CN112779257B - 来自苹果多聚泛素基因的核苷酸片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了来自苹果多聚泛素基因的核苷酸片段及其应用。所述核苷酸片段为自MdBIUTNT基因翻译起始位点ATG中的A开始(不包括A)向上大小为1539bp的核苷酸片段。通过实验证明：该核苷酸片段可高效与稳定驱动调控苹果果实成熟与免疫反应中具有代表性的目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达，突破了在苹果原生质体细胞中应用CaMV 35S启动子部分基因不表达，部分基因表达较弱的技术局限，为将苹果原生质体细胞蛋白表达技术应用于苹果信号转导研究奠定了基础。

Description

来自苹果多聚泛素基因的核苷酸片段及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术与生物化学领域，尤其涉及来自苹果多聚泛素基因的核苷酸片段及其应用。

背景技术

苹果是重要的经济作物之一，耐贮性好，供应周期长，是世界性果品，尤其果实含有较高比例的、人体比较容易吸收的游离多酚，具有很好的抗氧化、抗肿瘤、预防心脑血管疾病及保肝等作用，营养保健价值高，有“一天一苹果，医生远离我”的美誉，世界上相当多的国家都将其列为主要消费果品而大力推荐。

苹果树种有望成为研究高等多年生木本植物生长、发育、果实品质形成以及抗病与免疫的模式植物，因此揭示苹果中重要的功能基因及苹果细胞信号转导的分子机理尤为重要。虽然应用愈伤组织转化可以得到目的蛋白，但该方法存在如下缺点：1)周期较长；2)研究结果易受细胞生理状态、细胞培养过程中体细胞变异等因素的影响；3)对于只发生在蛋白翻译后特定时间内的蛋白质翻译后修饰，无法进行精确地研究。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种DNA分子。

所述DNA分子为如下ⅰ)或ⅱ)或ⅲ)：

ⅰ)序列表中序列2所示的DNA分子；

ⅱ)与ⅰ)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子；

ⅲ)在严格条件下与ⅰ)或ⅱ)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。

本发明的第二个目的是提供含有上述DNA分子的表达盒。

所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子、由所述DNA分子启动表达的目标基因，以及转录终止序列组成。

本发明的第三个目的是提供含有上述DNA分子的重组载体。

所述重组载体可为重组表达载体或重组克隆载体。

本发明的第四个目的是提供含有上述DNA分子的重组菌。

本发明的第五个目的是提供含有上述DNA分子的转基因植物细胞系。

扩增上述DNA分子或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的第六个目的是提供上述DNA分子的新用途。

本发明提供了上述DNA分子在作为启动子中的应用。

本发明的第七个目的是提供上述DNA分子或含有上述DNA分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因植物细胞系的新用途。

本发明提供了上述DNA分子或含有上述DNA分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因植物细胞系在启动目标基因表达中的应用。

上述应用中，所述启动目标基因表达为在植物细胞中启动目标基因表达。

所述植物可为双子叶植物或单子叶植物；具体的，所述双子叶植物可为苹果属植物；更具体的，所述苹果属植物为苹果。

所述植物细胞可为原生质体细胞；具体的，所述原生质体细胞为苹果原生质体细胞。

本发明的第八个目的是提供一种表达目标基因的方法。

本发明提供的表达目标基因的方法包括如下步骤：以上述DNA分子作为启动子来启动目标基因的表达。

上述方法中，所述表达目标基因为在苹果原生质体细胞中表达目标基因；所述苹果原生质体细胞是以在添加植物激素的MS培养基上生长10天的苹果愈伤组织细胞为试材分离制备得到的苹果原生质体细胞。所述苹果原生质体细胞可为Orin苹果愈伤组织细胞或紫红2-4苹果愈伤组织细胞。当所述苹果原生质体细胞为Orin苹果愈伤组织细胞时，所述植物激素为2,4-D(1.5mg/L)和6-BA(0.4mg/L)；当所述苹果原生质体细胞为紫红2-4苹果愈伤组织细胞时，所述植物激素为NAA(0.6mg/L)和6-BA(0.5mg/L)。并以第10天的愈伤组织细胞制备苹果原生质体细胞最佳。

以上任一所述应用或方法中，所述目标基因可为如下基因中的任一种或几种或全部：MdERF98、MdERF1、MdERF2、MdERF3和MdERF6。

本发明从苹果中克隆得到一种具有启动子功能的核苷酸片段。通过实验证明：该核苷酸片段可高效与稳定的驱动调控苹果果实成熟与免疫反应中具有代表性的目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达，突破了在苹果原生质体细胞中应用CaMV 35S启动子部分基因不表达，部分基因表达较弱的技术局限，为将苹果原生质体细胞蛋白表达技术应用于苹果信号转导研究奠定了基础。

附图说明

图1为用于分离制备苹果原生质体细胞的苹果愈伤组织细胞。a：在MS培养基上生长的Orin苹果愈伤组织细胞；b：在MS培养基上生长的紫红2-4苹果愈伤组织细胞；c：富士与新疆野苹果杂交后代叶片诱导出的4个初始细胞系。a、b所示苹果愈伤组织细胞用于苹果原生质体细胞分离。

图2为苹果愈伤组织细胞中分离出的苹果原生质体细胞。a：从MS培养基上生长不同天数的Orin苹果愈伤组织细胞中分离的苹果原生质体细胞；b：从MS培养基上生长不同天数的紫红2-4苹果愈伤组织细胞中分离的苹果原生质体细胞。图中天数为用于分离苹果原生质体细胞的苹果愈伤组织细胞在MS培养基上生长的天数。比例尺示50μm。

图3为应用Pro-BIUTNT启动子的母本表达载体构建。a：表达载体构建方案；b：Pro-BIUTNT克隆进表达载体的图例展示。

图4为应用CaMV 35S、Pro-BIUTNT两种类型启动子的参试目标基因的表达载体构建。a：表达载体构建过程；b：参试目标基因开放阅读框全长扩增结果；c：参试目标基因的表达载体酶切鉴定；d：虚线以上为分别应用CaMV 35S、Pro-BIUTNT两种启动子的目标基因的表达载体结构图，虚线以下为应用Pro-BIUTNT启动子的目标基因的表达载体结构图，(左)为载体构建中使用的母本载体(“质粒1”、“质粒3”、“质粒4”、“质粒5”)，(中)为参试目标基因表达载体结构图，(右)为表达载体中的参试目标基因集合，CCCCCT(*所示)为表达载体构建中SmaI、StuI酶切末端连接形成的序列，该序列存在于应用SmaI酶切克隆的MdBAK1、MdFLS2、MdWRKY29、MdWRKY33-1、AtFLS2的表达载体中。

图5为应用苹果中核苷酸序列为启动子驱动目标基因MdERF98的表达载体构建。a：表达载体构建方案；b：目标基因MdERF98克隆进母本载体“质粒3”图例展示；c：6个苹果中核苷酸序列作为启动子克隆进目标基因为MdERF98的表达载体图例展示；d：应用苹果中核苷酸序列为启动子的MdERF98表达载体(“质粒7”-“质粒12”)及载体构建中的中间载体的结构图。

图6为Pro-BIUTNT与CaMV 35S启动子驱动目标基因MdERF1、MdERF2、MdERF3、MdERF6、MdERF98、MdEIL2的表达效果对比。a：Pro-BIUTNT启动子有效驱动MdERF1、MdERF3、MdERF6、MdERF98、MdEIL2(

所示)表达，高效驱动MdERF2(*所示)表达；b：CaMV 35S启动子与Pro-BIUTNT启动子在苹果原生质体细胞中驱动目标基因MdERF1、MdERF2、MdERF3、MdERF6的表达效果对比。CaMV 35S启动子驱动的表达载体每个选取3个克隆，1#、2#、3#为克隆编号。末端带箭头直线所指为目标蛋白信号。

图7为Pro-BIUTNT启动子有效驱动MdWRKY33-1、MdWRKY29表达，高效驱动MdBAK1表达。

图8为Pro-BIUTNT启动子有效驱动MdFLS2表达。a：CaMV 35S与Pro-BIUTNT启动子在原生质体细胞中驱动目标基因表达不同时间的对比；b：CaMV 35S与Pro-BIUTNT启动子在MS培养基中培养6天的愈伤组织细胞制备的苹果原生质细胞中驱动目标基因表达的对比。

图9为Pro-MdBIUTNT、Pro-MdBIUTNT-2启动子具有驱动目标基因MdERF98在苹果原生质体细胞中表达的能力，△示目标蛋白信号。

图10为应用Pro-MdBIUTNT启动子的参试目标基因的表达载体构建。a：表达载体(pHBT:Pro-MdBIUTNT::MdERF1/MdERF2/MdERF3/MdERF6-HA)的构建方案；b：4个参试目标基因(MdERF1、MdERF2、MdERF3和MdERF6)的Pro-MdBIUTNT启动子表达载体结构图；c：质粒13-16的酶切鉴定图谱。

