有特异性荧光响应，可以用于构建新烟碱类农药残留的高灵敏、高选择性快速检测。

Description

一种农药比率荧光分子印迹聚合微球的制备方法
技术领域
本发明涉及生物功能材料技术领域，尤其是涉及一种农药比率荧光分子印迹聚合微球的制备方法。
背景技术
分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers,MIPs)是一类对待测分子具有特异识别和选择吸附性能的高分子材料。与生物识别分子相比，MIPs作为识别单元具有稳定性好、制备方法简单、耐酸碱、易保存和选择性高等优点，可代替抗体、酶及核酸适配体对目标物进行仿生识别。表面分子印迹技术是将MIPs修饰在特定载体表面，有利于模板分子的去除和再结合，可提高MIPs的识别性能和传质速率，解决传统MIPs活性位点多包埋在内部、模板洗脱不完全、传质速率差等问题。鉴于抗体、酶和适配体等制备周期长、难度大，稳定性差，识别种类单一，本研究跳出现有新烟碱快检技术过度依赖生物分子的局限，利用表面分子印迹代替生物分子对新烟碱类农药进行快速特异识别，降低基质干扰，提高检测稳定性和灵敏度，对完善蔬菜中新烟碱类农药残留检测技术的建立具有重要的研究意义和应用价值。
以量子点为载体和荧光信号单元，在其表面进行印迹聚合得到的量子点印迹聚合物(QDs-MIPs)既具有表面分子印迹的优点，也兼具了量子点高灵敏度和高选择的传感特性，将识别单元和信号输出单元进行高效集成，具有重要的研究意义及广泛应用前景。QDs-MIPs作为识别单元特异结合目标物时，目标分子与印迹活性位点间的互作识别作用会引起量子点荧光强度的变化，且其浓度与量子点的荧光强度呈一定的相关关系，通过监测荧光信号变化可实现对待测物的定量检测。
比率荧光分子具有对目标物响应的荧光基团和参比发色荧光基团，可采用多种方式将两者组合在一起。在使用中，通过测量不同波长处的荧光强度，将其比值作为信号参量。比率荧光技术可以克服荧光分析法的缺点，采用比率荧光分子进行检测，可以减少背景的干扰，应用更加广泛。研发合适的农药比率荧光分子印迹聚合微球，使得能够精确的检测农药分子是重要的发展方向之一。
基于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种农药比率荧光分子印迹聚合微球的制备方法，本发明提供的制备方法得到的比率荧光分子印迹微球分散好、荧光产率高、尺寸形貌均一，对新烟碱农药具有特异性荧光响应，可以用于构建新烟碱类农药残留的高灵敏、高选择性快速检测。
本发明的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了一种农药比率荧光分子印迹聚合微球的制备方法，所述方法包括：
(a)制备碳量子点-荧光纳米硅球：
将碳量子点溶液分散到乙醇和水的混合溶液中，依次加入氨水和正硅酸乙酯，室温下反应10-14小时；然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温继续反应10-14小时，得到碳量子点-荧光纳米硅球；经离心、洗涤、干燥；
(b)制备β-环糊精修饰的CdTe量子点：
将CdTe量子点溶液和高纯水一起超声分散，然后加入巯基β-环糊精，常温磁力搅拌下反应3-5小时；离心、洗涤、分散在纯水中得到β-环糊精-CdTe QDs溶液；
(c)制备比率荧光分子印迹聚合微球：
将步骤(a)得到的碳量子点-荧光纳米硅球分散到无水乙醇中，加入步骤(b)的β-环糊精-CdTe QDs溶液，振荡吸附，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷和含有啶虫脒和噻虫嗪的甲醇溶液，磁力搅拌下反应1-3小时，最后依次加入正硅酸乙酯和氨水，继续磁力搅拌下反应20-25小时；
使用无水乙醇和纯水交替洗涤，然后使用氨水-甲醇溶液对分子印迹聚合微球进行洗涤，直到洗涤液中没有模板分子检出为止，得到比率荧光分子印迹聚合微球。
在步骤(a)中，通过溶胶-凝胶法将二氧化硅壳层包覆在碳量子点纳米颗粒表面，得到荧光纳米硅球。
在步骤(b)中，利用巯基官能团-金属颗粒间化学接枝法，在CdTe QDs表面修饰上β-环糊精分子。
