CN112770769A

CN112770769A - 结合her2、nkg2d和cd16的多特异性结合蛋白及其使用方法

Info

Publication number: CN112770769A
Application number: CN201980061436.2A
Authority: CN
Inventors: 格雷戈里·P·常; 安·F·张; 阿斯亚·格林贝格; 威廉·哈尼; 尼古拉·瓦格曼; 布拉德利·M·伦德; 比昂卡·普林茨
Original assignee: Dragonfly Therapy Co ltd
Current assignee: Dragonfly Therapy Co ltd; Dragonfly Therapeutics Inc
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2019-08-07
Publication date: 2021-05-07
Also published as: IL280656A; AU2019318425B2; AU2019318425A1; JP7431394B2; EP3833386A4; SG11202101276QA; EA202091888A1; FI3833386T3; BR112021002213A2; IL280656B1; EP4249067A3; ES2954851T3; CA3108794A1; MX2021001508A; KR20210042121A; WO2020033587A1; DK3833386T3; EP4249067A2; IL280656B2; EP3833386A1

Abstract

描述了结合并杀死表达表皮生长因子受体2(HER2或ErbB2)的人类癌细胞，但不杀死表达HER2的非癌性健康人类细胞的多特异性结合蛋白，以及可用于治疗表达HER2的癌症的药物组合物和治疗方法。本发明还涉及引发肿瘤细胞的CD8+T细胞灭杀的多特异性结合蛋白。

Description

结合HER2、NKG2D和CD16的多特异性结合蛋白及其使用方法

与相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月8日提交的美国临时专利申请号62/716,259的利益和优先权，所述临时申请的公开内容为所有目的整体通过引用并入本文。

序列表

本申请含有以ASCII格式电子提交并整体通过引用并入本文的序列表。所述在2019年8月6日生成的ASCII拷贝被命名为DFY-057WO_SL.txt，大小为208,511字节。

技术领域

本发明涉及结合NKG2D、CD16和表皮生长因子受体2(HER2或ErbB2)的多特异性结合蛋白。这些多特异性结合蛋白可用于杀死表达Her2的人类癌细胞，而对表达HER2的非癌性健康人类细胞没有显著细胞毒性。

背景技术

尽管在文献中已报道了治疗癌症的大量研究尝试和科学进展，但这种疾病依然是显著的健康问题。一些最频繁被诊断到的癌症包括前列腺癌、乳腺癌和肺癌。前列腺癌是男性中最常见的癌症形式。乳腺癌仍然是女性中的主要死因。当前用于这些癌症的治疗选项不对所有患者有效和/或可能具有实质性不利副作用。其他类型的癌症对于使用现有治疗选项治疗来说也仍然具有挑战性。

癌症免疫疗法是理想的，因为它们是高度特异性的并且可以使用患者自己的免疫系统来促进癌细胞的破坏。融合蛋白例如双特异性T-细胞衔接器是文献中描述的结合到肿瘤细胞和T-细胞以促进肿瘤细胞破坏的癌症免疫疗法。结合到某些肿瘤相关抗原和结合到某些免疫细胞的抗体在文献中已有描述。参见例如WO 2016/134371和WO 2015/095412。

自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的组分并占循环淋巴细胞的大约15％。NK细胞事实上浸润所有组织，并且最初因它们不需前期致敏即可有效杀死肿瘤细胞的能力而被表征。活化的NK细胞通过与细胞毒性T细胞相似的手段杀死靶细胞，即通过含有穿孔蛋白和颗粒酶的细胞溶解颗粒以及通过死亡受体途径。活化的NK细胞还分泌炎性细胞因子例如IFN-γ和促进其他白细胞向靶组织的召集的趋化因子。