图11为Pro-MdBIUTNT启动子与CaMV 35S启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达的效果对比。

具体实施方式

下述实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中所有母本表达载体名字均为唯一，各个部分名字相同即指代完全相同。下述实施例中启动子的命名以该核苷酸片段所属基因名字前加Pro，中间以间隔符“-”隔开，基因名字后加后缀“-2”或“-1”、“-2”表示来自同一基因启动子区域的不同核苷酸片段。Pro为启动子的英文Promoter简写。下述实施例中的载体结构图仅包括本专利申请所涉及的表达载体上的结构元件，包括启动子、所驱动的目标基因及目的基因C-端标签。

下述实施例中的“质粒1”和“AvrPto-GFP”均记载于文献“He P,Shan L,Lin NC,Martin GB,Kemmerling B,Nürnberger T,Sheen J.2006.Specific bacterialsuppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innateimmunity,Cell,125:563–575.”中，“质粒1”为文献的Figure 2中的“AvrRpm1”表达载体，AvrPto-GFP为文献的Figure.6A中的“AvrPto-GFP”表达载体，公众均可从本专利申请人(山东农业大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的二元表达载体pCB302记载于文献“Cui F,Wu S,Sun W,Coaker G,Kunkel B,He P,Shan L.2013.The Pseudomonas syringae type III effector AvrRpt2promotes pathogen virulence via stimulating Arabidopsis Auxin/Indole aceticacid protein turnover,Plant Physiology,162:1018–1029.”中，“二元表达载体pCB302”为文献第11页Material and methods第二部分所述的“pCB302”表达载体，公众均可从本专利申请人(山东农业大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、苹果原生质体细胞的分离方法

以苹果愈伤组织细胞为试材，应用纤维素酶、果胶酶、离析酶三种酶混合水解法分离与制备苹果原生质体细胞。具体步骤如下：

一、苹果愈伤组织细胞的培养和保存

苹果愈伤组织细胞为2种：1为Orin苹果愈伤组织细胞(图1a)；2为紫红2-4苹果愈伤组织细胞(图1b)。

1、Orin苹果愈伤组织细胞的来源、培养和保存

1)Orin苹果愈伤组织细胞的来源

Orin苹果愈伤组织细胞的来源见参考文献“AN JP,Yao JF,Xu RR,You CX,WangXF,Hao YJ.Apple bZIP transcription factor MdbZIP44 regulates abscisic acid-promoted anthocyanin accumulation.Plant,Cell&Environment,2018,DOI:10.1111/pce.13393.”。

2)Orin苹果愈伤组织细胞的培养和保存

应用添加1.5mg/L 2,4-D和0.4mg/L 6-BA的MS(Murashige-Skooge)培养基(M5519，Sigma)进行Orin苹果愈伤组织细胞的培养和保存，每2周继代一次，培养条件为：黑暗中避光进行培养，培养温度为24℃。

2、紫红2-4苹果愈伤组织细胞的来源、培养和保存

1)紫红2-4苹果愈伤组织细胞的来源

紫红2-4愈伤组织细胞为从富士与新疆野苹果杂交后代F1分离群体的优株叶片中诱导而得来的苹果愈伤组织，从诱导所得的4个初始细胞系2-3、2-4、2-2与黄细胞(图1c)中选择2-4，于光下在MS培养基上经多代继代培养，得到疏松均一且组成型合成花青素的红色愈伤组织细胞(图1b)。紫红愈伤组织细胞的诱导及生物学特性见参考文献“Ji XH,WangYT,Zhang R,Wu SJ,An MM,Li M,Wang CZ,Chen XL,Zhang YM,Chen XS.Effects ofauxin,cytokinin and nitrogen on anthocyanin biosynthesis in callus culturesof red-fleshed apple(Malus sieversii f.niedzwetzkyana).Plant Cell TissueOrgan,Culture,2015,120:325–337.”。

2)紫红2-4苹果愈伤组织细胞的培养和保存

应用添加0.6mg/L NAA与0.5mg/L 6-BA的MS培养基对紫红2-4苹果愈伤组织细胞进行继代、培养与保持，每2周继代一次。培养条件为：每天光照8小时，黑暗16小时，培养温度为24℃。

二、苹果原生质体细胞的分离

以在添加植物激素的MS培养基上生长不同天数的以上两种苹果愈伤组织细胞为试材分离制备苹果原生质体细胞。苹果原生质体细胞的分离方法见参考文献“Gao X,Wheeler T,Li Z,Kenerley CM,He P,Shan L.2011.Silencing GhNDR1 and GhMKK2compromises cotton resistance to Verticillium wilt.Plant J,66:293-305.”(参考文献中的物种为棉花，所用的试材为棉花的叶片和下胚轴，而本专利申请中的物种为苹果，所用的试材为苹果愈伤组织细胞)。具体步骤如下：

1、所需溶液的配制

酶解液：1.5％纤维素酶(Yakult Pharmaceutical，R-10)、0.4％离析酶(YakultPharmaceutical，R-10)、0.05％果胶酶(Kyowa Chemical，Y-23)、20mM KCl(Sigma，P9333)、10mM CaCl₂(Sigma，C1016)、2％蔗糖(天津凯通)、20mM MES(Sigma，M3671，pH 5.7)、0.4M甘露醇(Sigma，M4125)。

W5溶液：0.154M NaCl(国药，10019318)、0.125M CaCl₂、0.005M KCl、0.002M MES(pH5.7)(Sigma，M3671)。

MMG溶液：0.4M甘露醇、0.015M氯化镁(国药，10012817)、0.004M MES(pH5.7)(Sigma，M3671)。

2、苹果原生质体细胞的分离

1)在无菌超净工作台中，称取2g苹果愈伤组织细胞加入10mL酶解液中，使用无菌药匙轻轻将愈伤组织细胞均匀散开，然后放入真空干燥器中抽真空30分钟，真空度为0.06MPa，取出，置于室温避光酶解12小时。

2)酶解结束，轻轻晃动处在酶解液中的苹果愈伤组织细胞以释放苹果原生质体细胞，加入等体积W5溶液，混匀，得到混合液；将混合液经100μm孔径的尼龙布过滤至50mL圆底离心管中，用W5溶液顺次冲洗尼龙布3次，每次5-10mL，均收集于上述的50mL圆底离心管中。将悬浮在酶解液与W5溶液中的苹果原生质体细胞在Beckman离心机(J2-MC)上900rpm离心2分钟，弃上清；收集苹果原生质体细胞并重悬于15mL W5溶液中，然后置于冰上30分钟，弃上清，向管底缓缓注入2mL MMG溶液，将在管底层积的苹果原生质体细胞重新悬浮，吸取10μL苹果原生质体细胞悬浮液滴入血球计数板凹槽中，上置盖玻片，在Olympus，BX53光学显微镜下观察、计数、拍照。

图2a所示为分别以在添加植物激素的MS培养基上生长6天、8天、10天、12天、14天的Orin苹果愈伤组织细胞为试材分离的苹果原生质体细胞。图2b所示为分别以在添加植物激素的MS培养基上生长5天、10天、15天、20天、25天的紫红2-4苹果愈伤组织细胞为试材分离的苹果原生质体细胞，其中，以在添加植物激素的MS培养基上生长20天、25天的紫红苹果愈伤组织细胞为试材分离得到的苹果原生质体细胞，在显微镜下镜检观察，未见均匀散布的原生质体细胞，所分离的原生质体细胞成团聚集，并有碎片状物质(图2b，20天、25天)，故原生质体细胞个数未做统计。

通过对所分离的苹果原生质体细胞的个数进行统计与计算，发现苹果原生质体细胞的最优分离条件为：以在添加植物激素的MS培养基上生长10天的苹果愈伤组织细胞为试材分离制备苹果原生质体细胞，能够得到最大的苹果原生质体细胞量(表1)。

表1、从在添加植物激素的MS培养基上生长不同天数的Orin、紫红2-4两种苹果愈伤组织细胞中分离出的苹果原生质体细胞数目统计

实施例2、Pro-BIUTNT启动子的扩增及以其作为启动子的目标基因表达载体的构建

一、Pro-BIUTNT启动子的克隆

提取拟南芥的基因组DNA，以拟南芥基因组DNA为模板，应用表2所示Pro-BIUTNT启动子的扩增引物从拟南芥基因组DNA中PCR扩增多聚泛素编码基因(At4g05320.2)自翻译起始位点ATG中A开始(不包括A)向上的1307bp的核苷酸序列，该核苷酸片段在本专利申请中命名为Pro-BIUTNT。