在步骤(c)中，通过静电自组装和物理吸附作用，将β-CD-CdTe QDs装载到荧光纳米硅球表面，制备得到比率荧光纳米颗粒。
本发明的技术方案以啶虫脒和噻虫嗪为双模板分子，以比率荧光纳米颗粒为载体，采用表面印迹法合成新烟碱农药比率荧光分子印迹聚合微球。
在一个实施方案中，步骤(a)中，所述碳量子点溶液的浓度为3.5-8μmol/L；碳量子点溶液、乙醇、水的体积比为1：225：90-225。
所述氨水的质量分数为25-30％，优选28％；所述氨水的体积为碳量子点溶液体积的1/2至2.5倍；
所述正硅酸乙酯的体积为碳量子点溶液体积的1/10至2/5；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积为碳量子点溶液体积的1-4倍。
在一个实施方案中，步骤(a)中，所述离心为8000-12000r/min离心；优选10000r/min离心；
所述洗涤采用无水乙醇和纯水交替洗涤3-5次，优选3次；
所述干燥为58-65℃真空干燥10-14小时，优选60℃真空干燥12小时。
本发明用3-氨丙基三乙氧基硅烷对碳量子点氨基功能化，使其作为参比发色荧光基团。
在一个实施方案中，步骤(b)中，所述CdTe量子点溶液的浓度为2.0-6.5μmol/L。
所述CdTe(碲化镉)量子点溶液与高纯水的体积比为1：50-90；
每0.1mL CdTe量子点溶液加入的所述巯基β-环糊精的质量为8-30mg；
所述离心为12000-18000r/min离心；优选15000r/min离心；
将每0.1mL CdTe量子点溶液制备得到的β-环糊精修饰的CdTe量子点分散于3-8mL，优选5mL纯水中。
β-CD-CdTe QDs(β-环糊精-CdTe QDs)为本发明比率荧光分子印迹聚合微球的主要荧光团，即响应的荧光基团。
在一个实施方案中，步骤(c)中，按照每10mL无水乙醇0.1-0.35g碳量子点-荧光纳米硅球的比例，将所述碳量子点-荧光纳米硅球分散到无水乙醇中；加入的β-环糊精-CdTeQDs溶液的体积为无水乙醇体积的1/3-1/4，优选1/2；
在一个实施方案中，步骤(c)中，所述无水乙醇与所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为10：0.01-0.045；
所述无水乙醇与含有啶虫脒和噻虫嗪的甲醇溶液的体积比为1：0.5。
在一个实施方案中，步骤(c)中，所述氨水的质量分数为25-30％，优选28％；所述氨水的体积与所述无水乙醇的体积比为10：0.05-0.25；所述正硅酸乙酯的体积与所述无水乙醇的体积比为10：0.05-0.25。
在一个实施方案中，所述啶虫脒摩尔质量：0.03mM-0.15mM；噻虫嗪摩尔质量：0.06mM-0.3mM。
本发明将碳量子点包覆于二氧化硅壳层中，分子印迹中的β-CD-CdTe QDs(β-环糊精-CdTe QD)与农药分子相互作用，引起β-CD-CdTe QDs荧光强度的变化(增强或者猝灭)。两者可构成比率荧光探针对目标农药进行定量检测，并且两个不同波长处的荧光强度将会受到外界实验条件的同样影响，其比值能够抵消误差，降低干扰，得到更准确的荧光速测结果。
检测过程中，当比率荧光分子印迹聚合微球与农药分子后结合，引起β-环糊精-CdTe QD量子点荧光改变，碳量子点荧光几乎不变；通过构建硅量子点与碳量子点荧光发射峰强度比率与农药分子摩尔浓二度之间的线性关系进行检测结果分析。
有益效果：
本发明提供的基于量子点比率荧光的分子印迹聚合微球的制备方法所制备出的聚合微球稳定性好，具有与2种农药分子相符合的空穴，可以特异性识别啶虫脒和噻虫嗪，可实现对2种农药分子进行高灵敏度检测，降低了检测成本。
利用本发明的分子印迹聚合微球进行检测，检测更加快速、简便。
本发明基于双波长比率荧光测定可排除外界环境条件、光稳定性等因素的干扰，检测的精密度与灵敏度更高。该方法制备的比率荧光分子印迹微球分散好、荧光产率高、尺寸形貌均一，对新烟碱农药具有特异性荧光响应，可以用于构建新烟碱类农药多残留的高灵敏、高选择性快速检测，为农药残留监测监管和速测试剂国产化提供技术支撑。