NK细胞通过它们表面上的各种不同活化和抑制受体对信号做出响应。例如，当NK细胞遇到健康的自体细胞时，它们的活性通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的活化而被抑制。或者，当NK细胞遇到外来细胞或癌细胞时，它们通过它们的活化受体(例如NKG2D、NCR、DNAM1)而被活化。NK细胞也通过它们表面上的CD16受体被某些免疫球蛋白的恒定区活化。NK细胞对活化的总体灵敏度取决于刺激性和抑制性信号的总和。

HER2(ErbB2)是一种属于表皮生长因子受体家族的跨膜糖蛋白。它是一种受体酪氨酸激酶，并调控细胞存活、增殖和生长。HER2在人类恶性肿瘤中发挥重要作用。ERBB2基因在大约30％的人类乳腺癌中被扩增或过表达。患有过表达HER2的乳腺癌的患者与癌症不过表达HER2的患者相比具有明显更低的总体生存率和更短的无病间隔期。此外，HER2的过表达导致乳腺癌转移增加。已知HER2的过表达也发生在许多其他癌症类型中，包括乳腺癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌和胃癌、涎腺导管癌、肺的腺癌和子宫癌的侵袭形式例如子宫浆液性子宫内膜癌。

发明内容

本发明涉及结合并杀死表达表皮生长因子受体2(HER2或ErbB2)的人类癌细胞的多特异性结合蛋白。本发明提供了结合到癌细胞上的HER2并结合到自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体的多特异性结合蛋白。这些蛋白质可以接合超过一种NK活化受体，并且可以阻断天然配体与NKG2D的结合。在某些实施方式中，所述蛋白质可以在人类和其他物种例如啮齿动物和食蟹猴中激动NK细胞。在某些实施方式中，所述蛋白质可以在人类和其他物种例如人类、啮齿动物和食蟹猴中刺激T细胞。本发明的各个不同方面和实施方式将在下文中更详细描述。

一方面，本发明提供了一种蛋白质(例如多特异性结合蛋白)，其包含：(a)包含结合NKG2D的Fab片段的第一抗原结合位点；(b)包含结合HER2的单链可变片段(scFv)的第二抗原结合位点；和(c)抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分或结合CD16的第三抗原结合位点。

在某些实施方式中，所述scFv通过包含Ala-Ser的铰链连接到所述抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分或所述结合CD16的第三抗原结合位点。在某些实施方式中，所述scFv连接到所述抗体Fc结构域。

在某些实施方式中，所述scFv包含重链可变结构域和轻链可变结构域。在某些实施方式中，所述scFv的重链可变结构域与所述scFv的轻链可变结构域形成二硫键。在某些实施方式中，所述二硫键在所述重链可变结构域的C44与所述轻链可变结构域的C100之间形成。

在某些实施方式中，所述scFv的轻链可变结构域通过柔性连接物连接到所述scFv的重链可变结构域。在某些实施方式中，所述柔性连接物包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述柔性连接物由SEQ ID NO：143的氨基酸序列构成。在某些实施方式中，所述轻链可变结构域位于所述重链可变结构域的N-端或C-端。在某些实施方式中，所述轻链可变结构域位于所述重链可变结构域的N-端。

在某些实施方式中，所述Fab片段连接到所述抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分或所述结合CD16的第三抗原结合位点。

在某些实施方式中，所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含：包含分别由SEQ IDNO：168、96和169的氨基酸序列所表示的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。在某些实施方式中，所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含：包含分别由SEQ ID NO：95、96和97的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。

在某些实施方式中，本发明的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含：

(a)包含分别由SEQ ID NO：168、96和169的氨基酸序列所表示的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(b)包含分别由SEQ ID NO：168、96和173的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(c)包含分别由SEQ ID NO：95、96和97的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；和包含分别由SEQID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(d)包含分别由SEQ ID NO：166、88和167的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：91、92和93的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(e)包含分别由SEQ ID NO：162、72和170的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：107、108和109的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(f)包含分别由SEQ ID NO：162、72和163的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：75、76和77的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(g)包含分别由SEQ ID NO：164、80和165的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：75、76和85的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(h)包含分别由SEQ ID NO：168、96和176的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(i)包含分别由SEQ ID NO：168、96和179的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(j)包含分别由SEQ ID NO：168、96和182的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(k)包含分别由SEQ ID NO：168、96和185的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；或