表2、7个启动子的名称、所属基因、来源物种、扩增引物及启动子片段长度

扩增体系为：总体积100μL，包括DNA模板4μL，dNTP 8μL，正向(F)、反向(R)引物各5μL，5×HF Buffer 20μL，ddH₂O 57μL，Phusion高保真酶(Thermo SCIENTIFIC，#F-530L)1μL。

扩增程序为：①98℃3min；②98℃30s；③58℃30s；④72℃1min 30s；⑤go to②③④for 35个循环；⑥72℃10min；⑦4℃保存。

拟南芥基因组DNA提取结果如图3b(I)中的泳道1箭头所示，启动子扩增结果如图3b(I)中的泳道2箭头所示。

二、应用CaMV 35S、Pro-BIUTNT两种类型启动子的母本表达载体构建

应用CaMV 35S、Pro-BIUTNT两种类型启动子的母本表达载体的构建方案如图3a所示。

1、质粒1

“质粒1”为本专利申请中所有表达载体的初始表达载体，为应用CaMV 35S启动子驱动目标基因AvrRpm1的表达载体，C末端标签为HA(HA：Hemagglutinin)。“质粒1”字体左侧为表达载体结构图(图3a)。

2、质粒2

以“质粒1”为模板，应用Thermo SCIENTIFIC(GeneArt，A13282)试剂盒及表3所列引物，将“质粒1”结构图1、2、3所示三处酶切位点分别由XhoI突变为PstI，且BamHI突变为SmaI，且PstI突变为BamHI(图3a，步骤1)，得到酶切位点发生突变后的表达载体，命名为“质粒2”(图3a，步骤1)。

表3、表达载体中酶切位点的突变引物

3、质粒3

以“质粒2”为模板，应用PstI/SmaI酶切克隆，将“质粒2”中的CaMV 35S启动子替换为步骤一中扩增得到的Pro-BIUTNT启动子片段，得到应用Pro-BIUTNT启动子驱动目标基因AvrRpm1的表达载体，命名为“质粒3”(图3a，步骤2)。具体制备方法如下：

1)应用限制性内切酶PstI/SmaI酶切“质粒2”，酶切体系为15μL，先加入1.5μL 10×NEB Cutsmart缓冲液、7μL 100ng/μL“质粒2”、0.5μL PstI(NEB，#R3104)和5.5μL无菌水，然后在37℃金属浴中酶切2小时，再加入0.5μL SmaI(NEB，#R0141S)，最后在25℃金属浴中酶切2小时。

2)酶切结束，将酶切产物在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳结果如图3b(II)所示。下箭头所示为从“质粒2”中释放出的大小为564bp的CaMV 35S启动子；上箭头所示为释放出CaMV 35S启动子后表达载体的其余部分。将上箭头所示的表达载体片段进行切胶，应用康为世纪快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(CW2302M)从胶块中回收除去启动子后表达载体其余部分，与同样经PstI/SmaI双酶切、凝胶电泳、切胶回收的Pro-BIUTNT扩增片段在T4 DNA连接酶(NEB，M0202)作用下于16℃连接过夜，转化大肠杆菌。

3)挑取大肠杆菌单克隆培养，提取质粒鉴定Pro-BIUTNT启动子克隆进表达载体的目标克隆。鉴定方法如下：应用限制性内切酶PstI/SmaI酶切目标克隆，酶切结束，将酶切产物在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳结果如图3b(III)所示。图中上箭头所示为去除启动子后的表达载体其余部分，下箭头所示为应用PstI/SmaI酶切，从鉴定到的表达载体中释放出一条介于1000bp-2000bp之间的片段。对克隆进该表达载体中的片段进行测序，显示Pro-BIUTNT片段已克隆进表达载体，所获的表达载体命名为“质粒3”。Pro-BIUTNT启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

4、质粒4

以“质粒3”为模板，应用Thermo SCIENTIFIC(GeneArt，A13282)试剂盒及表3所列引物，将“质粒3”中2、3两处酶切位点分别由SmaI突变为BamHI，且BamHI突变为SmaI，得到能够使用另外酶切克隆位点将目标基因克隆进表达载体的应用Pro-BIUTNT启动子的表达载体，命名为“质粒4”(图3a，步骤3)。

5、质粒5

以“质粒3”为模板，将“质粒3”中目标基因AvrRpm1的C末端标签由HA突变为FLAG，且将目标基因AvrRpm1替换为AtFLS2，得到标签为FLAG的应用Pro-BIUTNT启动子的表达载体，命名为“质粒5”。具体制备方法如下：

1)以“质粒3”为模板，应用Thermo SCIENTIFIC(GeneArt，A13282)试剂盒及表3所列引物，将“质粒3”中目标基因AvrRpm1的C末端标签由HA突变为FLAG，得到C末端标签为FLAG的表达载体，其中在正向引物序列中，FLAG标签序列用斜体表示(表3)。

2)以拟南芥cDNA为模板，采用表5中所列AtFLS2扩增引物，应用PCR扩增的方法从拟南芥cDNA中扩增得到AtFLS2开放阅读框全长序列，PCR扩增反应体系及扩增程序同实施例2(一)，其中扩增程序中的72℃延伸时间④根据1-2kb/min计算，AtFLS2扩增产物见图4b(II)所示，长度为3519bp。

3)应用SmaI单酶切克隆，将2)中获得的AtFLS2开放阅读框全长序列(GeneID：NM_001344672.1)克隆进C末端标签为FLAG的表达载体中，命名为“质粒5”(图4a，II)。具体步骤如下：AtFLS2的扩增产物经酒精沉淀，无菌水溶解后，应用SmaI单酶切2小时，同时应用SmaI/StuI酶切C末端标签为FLAG的表达载体，释放出目标基因AvrRpm1，将载体其余部分应用康为世纪快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(CW2302M)从胶块中进行回收，与经SmaI酶切的AtFLS2片段在T4连接酶的作用下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌。

4)应用BamHI/StuI酶切鉴定出AtFLS2开放阅读框全长序列克隆进表达载体的目标克隆。图4c(I)中*标示出了AtFLS2的酶切鉴定结果，证明AtFLS2已克隆进表达载体。

“质粒3”、“质粒4”和“质粒5”即为本专利申请中应用Pro-BIUTNT启动子的母本表达载体；“质粒1”为应用CaMV 35S启动子的母本表达载体。

三、应用CaMV 35S、Pro-BIUTNT两种类型启动子的参试目标基因的表达载体构建

应用CaMV 35S、Pro-BIUTNT两种类型启动子的参试目标基因的表达载体构建方案如图4a所示；所构建的13个参试目标基因的表达载体结构图如图4d所示。图4a(I)所示目标载体及目标基因对应于图4d虚线以上的目标载体及目标基因，图4a(II)所示目标载体及目标基因对应于图4d虚线以下的目标载体及目标基因。表达载体间的粗线箭头示表达载体构建过程。目标载体结构图下方为目标基因。方框内所示为分别构建到应用CaMV 35S启动子与Pro-BIUTNT启动子的表达载体中的基因；粗线方框示构建到应用Pro-BIUTNT启动子的表达载体；细线方框示构建到应用CaMV 35S启动子的表达载体；字体颜色相同的基因为表达载体构建中使用的酶切位点相同的基因。

1、13个参试目标基因开放阅读框全长序列的扩增

以cDNA为模板，采用表4所示的引物分别扩增13个参试目标基因开放阅读框全长序列。AtFLS2与AtBAK1应用拟南芥cDNA为模板，其余基因应用苹果cDNA为模板进行扩增。

表4、13个参试目标基因名称、基因代码及扩增引物序列

13个参试目标基因开放阅读框全长序列的扩增结果如图4b所示。(I)所示为6个转录因子基因，包括5个ERF家族转录因子(MdERF1、MdERF2、MdERF3、MdERF6、MdERF98)及乙烯信号转导途径中重要的调控基因转录因子MdEIL2的扩增结果。(II)所示为4个免疫受体基因(AtBAK1、AtFLS2、MdBAK1、MdFLS2)及3个免疫信号途径中的MdMAPK6、MdWRKY29、MdWRKY33-1基因的扩增结果；右一为5’、3’两端均为SmaI酶切克隆位点的MdWRKY33-1扩增片段，用以克隆进表达载体“质粒3”，获应用Pro-BIUTNT启动子驱动的表达载体；右二为5’、3’两端分别为BamHI、SmaI酶切位点的MdWRKY33-1扩增片段，用以克隆进表达载体“质粒1”，获应用CaMV 35S启动子驱动的表达载体。

2、参试目标基因的表达载体的构建

将步骤1中扩增得到的13个参试目标基因开放阅读框全长序列分别克隆进表达载体中。每个参试基因克隆进的表达载体的启动子类型(CaMV 35S启动子、Pro-BIUTNT启动子)、母本载体(质粒1、质粒3、质粒4或质粒5)及使用的酶切克隆位点如表5所示。

