CN113310589B - 一种比率型表面增强拉曼光谱纳米温度计、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种比率型表面增强拉曼光谱纳米温度计、其制备方法及其应用。该温度计为多层纳米结构，以金壳纳米颗粒作为基底材料，聚合物p(NIPAm‑co‑AAm)包裹层作为温敏响应材料，吸附金球纳米颗粒作为SERS探针层，选用4‑ATP和DTNB作为拉曼信号分子。温度的变化引发温敏聚合物体积变化，导致金球纳米颗粒与金壳纳米颗粒之间的距离发生变化，进而引起金球纳米颗粒表面修饰的4‑ATP的SERS信号发生变化。利用4‑ATP的SERS信号和金壳纳米颗粒表面修饰的DTNB的SERS信号的比率式信号I R （IR=I 1074 /I 1327 ）变化，实现对温度的传感，检测结果可靠、检测灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及微观温度计的制备，具体涉及一种用于细胞微环境温度传感的比率型表面增强拉曼光谱纳米温度计制备方法及其应用。
背景技术
体温的维持和调节与生物体内细胞的温度密切相关，细胞温度是体温在细胞水平上的微观体现，细胞内发生的无数生理化学反应引起的温度的改变直接决定了体温的变化趋势，例如细胞新陈代谢中的能量释放、转移和利用过程，包括遗传物质(DNA和RNA)以及蛋白质的合成、细胞的分裂、信号转导、肌肉收缩行为以及跨细胞膜的物质转运等等细胞活动都存在生理化学反应引起的温度变化。温度不仅是细胞生理过程中的热能变化的量度，而且温度还影响着许多细胞过程。即使在看似恒温的细胞环境中，轻微的温度变化也会影响基本的生理过程，如蛋白质折叠、钙信号传递、细胞膜扩散、酶催化等。因此，细胞内温度分析不仅可以加深对细胞各种事件的理解，而且可以在细胞水平上检测许多疾病，使其成为早期诊断工具从而推动新的诊断与治疗技术的发展。
表面增强拉曼散射(SERS)是一种高度灵敏的检测技术，它可以克服荧光检测的差的发光稳定性和容易的光漂白。然而，SERS传感技术在很大程度上依赖于SESR衬底的增强效应。不同粗糙度衬底的增强效果表现出显著差异，并且不同的测试参数(激光功率、聚焦度等)和待测样品的聚集程度都会导致测试结果产生显著差异。因此，现有的SERS传感器在信号输出稳定性、均一性方面存在不足，信号输出的可靠性与准确度方面有待提高。SERS传感器技术与比例信号输出系统的结合正好解决了上述问题。比例信号输出系统不仅可以提高检测灵敏度，而且还能消除实验条件造成的信号和背景干扰，提供更高的信噪比，从而使检测结果更加可靠。目前，已开发的适用于细胞微环境的高分辨率比率式SERS纳米温度计十分有限，严重限制细胞温度检测应用。
发明内容
发明目的：为了解决现有温度计无法高灵敏地测定细胞内微观尺度温度的问题，本发明的目的是提供一种用于细胞微环境温度传感的比率型表面增强拉曼光谱纳米温度计制备及应用方法，检测结果可靠、检测灵敏度高。为制备温敏纳米复合材料和微观温度监测提供了新的方法，为单细胞内温度监测提供了强大的工具。
为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：
比率型表面增强拉曼光谱纳米温度计，该比率式SERS纳米温度计为多层结构，以SERS活性的金壳纳米颗粒作为基底材料，聚合物p(NIPAm-co-AAm)包裹层作为温敏响应材料，进一步吸附金球纳米颗粒作为SERS探针层，选用对氨基苯硫酚(4-ATP)和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)作为拉曼信号分子，构建比率式SERS信号输出系统。
该比率式SERS纳米温度计工作机制为：温度的变化引发温敏聚合物体积变化，导致金球纳米颗粒与金壳纳米颗粒之间的距离发生变化，进而引起金球纳米颗粒表面修饰的4-ATP的SERS信号发生变化。利用4-ATP的SERS信号和金壳纳米颗粒表面修饰的DTNB的SERS信号的比率式信号IR(IR＝I1074/I1327)变化，实现对温度的传感。
比率型表面增强拉曼光谱纳米温度计的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、合成温敏聚合物修饰的金壳纳米颗粒(GSNPs@p(NIPAm-co-AAm))(参考文献：TANG等人Hybrid conjugated polymer-Ag@PNIPAM fluorescent nanoparticles withmetal-enhanced fluorescence(TANG F,MA N,WANG X,et al.Hybrid conjugatedpolymer-Ag@PNIPAM fluorescent nanoparticles with metal-enhanced fluorescence[J].Journal of Materials Chemistry,2011,21(42):16943-51.)：