本发明跳出现有新烟碱快检技术过度依赖生物分子的局限，利用表面分子印迹代替生物分子对新烟碱类农药进行快速特异识别，降低基质干扰，提高检测稳定性和灵敏度，对完善蔬菜中新烟碱类农药残留检测技术的建立具有重要的研究意义和应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的新烟碱农药比率荧光分子印迹微球制备原理图；
图2为本发明碳量子点-荧光纳米硅球的TEM图；
图3为本发明比率荧光分子印迹聚合微球的TEM图；
图4为本发明比率荧光分子印迹聚合微球的粒径分布图；
图5为本发明比率荧光分子印迹微球的荧光发射光谱；
图6为本发明荧光微球对不同浓度噻虫嗪农药的荧光响应结果图；
图7为不添加模板分子的非印迹聚合微球与本发明添加模板分子的印迹聚合微球的检测效果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、制备碳量子点-荧光纳米硅球：
将0.1mL碳量子点溶液(碳量子点浓度：5μmol/L)分散到45ml乙醇/水混合溶液(乙醇/水体积比：1：0.5)中，依次加入0.15mL氨水(质量分数28％)、0.015mL TEOS(正硅酸乙酯)，室温下反应12小时；然后加入0.15mL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，室温继续反应12h，得到碳量子点-荧光纳米硅球；10000r/min高速离心，使用无水乙醇和纯水(每次洗涤所用无水乙醇和超纯水体积比为1:1.5)交替洗涤三次，60℃真空干燥12h。
二、制备β-CD-CdTe QDs：
将0.1mL CdTe QDs(浓度：3.5μmol/L)和一定体积的高纯水(8mL)加入到磨口锥形瓶中超声分散0.5h，然后加入巯基β-CD(20mg)，常温磁力搅拌下反应4h；15000r/min高速离心后使用无水乙醇和纯水交替洗涤三次，得到的β-CD-CdTe QDs，分散在5mL纯水中待用。
三、制备比率荧光分子印迹聚合微球：
碳量子点-荧光纳米硅球(0.2g)分散到10ml无水乙醇中，加入5mL的β-CD-CdTeQDs溶液，振荡吸附1h，然后加入APTES(0.02mL)和5mL含有啶虫脒和噻虫嗪的甲醇溶液(啶虫脒摩尔质量：0.08mM；噻虫嗪摩尔质量：0.24mM)，磁力搅拌下反应2h，最好依次加入0.1mLTEOS和0.1mL氨水(质量分数28％)，继续磁力搅拌下反应24h，磁分离后使用使用无水乙醇和纯水交替洗涤三次，使用体积分数为10％的氨水-甲醇溶液对分子印迹聚合微球进行洗涤，直到洗涤液中没有模板分子检出为止，得到的比率荧光分子印迹聚合微球置于冷到干燥机干燥12h。
图1为本发明实施例提供的新烟碱农药比率荧光分子印迹微球制备原理图。
实施例2
一、制备碳量子点-荧光纳米硅球：
将0.1mL碳量子点溶液(碳量子点浓度：3.5μmol/L)分散到45ml乙醇/水混合溶液(乙醇/水体积比：1：1)中，依次加入0.05mL氨水(质量分数28％)、0.01mL TEOS(正硅酸乙酯)，室温下反应12小时；然后加入0.1mL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，室温继续反应12h，得到碳量子点-荧光纳米硅球；10000r/min高速离心，使用无水乙醇和纯水(每次洗涤所用无水乙醇和超纯水体积比为1：3)交替洗涤三次，60℃真空干燥12h。
二、制备β-CD-CdTe QDs：
将CdTe QDs(浓度：2.0μmol/L)和一定体积的高纯水(4mL)加入到磨口锥形瓶中超声分散0.5h，然后加入巯基β-CD(8mg)，常温磁力搅拌下反应4h；15000r/min高速离心后使用无水乙醇和纯水交替洗涤三次，得到的β-CD-CdTe QDs，分散在5mL纯水中待用。
三、制备比率荧光分子印迹聚合微球：
碳量子点-荧光纳米硅球(0.1g)分散到10ml无水乙醇中，加入5mL的β-CD-CdTeQDs溶液，振荡吸附1h，然后加入APTES(0.01mL)和5mL含有啶虫脒和噻虫嗪的甲醇溶液(啶虫脒摩尔质量：0.06mM；噻虫嗪摩尔质量：0.05mM)，磁力搅拌下反应2h，最好依次加入0.05mL TEOS和0.05mL氨水(质量分数28％)，继续磁力搅拌下反应24h，磁分离后使用使用无水乙醇和纯水交替洗涤三次，使用体积分数为10％的氨水-甲醇溶液对分子印迹聚合微球进行洗涤，直到洗涤液中没有模板分子检出为止，得到的比率荧光分子印迹聚合微球置于冷到干燥机干燥12h。