表5、每个参试基因克隆进的表达载体的启动子类型、母本载体及所用酶切克隆位点

注：基因1为MdERF1基因；基因2为MdERF2基因；基因3为MdERF3基因；基因4为MdEIL2基因；基因5为MdERF6；基因6为MdERF98基因；基因7为MdBAK1基因；基因8为MdFLS2基因；基因9为MdWRKY29基因；基因10为MdWRKY33-1基因；基因11为AtFLS2；基因12为AtBAK1基因；基因13为MdMAPK6基因。填充方格示参试基因(正对其上方第一排)克隆进表达载体的启动子类型、母本载体(正对其左第一列)及使用的酶切克隆位点(正对其左第二列)；黑色填充示分别构建到应用C_aMV 35S启动子与P_ro-BIUTNT启动子的表达载体中的基因(基因1-基因10)；紫色填充示构建到应用P_ro-BIUTNT启动子的表达载体中的基因(基因11和基因12)；橙色填充示构建到应用C_aMV 35S启动子的表达载体中的基因(基因13)；填充方格中数字示表达载体选取的克隆数。

因MdERF98的开放阅读框序列中含有BamHI酶切位点GGATCC，为了方便后续构建表达载体，应用Thermo SCIENTIFIC(GeneArt，A13282)试剂盒及突变引物F：5’-TATTTCCGGGCGTAGATCCTGGAAGGAG-3’；R：5’AAGATGAGGAAGAAGCAGAAGATGAAGAC-3’在表达载体中将该基因BamHI酶切位点同义突变为AGATCC。本专利申请中MdERF98的表达载体中MdERF98的核苷酸序列均为同义突变后的核苷酸序列。

3、参试目标基因的表达载体的酶切鉴定

参试目标基因的表达载体酶切鉴定所使用酶均为BamHI/StuI，鉴定结果如图4c所示。(I)所示为6个目标基因的分别应用CaMV 35S启动子、Pro-BIUTNT启动子为驱动的表达载体的酶切鉴定(“▽”示)及CaMV 35S启动子驱动的MdMAPK6的表达载体与Pro-BIUTNT启动子驱动的AtBAK1、AtFLS2表达载体酶切鉴定(“*”示)；基因名字如图所示。数字“1”示应用CaMV 35S启动子的表达载体；数字“2”示应用Pro-BIUTNT启动子的表达载体；数字“3”示应用Pro-BIUTNT启动子C末端为FLAG标签的AtFLS2的表达载体。(II)所示为MdERF1、MdERF2、MdERF3、MdERF6的应用CaMV 35S启动子与应用Pro-BIUTNT启动子的表达载体酶切鉴定。

MdERF1、MdERF2、MdERF3、MdERF6的应用CaMV 35S启动子为驱动的表达载体每个选取3个克隆；应用Pro-BIUTNT启动子的表达载体每个选取1个克隆。1#、2#、3#为表达载体不同克隆编号。参试基因名字及启动子名字见图中所示。

图4c(I)、(II)酶切鉴定结果显示，所有参试基因均克隆进表达载体。

实施例3、苹果中Pro-MdBIUTNT、Pro-MdBIUTNT-2启动子的扩增及以其作为启动子的表达载体的构建

一、苹果中6个核苷酸片段的扩增

以苹果基因组DNA为模板，分别采用表2中的Pro-MdBIUTNT、Pro-MdBIUTNT-2、Pro-MdRP-1、Pro-MdRP-2、Pro-MdRC-1、Pro-MdRC-2片段对应的引物进行扩增，分别得到Pro-MdBIUTNT、Pro-MdBIUTNT-2、Pro-MdRP-1、Pro-MdRP-2、Pro-MdRC-1、Pro-MdRC-2核苷酸片段。

6个核苷酸片段分别来自于如下3个基因：MdBIUTNT(Pro-MdBIUTNT、Pro-MdBIUTNT-2)、MdRP(Pro-MdRP-1、Pro-MdRP-2)、MdRC(Pro-MdRC-1、Pro-MdRC-2)。MdBIUTNT为拟南芥多聚泛素基因在苹果中的同源基因；MdRP为1，5-核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因；MdRC为苹果1，5-核酮糖二磷酸羧化酶活化酶基因；上述基因在苹果基因组中的编号见表2。

其中，Pro-MdBIUTNT、Pro-MdBIUTNT-2为自MdBIUTNT基因翻译起始位点ATG中的A开始(不包括A)向上分别为1539bp、2501bp的两个核苷酸片段。Pro-MdBIUTNT启动子核苷酸序列如序列表中序列2所示、Pro-MdBIUTNT-2启动子核苷酸序列如序列表中序列3所示。

Pro-MdRP-1、Pro-MdRP-2为自MdRP基因翻译起始位点ATG中的A开始(不包括A)向上分别为1972bp、3050bp的两个核苷酸片段。Pro-MdRP-1启动子核苷酸序列如序列表中序列4所示、Pro-MdRP-2启动子核苷酸序列如序列表中序列5所示。

Pro-MdRC-1、Pro-MdRC-2为自MdRC基因翻译起始位点ATG中的A开始(不包括A)向上分别为2025bp、2542bp的两个核苷酸片段。Pro-MdRP-1启动子核苷酸序列如序列表中序列6所示、Pro-MdRP-2启动子核苷酸序列如序列表中序列7所示。

Pro-MdBIUTNT、Pro-MdBIUTNT-2、Pro-MdRP-1、Pro-MdRP-2扩增产物如图5c(I)所示；Pro-MdRC-1、Pro-MdRC-2扩增产物如图5c(I)中箭头所指。

二、应用苹果中核苷酸序列为启动子驱动目标基因MdERF98的表达载体构建

以步骤一中扩增得到的苹果中核苷酸序列为启动子驱动目标基因MdERF98的表达载体构建方案如图5a所示。具体步骤如下：

1、质粒6

将“质粒3”中的目标基因AvrRpm1替换为目标基因MdERF98，得到质粒6。具体制备方法如下：

1)以实施例2(三)构建的Pro-BIUTNT：：MdERF98表达载体(表达载体结构图见图4d)为模板，采用表4中带*号的MdERF98的扩增引物进行扩增，得到目标基因MdERF98。图5b(I)为MdERF98扩增结果。

2)应用SmaI/StuI酶切克隆，将目标基因MdERF98克隆进母本载体“质粒3”，获得表达载体，命名为“质粒6”(图5a，步骤1)。图5b(II)为使用限制性内切酶SmaI/StuI对MdERF98表达载体的酶切鉴定结果。酶切结果显示，MdERF98已克隆进表达载体。

2、质粒7”-“质粒12”

以“质粒6”为模板，应用PstI/SmaI酶切克隆，分别将步骤一获得的来自苹果中的核苷酸片段克隆进表达载体中作为启动子，分别获得MdERF98表达载体Pro-MdBIUTNT：：MdERF98(质粒7)、Pro-MdBIUTNT-2：：MdERF98(质粒8)、Pro-MdRP-1：：MdERF98(质粒9)、Pro-MdRP-2：：MdERF98(质粒10)、Pro-MdRC-1：：MdERF98(质粒11)、Pro-MdRC-2：：MdERF98(质粒12)(图5a，步骤2)。图5c(II)为使用限制性内切酶PstI/SmaI对各个MdERF98表达载体的酶切鉴定结果。每个泳道中的表达载体及所使用的限制性内切酶如图右侧标注所示。酶切结果显示，以上6个核苷酸片段均已克隆进表达载体，得到应用以上6个苹果中核苷酸序列为启动子驱动目标基因MdERF98的表达载体。并对克隆进以上表达载体中的6个核苷酸序列分别进行测序验证。

“质粒6”为载体构建中的中间载体，“质粒7”-“质粒12”为应用苹果中核苷酸序列为启动子的表达载体。各个表达载体结构图如图5d所示。

实施例4、苹果原生质体细胞转染、目标蛋白表达及检测

一、苹果原生质体细胞转染、目标蛋白表达及检测

1、表达载体的纯化

应用氯化铯梯度离心法制备与纯化本专利申请中实施例2和实施例3所构建的参试目标基因的表达载体，包括实施例2所构建的13个目标基因的31个表达载体(表5)及实施例3构建的7个表达载体“质粒6”-“质粒12”。氯化铯梯度离心法制备与纯化表达载体的方法详见《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，萨姆布鲁克等著，黄培堂译)第53-56页。