(1)配置2mL水溶液，包含0.9mM NIPAm、0.156mM AAm(即NIPAm：AAm＝75：13)和9.7μM交联剂BIS以及43.35μM表面活性剂SDS；
(2)向混合液中加入表面修饰后的GSNPs@AAm胶体混匀，通过向混合液充氮气除氧，在PNIPAm的低临界共溶温度(LCST)之上(通常70℃左右)搅拌反应1h后，加入1mL含有27.4μM的APS溶液引发自由基聚合并充分搅拌反应4h。
(3)待反应结束，将混合液冷却至室温后离心(2500rpm，20min)清洗并重新分散在3mL超纯水中，获得表面包裹温敏聚合物p(NIPAm-co-AAm)层的GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)纳米颗粒。
步骤二、将拉曼分子5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)修饰到GSNPs表面空白位点上：
将步骤一得到的GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)与DTNB溶液混合，混匀仪中摇匀，将其修饰到GSNPs表面空白位点上，GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)与DTNB的浓度比为0.5mg/mL：1.0mmol/L，金壳纳米颗粒的体积为500μL，DTNB的体积为1-200μL。
步骤三、制备拉曼分子对氨基苯硫酚(4-ATP)修饰的金球纳米颗粒，并将金球纳米颗粒连接到GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)的表面，制备得到比率式SERS纳米温度计(SERSNTMs)。
其中金球纳米颗的制备方法(参考文献：Jana等人Seeding Growth for SizeControl of 5-40nm Diameter Gold Nanoparticles(Jana N R,Gearheart L,Murphy CJ.Seeding growth for size control of 5-40nm diameter gold nanoparticles[J].Langmuir,2001,17(22):6782-6786.)：
GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)与4-ATP混合反应的浓度比为0.5mg/mL：1.0mmol/L，GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)的体积为500μL，DTNB的体积为1-25μL。
上述比率型表面增强拉曼光谱纳米温度计，所使用的拉曼分子是但不仅限于DTNB和4-ATP。
上述比率型表面增强拉曼光谱纳米温度计的用于细胞微环境温度传感的应用，是将纳米温度计置于不同温度的环境，使用拉曼光谱仪采集不同温度下的SERS信号，分析信号强度与温度的关系，构建IR与温度的线性工作曲线。工作曲线构建设定的温度范围为25-45℃，信号采集间隔为1.0℃，通过提取4-ATP在1074cm-1特征峰的信号强度和DTNB在1327cm-1特征峰的信号强度，分析得到比率SERS信号IR(IR＝I1074/I1327)与温度的关系，构建IR与温度的线性工作曲线。
上述的应用，包括以下步骤：
(1)将得到的比率式SERS纳米温度计(SERS NTMs)与细胞共孵育后用缓冲液冲洗细胞，去除未被细胞摄入的SERS NTMs。
所述步骤(1)中的细胞是MCF-7细胞，悬浮密度≤104/mL，SERS NTMs纳米颗粒的浓度为1.0mg/mL，体积为10-100μL。
(2)使用显微拉曼光谱仪通过明场显微成像确定待分析目标细胞，使用显微拉曼光谱仪采集细胞内微区的SERS光谱。
信号采集测试参数为：激光功波长为633nm，物镜倍数为40倍，曝光时间为1-5s，叠加次数为1-5次，功率为10-100％。
(3)根据检测得到的SERS光谱，提取1074cm-1特征峰和1327cm-1特征峰的信号强度，计算比率SERS信号IR。
(4)根据计算得到的比率SERS信号IR，对照工作曲线，计算得到温度值。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明通过构建比率式信号输出系统，不仅可以消除激光功率、对焦程度等测试参数及样品聚集程度等实验条件引起的测试误差，而且还能排除细胞复杂微环境对信号输出造成的干扰，提供更高的信噪比，从而使检测结果更加可靠。
(2)该比率式SERS纳米温度计尺寸在纳米级，可实现细胞内温度变化的高灵敏、准确监测，在25-45℃范围内表现出良好的测温性能，温度分辨率为0.27℃，相对灵敏度为8.20％/℃，可作为探究生理过程和疾病治疗方面高效的单细胞温度传感工具。
附图说明
图1为本发明比率式SERS纳米温度计(SERS NTMs)制备的流程示意图；