(l)包含分别由SEQ ID NO：168、96和188的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；以及

包含结合HER2的scFv的第二抗原结合位点，所述第二抗原结合位点包含：

(a)包含分别由SEQ ID NO：115、116和117的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：119、120和121的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(b)包含分别由SEQ ID NO：123、124和125的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：127、128和129的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；或

(c)包含分别由SEQ ID NO：131、132和133的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：135、136和137的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。

在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98相关的轻链可变结构域。如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：94至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：94的CDR1(SEQ ID NO：95或168)、CDR2(SEQ ID NO：96)和CDR3(SEQ ID NO：97或169)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：98至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：98的CDR1(SEQID NO：99)、CDR2(SEQ ID NO：100)和CDR3(SEQ ID NO：101)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：144相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：144至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：144的CDR1(SEQ ID NO：95或168)、CDR2(SEQ ID NO：96)和CDR3(SEQ ID NO：172或173)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：98至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：98的CDR1(SEQ ID NO：99)、CDR2(SEQ ID NO：100)和CDR3(SEQ ID NO：101)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：174相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：174至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：174的CDR1(SEQ ID NO：95或168)、CDR2(SEQ ID NO：96)和CDR3(SEQ ID NO：175或176)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：98至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：98的CDR1(SEQ ID NO：99)、CDR2(SEQ ID NO：100)和CDR3(SEQ ID NO：101)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：177相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：177至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：177的CDR1(SEQ ID NO：95或168)、CDR2(SEQ ID NO：96)和CDR3(SEQ ID NO：178或179)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：98至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：98的CDR1(SEQ ID NO：99)、CDR2(SEQ ID NO：100)和CDR3(SEQ ID NO：101)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：180相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：180至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：180的CDR1(SEQ ID NO：95或168)、CDR2(SEQ ID NO：96)和CDR3(SEQ ID NO：181或182)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：98至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：98的CDR1(SEQ ID NO：99)、CDR2(SEQ ID NO：100)和CDR3(SEQ ID NO：101)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：183相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：183至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：183的CDR1(SEQ ID NO：95或168)、CDR2(SEQ ID NO：96)和CDR3(SEQ ID NO：184或185)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：98至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：98的CDR1(SEQ ID NO：99)、CDR2(SEQ ID NO：100)和CDR3(SEQ ID NO：101)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：186相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：186至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：186的CDR1(SEQ ID NO：95或168)、CDR2(SEQ ID NO：96)和CDR3(SEQ ID NO：187或188)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：98至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：98的CDR1(SEQ ID NO：99)、CDR2(SEQ ID NO：100)和CDR3(SEQ ID NO：101)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：86相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：90相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：86至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：86的CDR1(SEQ ID NO：87或166)、CDR2(SEQ ID NO：88)和CDR3(SEQ ID NO：89或167)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：90至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：90的CDR1(SEQ ID NO：91)、CDR2(SEQ ID NO：92)和CDR3(SEQ ID NO：93)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：102相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：106相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：102至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：102的CDR1(SEQ ID NO：71或162)、CDR2(SEQ ID NO：72)和CDR3(SEQ ID NO：105或170)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：106至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ IDNO：106的CDR1(SEQ ID NO：107)、CDR2(SEQ ID NO：108)和CDR3(SEQ ID NO：109)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：70相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：74相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：70至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：70的CDR1(SEQ ID NO：71或162)、CDR2(SEQ ID NO：72)和CDR3(SEQ ID NO：73或163)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：74至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：74的CDR1(SEQ ID NO：75)、CDR2(SEQ ID NO：76)和CDR3(SEQ ID NO：77)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：78相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：82相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：78至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：78的CDR1(SEQ ID NO：79或164)、CDR2(SEQ ID NO：80)和CDR3(SEQ ID NO：81或165)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：82至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：82的CDR1(SEQ ID NO：75)、CDR2(SEQ ID NO：76)和CDR3(SEQ ID NO：77)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，当通过表面等离子体共振测量时，所述第一抗原结合位点以2nM至120nM的K_D结合NKG2D。在某些实施方式中，当通过表面等离子体共振测量时，所述蛋白质以2nM至120nM的K_D结合NKG2D。