2、苹果原生质体细胞转染

为了对比不同类型启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中表达和翻译的效果，应用PEG介导的瞬时转染法将步骤一纯化的目标载体转染实施例1中从MS培养基中培养6天的Orin苹果愈伤组织细胞制备的苹果原生质体细胞，转染后的细胞在培养不同时间后进行目标蛋白表达与积累的检测。其中，转染目标基因AtFLS2的表达载体的苹果原生质体细胞在培养2h、4h、6h、8h和10h后进行目标蛋白表达与积累的检测(图8a)；转染其余目标基因的表达载体的苹果原生质体细胞在培养6h(图6、图7、图8b)或8h(图9)后进行目标蛋白表达与积累的检测。原生质体细胞转染的具体步骤参考文献“He P,Shan L,SheenJ.2006.The use of protoplasts to study innate immune responses.Plant-PathogenInteractions Volume 354:pps.1-10”中的方法。

3、目标蛋白表达及检测

表达结束后收集苹果原生质体细胞，应用SDS上样缓冲液(100mmol/L Tris-Cl，4％SDS，20％甘油，0.2％溴酚蓝，200mmol/L二硫苏糖醇)进行蛋白质变性，应用western杂交检测目标基因在苹果原生质体细胞中的翻译水平。

二、Pro-BIUTNT、Pro-MdBIUTNT、Pro-MdBIUTNT-2启动子与CaMV 35S启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达的效果对比

1、Pro-BIUTNT与CaMV 35S启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达的效果对比

Pro-BIUTNT启动子可稳定驱动12个参试目标基因(MdERF1、MdERF2、MdERF3、MdERF6、MdEIL2、MdERF98、AtBAK1、AtFLS2、MdBAK1、MdFLS2、MdWRKY29、MdWRKY33-1)在苹果原生质体细胞中高效表达。结果详述如下：

(1)应用CaMV 35S启动子不能驱动MdERF1、MdERF3、MdERF6在苹果原生质体细胞中表达，而应用Pro-BIUTNT启动子，获得了清晰特异的目标蛋白表达信号。其中MdERF2应用CaMV 35S启动子表达较弱，但应用Pro-BIUTNT启动子获得了清晰特异的目标蛋白表达信号(图6a)。即便在应用CaMV 35S启动子的表达载体每个所挑选的3个克隆中，也未发现能够驱动MdERF1、MdERF3、MdERF6有效表达的载体克隆及具有与应用Pro-BIUTNT启动子相同信号强度的MdERF2的载体克隆(图6b)。

(2)MdERF98为另一ERFs(Ethylene response factors)家族的转录因子，应用CaMV 35S启动子，该基因未获表达(图6a、图7)或表达较弱(图9)，而应用Pro-BIUTNT启动子，获得了清晰、特异的目标蛋白表达信号(图6a、图7、图9)。

MdEIL2是比以上5个ERF转录因子家族基因具有更长的氨基酸编码区的一段核苷酸序列，应用CaMV 35S为启动子，未获表达，而应用Pro-BIUTNT启动子，在目标蛋白所处位置获得清晰、特异的目标蛋白表达信号(图6a，

示)。

(3)MdWRKY33-1与MdWRKY29为WRKY家族重要转录因子。MdWRKY33-1的表达不能被CaMV 35S启动子驱动，在MdWRKY29条带所处位置有一极弱表达信号(图7中CaMV 35S::MdWRKY29中“△”所指)，而应用Pro-BIUTNT启动子，MdWRKY33-1、MdWRKY29获得了清晰、特异的目标蛋白表达信号(图7)。

(4)MdFLS2、MdBAK1为苹果中重要的免疫基因。应用CaMV 35S启动子，MdFLS2未获表达，而应用Pro-BIUTNT启动子，在苹果原生质体细胞中表达2小时，就发现了目标蛋白MdFLS2的信号积累(图8a)；并且，应用Pro-BIUTNT启动子，在以MS培养基上生长6天的苹果愈伤组织细胞所制备的苹果原生质体细胞中获得了清晰、特异的MdFLS2目标蛋白表达信号，应用CaMV 35S启动子，未获蛋白表达信号(图8b)。

虽然CaMV 35S启动子能够驱动MdBAK1在苹果原生质体细胞中获得表达，但目标蛋白的信号强度显著低于应用Pro-BIUTNT启动子时MdBAK1的表达信号(图7中

示MdBAK1的表达)，并且应用Pro-BIUTNT启动子，能够清晰地看到MdBAK1蛋白翻译后被剪切的片段，而应用CaMV 35S启动子，则不能看到3条被剪切所修饰的特异条带(图7，*示MdBAK1在细胞内被剪切的片段)。

本专利申请中所挑选的参试目标基因均为调控苹果果实成熟与免疫反应中具有代表性的基因，包括ERF家族转录因子5个，乙烯信号转导中重要转录调控因子基因1个，免疫受体相关基因4个，MAPK信号途径中的重要基因3个。除MdMAPK6未参与启动子强度对比试验以外，Pro-BIUTNT启动子驱动了全部12个参试目标基因的表达，而应用CaMV 35S启动子，部分基因不表达(MdERF1、MdERF3、MdERF6、MdEIL2、MdWRKY33-1、MdFLS2)，部分基因弱表达(MdERF2、MdWRKY29、MdERF98)(表6、表7)。

表6、两种启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中的表达、翻译效果比较

MdERF1

MdERF3

MdERF6

MdEIL2

MdWRKY33-1

MdFLS2

MdERF2

CaMV 35S

不表达

不表达

不表达

不表达

不表达

不表达

弱表达

Pro-BIUTNT

表达、强表达

强表达

强表达

表达

强表达

表达

强表达、表达

结果来源

图6a、6b、7

图6a、6b

图6a、6b

图6a

图7

图8

图6a、6b、7

注：“/”示未进行相应表达载体构建及开展对比试验。

表7、两种启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中的表达、翻译效果比较

注：“/”示未进行相应表达载体构建及开展对比试验。

2、Pro-MdBIUTNT、Pro-MdBIUTNT-2启动子与CaMV 35S启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达的效果对比

Pro-MdBIUTNT、Pro-MdBIUTNT-2启动子具有驱动目标基因MdERF98在苹果原生质体细胞中表达的能力(图9，△示目标蛋白MdERF98表达信号)。暗处培养8小时和光下培养8小时分别是指经PEG4000介导的瞬时转化后，分别在25℃、光照环境下(图9、右)和25℃、黑暗环境下(图9、左)培养原生质体细胞进行目标蛋白表达8小时。

综合上述结果表明：来自拟南芥多聚泛素编码基因的Pro-BIUTNT启动子及来自苹果多聚泛素编码基因启动子区域的两个核苷酸序列Pro-MdBIUTNT、Pro-MdBIUTNT-2均是在苹果原生质体细胞中高效与稳定驱动目标基因进行表达的启动子，均具有驱动目标基因在苹果原生质体细胞中表达的能力。

实施例5、Pro-MdBIUTNT启动子的应用

一、应用Pro-MdBIUTNT启动子的参试目标基因的表达载体构建

应用Pro-MdBIUTNT启动子的参试目标基因的表达载体(pHBT:Pro-MdBIUTNT::MdERF1/MdERF2/MdERF3/MdERF6-HA)的构建方案如图10a所示；分别以Pro-BIUTNT启动子驱动MdERF1、MdERF2、MdERF3和MdERF6基因的表达载体为模板(见图4a(I))，以PstI/BamHI为酶切位点扩增Pro-MdBIUTNT，替换Pro-BIUTNT启动子驱动MdERF1、MdERF2和MdERF3基因的表达载体中的启动子Pro-BIUTNT，以PstI/NcoI为酶切位点扩增Pro-MdBIUTNT，替换Pro-BIUTNT启动子驱动MdERF6基因的表达载体中的启动子Pro-BIUTNT。表达载体间的粗线箭头示表达载体构建过程；方框内所示为分别构建到应用Pro-MdBIUTNT启动子的表达载体中的基因；字体颜色相同的基因为表达载体构建中使用的酶切位点相同的基因；所构建的4个参试目标基因(MdERF1、MdERF2、MdERF3和MdERF6)的Pro-MdBIUTNT启动子表达载体结构图如图10b所示(质粒13-16)；质粒13-16的酶切鉴定图谱如图10c所示，酶切位点分别为PstI/BamHI(质粒13-15)和PstI/NcoI(质粒16)。

二、Pro-MdBIUTNT启动子与CaMV 35S启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达的效果对比

苹果原生质体细胞转染、目标蛋白表达及检测步骤同实施例4所述。

应用CaMV 35S启动子不能有效驱动MdERF1、MdERF3、MdERF6在苹果原生质体细胞中表达，而应用Pro-MdBIUTNT启动子，均获得了清晰特异的目标蛋白表达信号。其中MdERF2应用CaMV 35S启动子表达较弱，但应用Pro-MdBIUTNT启动子获得了清晰特异的目标蛋白表达信号(图11b)。即便在应用CaMV 35S启动子的表达载体每个所挑选的3个克隆中，也未发现能够驱动MdERF1、MdERF3、MdERF6有效表达的载体克隆(图11a、c、d)及具有与应用Pro-MdBIUTNT启动子相同信号强度的MdERF2的载体克隆(图11b)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>山东农业大学