图2为本发明实施例1所得比率式SERS纳米温度计的透射电镜图像；可见所得比率式SERS纳米温度计，尺寸为275.8nm，证实该温度计可用于纳米级尺度温度监测；
图3为实施例1的不同温度下SERS纳米温度计输出的SERS谱图及1074cm-1和1327cm-1处特征信号值，表明单一信号输出稳定性较差；
图4为实施例1的比率式SERS纳米温度计在不同聚集区域内信号输出的比较图谱；证明比率式输出系统的构建明显改善了不同聚集程度下的信号输出的稳定性；
图5为实施例1的比率式SERS纳米温度计在不同对焦深度下SERS信号的比率式输出结果的比较图谱；证实了比率式信号输出系统的策略能有效的排除对焦深度对测试结果的影响；
图6为实施例1的比率式SERS纳米温度计在不同激光能量下SERS信号的比率式输出结果的比较图谱；证实了该策略能显著降低由激光能量不同引起的测试不准确性；
图7为实施例2中构建的工作曲线和温度分辨率图谱；实施例2中构建的工作曲线和温度分辨率，结果显示温度计的量程为25-45℃，温度分辨率为0.27℃，表明该纳米温度计有一个较好的测温性能；
图8为实施案例3的CaCl2诱导细胞升温的MCF-7细胞的明场图像和温度-时间谱线。实施例3的CaCl2溶液诱导细胞升温的MCF-7细胞的明场图像和温度-时间谱线，表明SERS NTMs能监测细胞内微观的温度变化。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明的技术方案进行进一步的说明：
实施例1
一、制备SERS NTMs
步骤一、合成温敏聚合物修饰的金壳纳米颗粒(GSNPs@p(NIPAm-co-AAm))(参考文献：TANG等人Hybrid conjugated polymer-Ag@PNIPAM fluorescent nanoparticles withmetal-enhanced fluorescence(TANG F,MA N,WANG X,et al.Hybrid conjugatedpolymer-Ag@PNIPAM fluorescent nanoparticles with metal-enhanced fluorescence[J].Journal of Materials Chemistry,2011,21(42):16943-51.)：)
步骤二、将拉曼分子5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)修饰到GSNPs表面空白位点上：取GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)纳米颗粒500μL，添加50μL浓度为1.0M的DTNB溶液过夜混匀。
步骤三、制备拉曼分子对氨基苯硫酚(4-ATP)修饰的金球纳米颗粒，并将金球纳米颗粒连接到GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)的表面，制备得到比率式SERS纳米温度计(SERSNTMs)：步骤二所得产物，经过离心清洗后再加入25μL浓度为1.0mmol/L Au NPs-4ATP过夜混匀反应并通过离心清洗去除过量的未连接的小金球，最后，将得到的GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)NPs-4ATP纳米颗粒分散在3mL超纯水中，从而完成SERS NTMs的制备，流程如图1所示，获得颗粒的形貌如图2所示。
二、SERS NTMs的性能表征
(1)将500μL SERS NTMs胶体滴在干净的硅片上，通过组内自制温度控制平台调节纳米颗粒的温度，25-45℃范围内每间隔1℃采集SERS光谱，提取每条光谱中1074cm-1处4-ATP特征峰强度(I1074)和1327cm-1处DTNB特征峰强度(I1327)绘制图谱，如图3所示。
(2)将获得的SERS NTMs滴在干净的硅片上干燥，选取了不同的聚集区域进行了SERS测试(如图4所示)，测试参数为：激光功率为50％，曝光时间为1s，累积次数为1次。
(3)将(3)中获得的样品对一个选定的区域，采用同样的测试参数，调节不同的对焦深度并采集信号，测试结果如图5所示。
(4)将(3)中获得的样品对一个选定的区域，采用同样对焦程度，调节不同的激光能量，激光功率为1-100％，曝光时间为1-10s，测试结果如图6所示。
实施例2
将SERS NTMs胶体置于不同温度的环境，进行SERS信号采集，构建工作曲线：
(1)将500μL SERS NTMs胶体滴在干净的硅片上，通过组内自制温度控制平台调节纳米颗粒的温度，25-45℃范围内每间隔1℃采集SERS光谱。
(2)提取每条光谱中1074cm-1处4-ATP特征峰强度(I1074)和1327cm-1处DTNB特征峰强度(I1327)绘制了图谱。
(3)以(2)中两特征峰强度的比值(IR＝I1074/I1327)作为纵坐标，设置的实时温度为横坐标对其进行线性拟合，构建工作曲线，如图7所示。