在某些实施方式中，所述结合HER2的第二抗原结合位点包含与SEQ ID NO：195相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：196相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：195至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：195的CDR1(SEQ IDNO：115)、CDR2(SEQ ID NO：116)和CDR3(SEQ ID NO：117)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：196至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ IDNO：196的CDR1(SEQ ID NO：119)、CDR2(SEQ ID NO：120)和CDR3(SEQ ID NO：121)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述结合HER2的第二抗原结合位点包含含有SEQ IDNO：139的氨基酸序列的scFv。

可选地，所述结合HER2的第二抗原结合位点包含与SEQ ID NO：197相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：198相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：197至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：197的CDR1(SEQ ID NO：123)、CDR2(SEQ ID NO：124)和CDR3(SEQ ID NO：125)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：198至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：198的CDR1(SEQ ID NO：127)、CDR2(SEQ ID NO：128)和CDR3(SEQ ID NO：129)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述结合HER2的第二抗原结合位点包含含有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的scFv。

可选地，所述结合HER2的第二抗原结合位点包含与SEQ ID NO：199相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：200相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：199至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：199的CDR1(SEQ ID NO：131)、CDR2(SEQ ID NO：132)和CDR3(SEQ ID NO：133)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：200至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：200的CDR1(SEQ ID NO：135)、CDR2(SEQ ID NO：136)和CDR3(SEQ ID NO：137)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述结合HER2的第二抗原结合位点包含含有SEQ ID NO：171的氨基酸序列的scFv。

在某些实施方式中，所述抗体Fc结构域包含人类IgG1抗体的铰链和CH2结构域。在某些实施方式中，所述抗体Fc结构域包含与人类IgG1抗体的第234-332位氨基酸至少90％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体Fc结构域包含含有与人类IgG1的Fc结构域至少90％同一性的氨基酸序列的Fc结构域，并在选自Q347、Y349、T350、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、K439的一个或多个位置处有差异。

在某些实施方式中，所述抗体Fc结构域包含含有Q347R、D399V和F405T替换的人类IgG1的Fc结构域，例如在连接到scFv的Fc结构域中。在某些实施方式中，所述抗体Fc结构域包含含有K360E和K409W替换的人类IgG1的Fc结构域，例如在连接到Fab片段的Fc结构域中。

在某些实施方式中，所述抗体Fc结构域包含含有T366W替换的人类IgG1的Fc结构域，例如在连接到Fab片段的Fc结构域中。在某些实施方式中，所述抗体Fc结构域包含含有T366S、L368A和Y407V替换的人类IgG1的Fc结构域，例如在连接到scFv的Fc结构域中。

在某些实施方式中，所述蛋白质包含SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：148的序列。在某些实施方式中，该序列代表连接到所述抗体Fc结构域的Fab片段的重链部分。

在某些实施方式中，所述蛋白质包含SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：146的序列。在某些实施方式中，该序列代表连接到所述抗体Fc结构域的scFv。

另一方面，本公开提供了一种蛋白质(例如多特异性结合蛋白)，其包含：(a)包含与SEQ ID NO：141至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的第一多肽；(b)包含与SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：190或SEQ ID NO：192至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的第二多肽；和(c)包含与SEQ ID NO：142至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的第三多肽。在某些实施方式中，所述第二多肽包含与SEQ ID NO：140至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