实施例3
一、制备碳量子点-荧光纳米硅球：
将0.1mL碳量子点溶液(碳量子点浓度：8μmol/L)分散到45ml乙醇/水混合溶液(乙醇/水体积比：1：0.4)中，依次加入0.25mL氨水(质量分数28％)、0.04mL TEOS(正硅酸乙酯)，室温下反应12小时；然后加入0.4mL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，室温继续反应12h，得到碳量子点-荧光纳米硅球；10000r/min高速离心，使用无水乙醇和纯水(每次洗涤所用无水乙醇和超纯水体积比为1：1)交替洗涤三次，60℃真空干燥12h。
二、制备β-CD-CdTe QDs：
将CdTe QDs(浓度：6.5μmol/L)和一定体积的高纯水(15mL)加入到磨口锥形瓶中超声分散0.5h，然后加入巯基β-CD(30mg)，常温磁力搅拌下反应4h；15000r/min高速离心后使用无水乙醇和纯水交替洗涤三次，得到的β-CD-CdTe QDs，分散在5mL纯水中待用。
三、制备比率荧光分子印迹聚合微球：
碳量子点-荧光纳米硅球(0.35g)分散到10ml无水乙醇中，加入5mL的β-CD-CdTeQDs溶液，振荡吸附1h，然后加入APTES(0.045mL)和5mL含有啶虫脒和噻虫嗪的甲醇溶液(啶虫脒摩尔质量：0.15mM；噻虫嗪摩尔质量：0.3mM)，磁力搅拌下反应2h，最好依次加入0.25mLTEOS和0.25mL氨水(质量分数28％)，继续磁力搅拌下反应24h，磁分离后使用使用无水乙醇和纯水交替洗涤三次，使用体积分数为10％的氨水-甲醇溶液对分子印迹聚合微球进行洗涤，直到洗涤液中没有模板分子检出为止，得到的比率荧光分子印迹聚合微球置于冷到干燥机干燥12h。
测试实施例
将实施例1制备的比率荧光分子印迹微球进行表征分析：
1.透射电镜观察
将所制备的比率荧光分子印迹微球通过透射电镜进行观察和测试，如图2所示，示出了实施例1碳量子点-荧光纳米硅球的TEM图；图3为实施例1比率荧光分子印迹聚合微球的TEM图。
本发明方法制备的比率荧光分子印迹微球分散好、荧光产率高、尺寸形貌均一，图4为本发明比率荧光分子印迹聚合微球的粒径分布图。
2.荧光发射光谱
将所制备的比率荧光分子印迹聚合微球通过荧光分光光度计进行测试，结果如图5所示(激发320nm，发射分别是430nm和575nm)。
图5为本发明比率荧光分子印迹微球的荧光发射光谱。
效果实施例
基于量子点比率荧光的分子印迹聚合微球对具体农药分子的检测的效果：
本发明荧光微球对不同浓度噻虫嗪农药的荧光响应结果图见图6。
其中a，b，c，e分别是指0ppm，0.1ppm，0.5ppm，1ppm，5ppm。
对比例
不添加模板分子的非印迹聚合微球与本发明添加模板分子的印迹聚合微球的检测效果见图7。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (14)

1.一种农药比率荧光分子印迹聚合微球的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)制备碳量子点-荧光纳米硅球：
将碳量子点溶液分散到乙醇和水的混合溶液中，依次加入氨水和正硅酸乙酯，室温下反应10-14小时；然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温继续反应10-14小时，得到碳量子点-荧光纳米硅球；经离心、洗涤、干燥；
(b)制备β-环糊精修饰的CdTe量子点：
将CdTe量子点溶液和高纯水一起超声分散，然后加入巯基β-环糊精，常温磁力搅拌下反应3-5小时；离心、洗涤、分散在纯水中得到β-环糊精-CdTe QDs溶液；
(c)制备比率荧光分子印迹聚合微球：