<120>来自苹果多聚泛素基因的核苷酸片段及其应用

<160>7

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1307

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

gatcaggata ttcttgttta agatgttgaa ctctatggag gtttgtatga actgatgatc 60

taggaccgga taagttccct tcttcatagc gaacttattc aaagaatgtt ttgtgtatca 120

ttcttgttac attgttatta atgaaaaaat attattggtc attggactga acacgagtgt 180

taaatatgga ccaggcccca aataagatcc attgatatat gaattaaata acaagaataa 240

atcgagtcac caaaccactt gcctttttta acgagacttg ttcaccaact tgatacaaaa 300

gtcattatcc tatgcaaatc aataatcata caaaaatatc caataacact aaaaaattaa 360

aagaaatgga taatttcaca atatgttata cgataaagaa gttacttttc caagaaattc 420

actgatttta taagcccact tgcattagat aaatggcaaa aaaaaacaaa aaggaaaaga 480

aataaagcac gaagaattct agaaaatacg aaatacgctt caatgcagtg ggacccacgg 540

ttcaattatt gccaattttc agctccaccg tatatttaaa aaataaaacg ataatgctaa 600

aaaaatataa atcgtaacga tcgttaaatc tcaacggctg gatcttatga cgaccgttag 660

aaattgtggt tgtcgacgag tcagtaataa acggcgtcaa agtggttgca gccggcacac 720

acgagtcgtg tttatcaact caaagcacaa atacttttcc tcaacctaaa aataaggcaa 780

ttagccaaaa acaactttgc gtgtaaacaa cgctcaatac acgtgtcatt ttattattag 840

ctattgcttc accgccttag ctttctcgtg acctagtcgt cctcgtcttt tcttcttctt 900

cttctataaa acaataccca aagagctctt cttcttcaca attcagattt caatttctca 960

aaatcttaaa aactttctct caattctctc taccgtgatc aaggtaaatt tctgtgttcc 1020

ttattctctc aaaatcttcg attttgtttt cgttcgatcc caatttcgta tatgttcttt 1080

ggtttagatt ctgttaatct tagatcgaag acgattttct gggtttgatc gttagatatc 1140

atcttaattc tcgattaggg tttcataaat atcatccgat ttgttcaaat aatttgagtt 1200

ttgtcgaata attactcttc gatttgtgat ttctatctag atctggtgtt agtttctagt 1260

ttgtgcgatc gaatttgtcg attaatctga gtttttctga ttaacag 1307

<210>2

<211>1539

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

ccttgaaaac aaattatttt ttcggttttt aattttttgg ggaggggagg cagattctct 60

gcccttctac ttttcgtgcc ctttcatgct cttttgtttg tgtgataatc gttaaatcac 120

gttaacattt tatattacta atctttttta tcttattatc tttataaaaa aattataaaa 180

tattaatgtg atttaaccgt aactacacaa aataagaggg tacggaaggt aggagggcag 240

acaatctacc tcctcacgcg cacccttttg accattcaaa aggcccctgc acatttctgt 300

tcattgattt ctcttttttg ggttttttca acgaatgata ttatttcctt aagaggataa 360

atagtgttag cctcacaatt gactagtaat aatgttgttc aaatttctcc ttggcgaaaa 420

tcgaacttaa gatttctttc ttgccaataa agagaaatac cactaaatca tagtagtagc 480

tcacctcctt ctacttgtat acaacttttt aaattacttt tcaagttagt ttcaagtact 540

tatttggtat tactatttat aaaaactaaa gtcaaaatta acatatgaat ttgggaatga 600

ggatggcacg cccgaacttg atactcttag ttgccatccc tactctctcc tctttctccc 660

tcactctcct tgatattctt ctcccgtctc ttctccgata ttctttcgcc attttctctc 720

tcttctcttt gaatttccaa gttcggataa tgttacccat tacactgtag gatgagatgt 780

ttttactttt ctaattgttg tattttgaaa acaattttaa atcacataca taaacaagtt 840

ttttattctt ttaagaagta ttcctcaaaa atgttttgag gaaagatgta cctttttata 900

taagatacca aacagcttct tatttttgtc atataatttc acattaagat gtactattca 960

cacatctttt tatttctcac atattccttg ttaattttta tccgtcgatc ttcttcaatt 1020

tatcaaaccc gatacatgaa aattaaaaag gtgtgtgaaa ggcaaaaaag tgtgtgaata 1080

tcagatctct ttagtaatcc attagcaggt catatacgat attgacgcgt gtaatccaca 1140

taacctgtca acgtagcatt ctgcaagtcc aaacaaatta ggaatccaat taccttcaca 1200

agcaaggaaa ggggcaacaa aaatccaaga tagagcaggt caccttctcc ctcatcaaat 1260

aaagaaaact aaaaatcaga ggtcaacaat tgttggcact tgcccaccta gaaacatctg 1320

ggccgttcgt ttcactgact tttctggtcc acgcgttcct cgtccactcc ggaatccaac 1380

ctaaaaatgg gatttgagtc ggctcatcct cccctatata aactcctcac ccccctccac 1440

tcttcctcac aattctctca acaattctcg cccatcgtcc ccaaatctct ctcaaatccc 1500

taatttcttt cgaattacaa atccccaatt tctgaaacc 1539

<210>3

<211>2501

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

ggatttatgg ctgtggatcg cccagctttt cctgggtcga ggaatatgct tgatcatcat 60

agagacatga ggctggacat agacaacatg agttatgagg taacgtcaat attcctgtct 120

attatatttc ttgaactgtc tgaacaaaaa ggaactccta gcactaggcg aaagaatagg 180

aaatgccttt atttttctct tcctctgact ttcatgtatt ctgaatttct cgaaatgtcc 240

gaacaaatag gaactcctcg cactaagcga aaggattggg aatgtcagca caggcttgtc 300

tgaagatttg ataccgaagt gtttaacaga aacaatatat tgttcatcag atcaaatcca 360

ggatgaaggt tcatgtgcaa tttgcctggt aagagtcttc cacttgaaac cggaaattat 420

aagattgccg tttccattag tgtggtttta attttatctt agcgcttttt agaccaattg 480

gactgtaaat tgcttaactg ctggaaatct aacttgtata taacccgatt gacaggaaga 540

gtacaatgac agggatgatg ttggtgcatt gaaaagttgc ggtcacgatt accatgtgag 600

ctgcatcaag aagtggttgt caatgaaaaa ttcttgtcca atctgcaaag gttgtgctct 660

tcctgataat atgaaggaga aataatttaa tcacgtcgtt agcgcttcat tatattacca 720

ttcttgtata tatatttaga gataatcccg aaaacggaag aaacaatact tgtttcgtat 780

tatgtaaagg gagtgttagc caatttaaat taatttgttt caggcttcca tttaaatgtt 840

gtgaagcctt tttgcaattg ttgttgttcc gtatatggct ctagtatata gttttttttt 900

cttctaattt tatgattcct tttcaaaact gagaagctag tttatgatgg aaaggggaaa 960

accttgaaaa caaattattt tttcggtttt taattttttg gggaggggag gcagattctc 1020

tgcccttcta cttttcgtgc cctttcatgc tcttttgttt gtgtgataat cgttaaatca 1080

cgttaacatt ttatattact aatctttttt atcttattat ctttataaaa aaattataaa 1140

atattaatgt gatttaaccg taactacaca aaataagagg gtacggaagg taggagggca 1200

gacaatctac ctcctcacgc gcaccctttt gaccattcaa aaggcccctg cacatttctg 1260

ttcattgatt tctctttttt gggttttttc aacgaatgat attatttaca ttaagaggat 1320

aaatagtgtt tagcctcaca attgactagt aataatgttg ttcaaatttc tccttggcga 1380

aaatcgaact taagatttct ttcttgccaa taaagagaaa taccactaaa tcatagtagt 1440

agctcacctc cttctacttg tatacaactt tttaaattac ttttcaagtt agtttcaagt 1500

acttatttgg tattactatt tataaaaact aaagtcaaaa ttaacatatg aatttgggaa 1560

tgaggatggc acgcccgaac ttgatactct tagttgccat ccctactctc tcctctttct 1620

ccctcactct ccttgatatt cttctcccgt ctcttctccg atattctttc gccattttct 1680

ctctcttctc tttgaatttc caagttcgga taatgttacc cattacactg taggatgaga 1740

tgtttttact tttctaattg ttgtattttg aaaacaattt taaatcacat acataaacaa 1800

gttttttatt cttttaagaa gtattcctca aaaatgtttt gaggaaagat gtaccttttt 1860

atataagata ccaaacagct tcttattttt gtcatataat ttcacattaa gatgtactat 1920

tcacacatct ttttatttct cacatattcc ttgttaattt ttatccgtcg atcttcttca 1980

atttatcaaa cccgatacat gaaaattaaa aaggtgtgtg aaaggcaaaa aagtgtgtga 2040

atatcagatc tctttagtaa tccattagca ggtcatatac gatattgacg cgtgtaatcc 2100

acataacctg tcaacgtagc attctgcaag tccaaacaaa ttaggaatcc aattaccttc 2160

acaagcaagg aaaggggcaa caaaaatcca agatagagca ggtcaccttc tccctcatca 2220