另一方面，本公开提供了一种蛋白质(例如多特异性结合蛋白)，其包含：(a)包含与SEQ ID NO：141至少95％(例如95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的第一多肽；(b)包含与SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：190或SEQ ID NO：192至少95％(例如95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的第二多肽；和(c)包含与SEQID NO：142至少95％(例如95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的第三多肽。在某些实施方式中，所述第二多肽包含与SEQ ID NO：140至少95％(例如95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

另一方面，本公开提供了一种蛋白质(例如多特异性结合蛋白)，其包含：(a)包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的第一多肽；(b)包含SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：190或SEQID NO：192的氨基酸序列的第二多肽；和(c)包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的第三多肽。在某些实施方式中，所述蛋白质包含：(a)包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的第一多肽；(b)包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的第二多肽；和(c)包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的第三多肽。

另一方面，本公开提供了一种剂型，其包含本文公开的蛋白质和可药用载体。

另一方面，本公开提供了一种细胞，其包含表达本文公开的蛋白质的一种或多种核酸。

另一方面，本公开提供了一种直接和/或间接增加肿瘤细胞死亡的方法，所述方法包括将肿瘤和自然杀伤细胞暴露于本文公开的蛋白质。

另一方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法，其中所述方法包括向需要的患者给药本文公开的蛋白质或剂型。在某些实施方式中，所述癌症选自乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺的腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈部癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、间皮瘤、肉瘤和胆囊癌。

附图说明

图1示出了一种三特异性抗体(TriNKET)，其含有结合HER2的scFv、靶向NKG2D的Fab和结合CD16的异二聚化抗体恒定区/结构域(“CD结构域”)(scFv-Fab格式)。在示例性实施方式中，所述连接到Fab片段的Fc结构域包含K360E和K409W突变，并且所述连接到scFv的Fc结构域包含用于形成Fc异二聚体的匹配的突变Q347R、D399V、F405T(在图1中被显示为Fc结构域中的三角形锁匙格式)。所述抗体格式在本文中被称为F3’-TriNKET。在另一个示例性实施方式中，所述连接到的Fab片段的Fc结构域包含突变Q347R、D399V和F405T，并且所述连接到scFv的Fc结构域包含用于形成异二聚体的匹配的突变K360E和K409W。

图2是“杵臼结构(knob-into-hole)”(KiH)TriNKET的图示，其包括通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的结合HER2的scFv和结合NKG2D的Fab片段，包括(a)包含重链可变结构域和连接到Fc结构域的CH1结构域的重链部分，和(b)包含轻链可变结构域和CL结构域的轻链部分。在示例性实施方式中，所述连接到Fab片段的Fc结构域包含杵突变T366W，并且所述连接到scFv的Fc结构域包含匹配的“臼”突变T366S、L368A、Y407V(在图2中被显示为Fc结构域中的三角形锁匙格式)。在示例性实施方式中，所述连接到Fab片段的Fc结构域包含杵突变T366S、L368A、Y407V，并且所述连接到scFv的Fc结构域包含“臼”突变T366W。