将步骤(a)得到的碳量子点-荧光纳米硅球分散到无水乙醇中，加入步骤(b)的β-环糊精-CdTe QDs溶液，振荡吸附，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷和含有啶虫脒和噻虫嗪的甲醇溶液，磁力搅拌下反应1-3小时，最后依次加入正硅酸乙酯和氨水，继续磁力搅拌下反应20-25小时；
使用无水乙醇和纯水交替洗涤，然后使用氨水-甲醇溶液对分子印迹聚合微球进行洗涤，直到洗涤液中没有模板分子检出为止，得到比率荧光分子印迹聚合微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述碳量子点溶液的浓度为3.5-8μmol/L；碳量子点溶液、乙醇、水的体积比为1：225：90-225；
所述氨水的质量分数为25-30％；所述氨水的体积为碳量子点溶液体积的1/2至2.5倍；
所述正硅酸乙酯的体积为碳量子点溶液体积的1/10至2/5；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积为碳量子点溶液体积的1-4倍。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氨水的质量分数为28％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述离心为8000-12000r/min离心；
所述洗涤采用无水乙醇和纯水交替洗涤3-5次；
所述干燥为58-65℃真空干燥10-14小时。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述离心为10000r/min离心；
所述洗涤采用无水乙醇和纯水交替洗涤3次；
所述干燥为60℃真空干燥12小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述CdTe量子点溶液的浓度为2.0-6.5μmol/L；
所述CdTe量子点溶液与高纯水的体积比为1：50-90；
每0.1mL CdTe量子点溶液加入的所述巯基β-环糊精的质量为8-30mg；
所述离心为12000-18000r/min离心；
将使用每0.1mL CdTe量子点溶液制备得到的β-环糊精修饰的CdTe量子点分散于3-8mL纯水中。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述离心为15000r/min离心。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，按照每10mL无水乙醇0.1-0.35g碳量子点-荧光纳米硅球的比例，将所述碳量子点-荧光纳米硅球分散到无水乙醇中；加入的β-环糊精-CdTe QDs溶液的体积为无水乙醇体积的1/3-1/4。
9.根据权利要求1或8所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，所述无水乙醇与所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为10：0.01-0.045；
所述无水乙醇与含有啶虫脒和噻虫嗪的甲醇溶液的体积比为1：0.5。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，所述氨水的质量分数为25-30％。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，所述氨水的质量分数为28％。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，所述氨水的体积与所述无水乙醇的体积比为10：0.05-0.25。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，所述正硅酸乙酯的体积与所述无水乙醇的体积比为10：0.05-0.25。
14.根据权利要求1或10所述的制备方法，其特征在于，所述啶虫脒摩尔浓度为：0.03mM-0.15mM；噻虫嗪摩尔浓度为：0.06mM-0.3mM。
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