aataaagaaa actaaaaatc agaggtcaac aattgttggc acttgcccac ctagaaacat 2280

ctgggccgtt cgtttcactg acttttctgg tccacgcgtt cctcgtccac tccggaatcc 2340

aacctaaaaa tgggatttga gtcggctcat ccttccccta tataactcct caccccctcc 2400

actcttcctc acaattctct caacaattct cgcccatcgt ccccaaatct ctctcaaatc 2460

cctaatttct ttcgaattac aaatccccaa tttctgaaac c 2501

<210>4

<211>1972

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

cccacaacat ctccatggct aagttgagaa aaccgaattg atttgtgccg ccgccgccgc 60

cgccgccttc agagacgaat atctctcgtc aacagaagct cagattcccc aattccttcg 120

gcatcaatca ggtatgggtt ttgaagaaat ttcgttttac tcaaaagtag acatacacaa 180

taggactttt tttatattta tttttgttga atgggttttt gagtaatttt actgagtatt 240

cagacccgaa agaaaagtcg taatattgat gaaaacattt gattccgatc gggttacaga 300

tatctggtta tttgttaggt ttaattgctt actatttgtt caatggggtt tacaagaact 360

ggctgaaaag aaggaactga ttatggcttt cataggactt tctcattcac ttgaaaccca 420

agtaagtata tgttctaata cttttcgttc agtttgttta aatgcttctg ggtttagggg 480

cgagtattgt tattggcaca ccaataacat aatcatgcgc tacttcatgt ataaattctc 540

ccctataaaa aagtacaagg ggtggggaat gacatttttg aagcgccaac aaggttctaa 600

aagacactag gcgctagttg ggcggcgggc tagggcctaa tgcttaggca gctaggcgga 660

tttaagtaaa tatattatat ttcgtataaa taagtgtctg cttatactta aagtacatat 720

aatttcatca taaactacaa aataaaatta catatatatt atgaagtatt taaacataat 780

gaaaacatag ggaacgatga tataatgtgt gttcatttaa gcatgcatca agtctcttac 840

aatcttttga aaaagataaa atgcaaaatg aaagttatct attttctatc taagagagtt 900

gcaacctagg taggtgtcta ggctggtttg ggcgggctag gcgggtgcct agatggtcta 960

ggcgggcacc tcaataggtc taggtaccct ttcttaattt tcaaatgcct aggcattaat 1020

cggggcagtg gctagccacc taccgcctac cccatgggcg gggattttta gaatagtaag 1080

caccaataac agctccatat aggatttaac atagcaagaa aaataatgtt agtgatcggg 1140

gccaaaagaa tgggaaggaa acatagtgtt ggtgaatggt gaggtatgag tatcagaaga 1200

tggtatgatg tttatgatgt ttagcgttta gagaaaaaat aagattaaga aggaaaaata 1260

gagttggcaa ggatcaaaag attttatggt cacttgtcag acgtcagatt aatttttgca 1320

atggaaatat aatattcaat acttttttgt ggtaaatggc aggccgaagc caaacaaaaa 1380

caacaaaaac taacacactg catcccaaac atgagctttt cccctcctgt catcatccaa 1440

aatacaagat ggatcaacac tgagcttcct cttaaacttt gaacattaat attcaatatt 1500

tttaagtgtt gtataacaga tgaaacatac ttattagtag tcagataatt atttataaaa 1560

aaggtcgtac ccagtgcaca aggctcccgc tttacgcagg gtatgggaga ggtgaatgtc 1620

ggctagcttt acccccattt attagtagtc agttaattat ttataacaac acataatact 1680

ttggccacaa caaggggtca aaattctttc caacacctgg ctttattttt gacacattaa 1740

ttaccccatc cattcgctct cgcgctctct cttttttttt cctctctttt gagctcaaga 1800

tctatttatt actttgtggc atactcagta tttgttttgt tgacagtggc ggatcttgga 1860

tatgatcatg ttcgagtgtc acacaaataa gcactttccc acaaagtctg ataaataaaa 1920

caggggctta aaatgggagc tgctgctttg tcagcttcaa agtgtgctcc ag 1972

<210>5

<211>3050

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>5

cttgtgtagg ttgatgaatc tcttatgctt aaactagaat tttaacctaa attaagattt 60

tttgggagtt gcttgtgtac ttttttggga tctttatagt agtgaaagtt catttccgta 120

gttcgacatc tgacgttctt cgggcaactg tgcatgttgt gtgacaagca tataggcatg 180

ttatttatta tggacattgc attcatatta ttattacttt ggttacatag ttatttcata 240

ttttgttttc cgcaaaaatt tacatggcaa gtaaatgagg aggtggcatc atcttattaa 300

atgatttaat ggacaagtga tcaaccccaa tttttcttgt ctcttagacc accaaaataa 360

cttacaaata aggacaacat gatggtcgta ttctaaacta atcatacaat gctatacaaa 420

aaaaaagaag ttaaaatata cttgtgaaat tgtaatagat ttgagatgac attaccacaa 480

cgaatgtgtc ttttgcaagt ctctcacact tttcaaatac attaatagat tttctacaag 540

aaaaatagaa atatataaat ttcaaactcg cctttgacaa aaactaatag caacaattaa 600

aaaaacggat ttcaattatg ctgtgcgaaa attacctgtg tgaaaccttt tttttaggaa 660

catgatcgta tccaaatcct ccttgtgata atctcacgga tcagttcatc aatcattctg 720

tggtcagaaa tcattttaaa ttttttattt aaaattgaat acaaacatca catagcaaaa 780

actaaccgcg caatatacaa tgaacgatta agatgaattg aggaccagga aaggatcctt 840

atccaatttt tttacacctg ttccttgtct tgacagtgtc agttttatat gaagttttta 900

acaaaaatac agaaaaaccc atcagccacc acgcctttgc acccacccaa cccagtgagc 960

cgcccaccac ccagtggccg gcaaaccctc ccttctcgat tccggcaaaa gctcatcctt 1020

tgaaccttct gcctcttcct ctcacctttt cttatctacc cagcgaaagc aaacccaaac 1080

cacaaaccca caacatctcc atggctaagt tgagaaaacc gaattgattt gtgccgccgc 1140

cgccgccgcc gccttcagag acgaatatct ctcgtcaaca gaagctcaga ttccccaatt 1200

ccttcggcat caatcaggta tgggttttga agaaatttcg ttttactcaa aagtagacat 1260

acacaatagg acttttttta tattgatttt tgttgagtgg gtttttgagt aattttactg 1320

agtattcaga cccgaaagaa aagtcgtaat attgatgaaa acatttgatt ccgatcgggt 1380

tacagatatc tggttatttg ttaggtttaa ttgcttacta tttgttcaat ggggtttaca 1440

agaactgact gaaaagaagg aacagattat ggctttcata ggactttgtc attcacttga 1500

aaccccagta agtatatgtt ctaatacttt tcgttcagat tgtttaaatg cttctgggtt 1560

taggggcgag tattgttatt ggcacacaaa taacataatc atgcgcaact ccatgtataa 1620

attctcccct ataaaaaagt acaaggaatg gggaatgaca tttttgaagc accaacaaga 1680

ttctaaaata cactaggcgc tagttggcta gggcctatcg cctagatggc taagccgatt 1740

taggtaaata tattatattt cgtataaata agtgtctgct tatacttaaa gtacatataa 1800

tttcatcata aattacaaaa taaaattaca tatatattat gaagtattta aacataatga 1860

aaacataggg aacgatgata taatgtgtgt tcatttaagc atgcatcaag tctcttacaa 1920

tcttttgaaa aagataaaat gcaaaatgaa agttatctat tttctatcta agagagttgc 1980

aacctaggta ggtgtctagg ctggtttggg cgggctaggc gggtgcctag atggtctagg 2040

cgggcacctc aataggtcta ggtacccttt cttaattttc aaatgcctag gcattaattg 2100

gggcagtggc cagccaccta ccgcctaccc catgggcggg gatttttaga atagtaagca 2160

ccaataacag ctccatatag gatttaacat agcaagaaaa ataatgttag tgatcggggc 2220

caaaagaatg ggaaggaaac atagtgttgg tgaatggtga ggtatgagta tcagaagatg 2280

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ggaaatataa tattcaatac ttttttgtgg taaatggcag gccgaagcca aacaaaaaca 2460

acaaaaacta acacactgca tcccaaacat gagcttttcc cctcctgtca tcatccaaaa 2520

tacaagatgg atcaacactg agcttcctct taaactttga acattaatat tcaatatttt 2580

taagtgttgt ataacagatg aaacatactt attagtagtc agataattac ttataaaaaa 2640

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ctagctttac ccccatttat tagtagtcag ttaattattt ataacaacac ataatacttt 2760

ggccacaaca aggggtcaaa attctttcca acacctggct ttatttttga cacattaatt 2820

accccatcca ttcgctctcg cgctctctct ttttttttcc tctcttttga gctcaagatc 2880

tatttattac tttgtggcat actcagtatt tgttttgttg acagtggcgg atcttggata 2940

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ggggcttaaa atgggagctg ctgctttgtc agcttcaaag tgtgctccag 3050