图3是线图，证实了在HER2+(低)细胞系上靶向HER2的TriNKET比曲妥珠单抗更加有效。

图4是线图，证实了在HER2++细胞系上靶向HER2的TriNKET比曲妥珠单抗更加有效。

图5是线图，证实了在HER2+++细胞系上靶向HER2的TriNKET比曲妥珠单抗更加有效。

图6示出了在长期灭杀测定法中靶向HER2的TriNKET表现优于曲妥珠单抗。

图7示出了在长期灭杀测定法中靶向HER2的TriNKET表现优于曲妥珠单抗。

图8A至8F是FACS，示出了靶向HER2的TriNKET对人类血液中的免疫细胞表现出极低结合。图8A示出了靶向HER2的TriNKET对人类血液中的NK细胞显示出极低结合；图8B示出了靶向HER2的TriNKET对CD8+T细胞显示出极低结合；图8C示出了靶向HER2的TriNKET对CD4+T细胞显示出极低结合；图8D示出了靶向HER2的TriNKET对B细胞显示出极低结合；图8E示出了靶向HER2的TriNKET对单核细胞显示出极低结合；并且图8F示出了靶向HER2的TriNKET对粒细胞显示出极低结合(点线–第二抗体对照；虚线–曲妥珠单抗；实线–HER2-F3’-TriNKET-A49)。

图9是证实了A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗与人类心肌细胞SKBR3、H661和786-O癌细胞的结合的线图。

图10A示出了在以1:1的PBMC与靶细胞比例(E:T)共培养3天后，SKBR3癌细胞的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗介导的人类PBMC灭杀。

图10B示出了即使在以1:1的PBMC与靶细胞比例(E:T)共培养3天后，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗也不杀死非恶性的健康心肌细胞。

图11A示出了在以20:1的PBMC与靶细胞比例(E:T)共培养3天后，SKBR3癌细胞的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗介导的人类PBMC灭杀。

图11B示出了即使在以20:1的PBMC与靶细胞比例(E:T)共培养3天后，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗也不杀死非恶性的健康心肌细胞。

图12A至12B示出了使用conA刺激产生并用IL-15培养的CD8+T细胞具有高纯度(99％的CD3+CD8+细胞)(图12A)，并且均表达NKG2D(图12B)但不表达CD16(图12C)。

图13A至13B是示出了在用IL-15培养后，CD8+T细胞在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗存在下的细胞毒性活性的图。图13A示出了在短期共培养物中SkBr-3肿瘤细胞被A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的灭杀提高。靶向HER2的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗引发SkBr-3靶细胞被IL-15刺激的CD8+T细胞的剂量依赖性裂解。图13B示出了67nM靶向HER2的TriNKET引发SkBr-3靶细胞被IL-2刺激的CD8+T细胞的裂解。点线指示了仅使用与SkBr-3肿瘤细胞共培养的CD8+T细胞(未处理的)的效果。

图14A示出了各自在抗CD3抗体存在下单独培养、与CD8+T细胞共培养和与CD8+T细胞和A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗共培养的SkBr-3细胞的百分生长水平。

图14B示出了各自在不存在抗CD3抗体的情况下单独培养、与CD8+T细胞共培养和与CD8+T细胞和A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗共培养的SkBr-3细胞的百分生长水平。

图15A至15B示出了TriNKET结合到具有高水平HER2表达的SkBr-3细胞系，正如通过与一系列浓度的TriNKET或曲妥珠单抗和偶联有荧光团的第二抗体温育的SkBr-3细胞的流式细胞术所测量的。图15A将所述结合水平显示为荧光强度中值(MFI)相对于使用与670nMTriNKET温育的细胞所观察到的最大MFI的百分率值。图15B将所述结合水平显示为MFI相对于使用仅与第二抗体温育的细胞所观察到的背景MFI的与背景相比的倍数(FOB)值。

图16A至16B示出了TriNKET结合到具有中等水平HER2表达的NCI-H661细胞系，正如通过与一系列浓度的TriNKET或曲妥珠单抗和偶联有荧光团的第二抗体温育的NCI-H661细胞的流式细胞术所测量的。图16A将所述结合水平显示为荧光强度中值(MFI)相对于使用与670nM TriNKET温育的细胞所观察到的最大MFI的百分率值。图16B将所述结合水平显示为MFI相对于使用仅与第二抗体温育的细胞所观察到的背景MFI的与背景相比的倍数(FOB)值。