实施例3
将SERS NTMs用于CaCl2诱导细胞升温监测：
(1)将接种的MCF-7细胞与浓度为1.0mg/mL的SERS NTMs胶体共孵育12h后，将共孵育的细胞用PBS缓冲液冲洗后，加入浓度为1-10μM的CaCl2的培养液，培育30min后加入对应浓度的离子霉素钙盐。
(2)使用显微拉曼光谱仪通过明场显微成像确定待分析目标细胞，使用显微拉曼光谱仪每间隔1min采集0-10min细胞内微区的SERS光谱，测试参数：激光功波长为633nm，物镜倍数为40倍，曝光时间为1-5s，叠加次数为1-5次，功率为10-100％。
(3)提取(2)中获得SERS光谱的在1074cm-1和1327cm-1特征峰的信号强度，计算得到比率SERS信号IR(IR＝I1074/I1327)，根据IR与温度的线性工作曲线计算对应的温度，如图8所示。
Claims (4)
1.一种比率式表面增强拉曼光谱纳米温度计，其特征在于，为多层结构，以SERS活性的金壳纳米颗粒作为基底材料，聚合物p(NIPAm-co-AAm)包裹层作为温敏响应材料，进一步吸附金球纳米颗粒作为SERS探针层，选用对氨基苯硫酚（4-ATP）和5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）作为拉曼信号分子，构建比率式SERS信号输出系统；
温度的变化引发温敏聚合物体积变化，导致金球纳米颗粒与金壳纳米颗粒之间的距离发生变化，进而引起金球纳米颗粒表面修饰的4-ATP的SERS信号发生变化；利用4-ATP的SERS信号和金壳纳米颗粒表面修饰的DTNB的SERS信号的比率式信号I R （I R =I 1074/I 1327）变化，实现对温度的传感。
2.权利要求1所述的一种比率式表面增强拉曼光谱纳米温度计的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成温敏聚合物修饰的金壳纳米颗粒GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)；
(2)将拉曼分子5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）修饰到GSNPs表面空白位点上；
所述步骤（2）中金壳纳米颗粒与DTNB的浓度比为0.5 mg/mL：1.0 mmol/L；
金壳纳米颗粒的体积为500 μL，DTNB的体积为1-200 μL；
(3)制备对氨基苯硫酚（4-ATP）修饰的金球纳米颗粒，并将金球纳米颗粒连接到GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)的表面，制备得到基于4-ATP和DTNB SERS信号的比率式SERS纳米温度计；
所述步骤（3）中GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)与4-ATP的浓度比为0.5 mg/mL：1.0 mmol/L，GSNPs@p(NIPAm-co-AAm)的体积为500 μL，DTNB的体积为1-25 μL。
3.权利要求1所述比率式表面增强拉曼光谱纳米温度计用于细胞微环境温度传感的应用，是将所得纳米温度计置于不同温度的环境，温度的变化引发温敏聚合物体积变化，导致金球纳米颗粒与金壳纳米颗粒之间的距离发生变化，进而引起金球纳米颗粒表面修饰的4-ATP的SERS信号发生变化；使用拉曼光谱仪检测不同温度下4-ATP在1074 cm-1特征峰的信号强度和DTNB在1327 cm-1特征峰的信号强度，分析得到比率SERS信号I R （I R =I 1074/I 1327）与温度的关系，构建I R 与温度的线性工作曲线；工作曲线构建设定的温度范围为25-45℃，信号采集间隔为1.0℃。
4.根据权利要求3所述的比率式表面增强拉曼光谱纳米温度计用于细胞微环境温度传感的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将比率式SERS纳米温度计与细胞共孵育后用PBS缓冲液冲洗细胞，去除未被细胞摄入的SERS纳米温度计；
步骤（1）中，所述的细胞是MCF-7细胞，悬浮密度≤104/mL，SERS纳米温度计纳米颗粒的浓度为1.0 mg/mL，体积为10-100 μL
（2）使用显微拉曼光谱仪通过明场显微成像确定待分析目标细胞，使用显微拉曼光谱仪采集细胞内微区的SERS光谱；
步骤（2）中，信号采集测试参数为：激光功波长为633 nm，物镜倍数为40倍，曝光时间为1-5 s，叠加次数为1-5次，功率为10-100%；
（3）根据检测得到的SERS光谱，提取1074 cm-1特征峰和1327 cm-1特征峰的信号强度，计算比率SERS信号I R；
（4）根据计算得到的比率SERS信号I R ，对照工作曲线，计算得到温度值。
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