<210>6

<211>2025

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>6

agccttagta ttattatgac tgacaaacaa aggttgtctc ttttatattc ccaattaatt 60

tacatgatta gaatggaaca tagggtttct catgttgtgt ttatgggtga aatagtctat 120

atatgtctcc atatgattga agagttttac ttgtgaattt tagtggtgtg tcgtgttata 180

aagagttaaa ggttgcatat aaaagcatgc ttaagcgtta actaattaac aacttaatac 240

ggtgctaact gttcgattag gtctccccta caaattgaac ttacgatccg ttcatttttt 300

agtgctcttt catattattc ttactgaaat tggaaatcat ttaatctttt aattattatt 360

gtcttttatg gaaacaaatg caaattcaga tatcaaacag atgtgtttgt ctaagagaga 420

gagagggggt ttggatgata gaaaggggac ctagtcatta attatcattg taaattgtat 480

tgtttattta tttatcaagt ccagttaaat aactcatctt caattttaat gaaattttgc 540

aagatgatct ttcattgata acctaaaact tgttagttca aattgtaaaa atattgtgaa 600

atgagtttaa acgagtgttt agcaccatat taagttacta actggtttga aaagtactct 660

gtaattttgt tttgttacaa atgctattct acactaatat acattaagaa gaggagaagc 720

tttgaactga agaagtaacg aataaagagg aagcttctct aacttccagt accagagcaa 780

tccattactt gtactagttt gataagtttt actttcacag tcaaattgtg ttatgtcgtg 840

ttaacgagtg aaattgttga taggcttgag atatgggcca ggtcaggact ctaagggggc 900

gtttgtttac cctcattaag tgggactaga ctggattgga ctagctgtta gtccaatact 960

gtgtttgttc catgctggga ctaacattaa tgagactaaa ggggactagc atggacaaaa 1020

cccttcacta agtggtctta gcgagacccc ccaataacca tgggactagc taagactatc 1080

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cctagatcat aataaaatat taataattta tatattaaat aatataatat tagaatttgt 1200

tattatccag cttcttagtc caacactgca ccaaacgttt cactaagtta gtccagctta 1260

gtctagtcta agccagtcca acttagtcct tgaagctagt ccagtccgag atagtccagc 1320

gcaacaaacg ccccctaaga ggttacaatc agtgtatatt tctggggcca agactgtggc 1380

tcaaaggaac aaaataacca gcccaatgta atcttgtctt gcccttgctc taaacatttt 1440

gattgactga actttgtgcc ctagcataat atatacattt tttttttaaa ttcttccgca 1500

aatccaattt atttttaagg aaatgaaaat tgctgctggt cacaaacatt ttattcatgg 1560

ttcaccttat ctcttcatgc atcttcattc aagaaaacaa caaaataaaa ccccacaata 1620

atagacatgg gtttttccag tttcttccat tctcaattct gtggccaata aattgtctga 1680

attttatttt ttgtcacaaa gaaattgcct aatttttggt ggagaagaag agagcttaaa 1740

cactaacctc aggtcctcaa gcaccaagaa acgagtcaaa tgactgagtt tccaagcact 1800

ctttgtttga cacgtggcat caatgcaatc ttcattctat ggtctcaaac cattcaacaa 1860

gcaaatccaa acgatatcaa attctgtaca ctaacactat aaaggcaaac cagctctcat 1920

ttcttttccg ctcaaaacac aatagcatac tgtgcttgcg ggcaaccagg agtgcccccc 1980

tctgtcactc acactagaac acaaccgtcc gatccgcgag agatc 2025

<210>7

<211>2542

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>7

taacttgaga ccaagatagc cactttcgag ccgttttccg gccaaaccac tgtgagttag 60

ccactgaaaa aggtaccatt cttttcttct agtccagaag tatgattttc gtttttgaat 120

cacttaattt tgttgaatat tgaagaagtt atgaatgttt aaagtttatc cagttttcga 180

cgggttttcc aattttccct cagaccagtc aactttgagg ctattttcag accatctccg 240

acaaccattg ggcttccaaa taggtataat cttgttctaa actttcatat cttcattttg 300

atatattatg gctcgacttt gattaagaaa cgattgagtt acaaagcctt gaaaattgcc 360

caaacttccg gccaagaggt tcgggacact tgacagagtt tttaacggaa tgaccaaaat 420

gatggatgat ggacatctca gggaccactt ctattgattt gaatctcagg gaccaaagtg 480

aggagttatg cgaatttcat agaccacttt ggctaaaaag ccttagtatt attatgactg 540

acaaacaaag gttgtctctt ttatattccc aattaattta catgattaga atggaacata 600

gggtttctca tgttgtgttt atgggtgaaa tagtctatat atgtctccat atgattgaag 660

agttttactt gtgaatttta gtggtgtgtc gtgttataaa gagttaaagg ttgcatataa 720

aagcatgctt aagcgttaac taattaacaa cttaatacgg tgctaactgt tcgattaggt 780

ctcccctaca aattgaactt acgatccgtt cattttttag tgctctttca tattattctt 840

actgaaattg gaaatcattt aatcttttaa ttattattgt cttttatgga aacaaatgca 900

aattcagata tcaaacagat gtgtttgtct aagagagaga gagggggttt ggatgataga 960

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ctaaaacttg ttagttcaaa ttgtaaaaat attgtgaaat gagtttaaac gagtgtttag 1140

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taagttttac tttcacagtc aaattgtgtt atgtcgtgtt aacgagtgaa attgttgata 1380

ggcttgagat atgggccagg tcaggactct aagggggcgt ttgtttaccc tcattaagtg 1440

ggactagact ggattggact agctgttagt ccaatactgt gtttgttcca tgctgggact 1500

aacattaatg agactaaagg ggactagcat ggacaaaacc cttcactaag tggtcttagc 1560

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acaaacactc tcgatagact cctcgtcatc tccagtcacc tagatcataa taaaatatta 1680

ataatttata tattaaataa tataatatta gaatttgtta ttatccagct tcttagtcca 1740

acactgcacc aaacgtttca ctaagttagt ccagcttagt ctagtctaag ccagtccaac 1800

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agcataatat atacattttt tttttaaatt cttccgcaaa tccaatttat ttttaaggaa 2040

atgaaaattg ctgctggtca caaacatttt attcatggtt caccttatct cttcatgcat 2100

cttcattcaa gaaaacaaca aaataaaacc ccacaataat agacatgggt ttttccagtt 2160

tcttccattc tcaattctgt ggccaataaa ttgtctgaat tttatttttg tcacaaagaa 2220

attgcctaat ttttggtgga gaagaagaga gcttaaacac taacctcagg tcctcaagca 2280

ccaagaaacg agtcaaatga ctgagtttcc aagcactctt tgtttgacac gtggcatcaa 2340

tgcaatcttc attctatggt ctcaaaccat tcaacaagca aatccaaacg atatcaaatt 2400

ctgtacacta acactataaa ggcaaaccag ctctcatttc ttttccgctc aaaacacaat 2460

agcatactgt gcttgcgggc aaccaggagt gcccccctct gtcactcaca ctagaacaca 2520

accgtccgat ccgcgagaga tc 2542

Claims (7)

1.DNA分子，所述DNA分子如序列表中序列2所示。

2.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组菌。

3.扩增权利要求1所述DNA分子的引物对。

4.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述表达盒或重组载体或重组菌在植物细胞中启动目标基因表达中的应用；所述植物为苹果。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物细胞为原生质体细胞。

6.一种表达目标基因的方法，包括如下步骤：以权利要求1所述DNA分子作为启动子来启动目标基因在苹果中的表达。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述表达目标基因为在苹果原生质体细胞中表达目标基因；所述苹果原生质体细胞是以在添加植物激素的MS培养基上生长10天的苹果愈伤组织细胞为试材分离制备得到的苹果原生质体细胞。

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