图17A至17B示出了TriNKET结合到具有低水平HER2表达的786-O细胞系，正如通过与一系列浓度的TriNKET或曲妥珠单抗和偶联有荧光团的第二抗体温育的786-O细胞的流式细胞术所测量的。图16A将所述结合水平显示为荧光强度中值(MFI)相对于使用与670nMTriNKET温育的细胞所观察到的最大MFI的百分率值。图16B将所述结合水平显示为MFI相对于使用仅与第二抗体温育的细胞所观察到的背景MFI的与背景相比的倍数(FOB)值。

图18A至18B示出了靶向HER2的TriNKET结合到表达hNKG2D的EL4细胞，正如通过与一系列浓度的TriNKET或曲妥珠单抗和偶联有荧光团的第二抗体温育的EL4细胞的流式细胞术所测量的。所述结合水平被显示为MFI相对于使用仅与第二抗体温育的细胞所观察到的背景MFI的与背景相比的倍数(FOB)值。

图19显示出TriNKET与Fc沉默的TriNKET和曲妥珠单抗的组合相比在介导786-O靶细胞的NK细胞灭杀中更加强力且有效。

图20显示出TriNKET与Fc沉默的TriNKET和曲妥珠单抗的组合相比在介导H661靶细胞的NK细胞灭杀中更加强力且有效。

图21是线图，示出了TriNKET A和TriNKET A*(其中A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的M102被I替换)在介导NK细胞针对SKBR-3靶细胞的细胞毒性中的效能。

详细描述

本发明提供了结合癌细胞上的HER2和自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体的多特异性结合蛋白、包含此类多特异性结合蛋白的药物组合物和使用此类多特异性蛋白和药物组合物的治疗方法，包括用于癌症的治疗。本发明的各个不同方面在下文分章节阐述；然而，在一个特定章节中描述的本发明的方面不应限于任何特定章节。

为了便于本发明的理解，下文定义了许多术语和短语。

当在本文中使用时，没有具体数目的指称意味着“一个或多个”，并包括复数指称物，除非上下文不适合。

当在本文中使用时，术语“抗原结合位点”是指免疫球蛋白分子的参与抗原结合的部分。在人类抗体中，抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N-端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。所述重链和轻链的V区内的三个高度趋异的区段被称为“高变区”，它们插入在被称为“构架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在人类抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此配置，以形成抗原结合表面。所述抗原结合表面与被结合的抗原的三维表面互补，并且每个重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。在某些动物例如骆驼和软骨鱼中，抗原结合位点由单一抗体链形成，提供了“单域抗体”。抗原结合位点可以存在于完整抗体中、抗体的保留了抗原结合表面的抗原结合片段中或重组多肽例如scFv中，所述scFv在单一多肽中使用肽连接物将重链可变结构域连接到轻链可变结构域。本文公开的重链或轻链可变区中的所有氨基酸位置按照Kabat编号系统编号。

当在本文中使用时，术语“肿瘤相关抗原”意味着与癌症相关的任何抗原，包括但不限于蛋白质、糖蛋白、神经节苷脂、糖类或脂类。这些抗原可以表达在恶性细胞上或肿瘤微环境中，例如与肿瘤相关的血管、细胞外基质、间充质基质或免疫浸润物上。

抗原结合位点的CDR可以通过在Kabat等，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of protein of immunologicalinterest)(1991)，Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和MacCallum等，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)中描述的方法来确定。在这些定义下确定的CDR在相互比较时通常包括氨基酸残基的交叠或子集。在某些实施方式中，术语“CDR”是通过MacCallum等，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)和Martin A.，“抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析”(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)，《抗体工程》(Antibody Engineering)，Kontermann和Dubel主编，第31章，pp.422-439，Springer-Verlag，Berlin(2001)所定义的CDR。在某些实施方式中，术语“CDR”是通过Kabat等，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of protein of immunological interest)(1991)所定义的CDR。在某些实施方式中，抗体的重链CDR和轻链CDR使用不同的惯例来定义。例如，在某些实施方式中，重链CDR按照MacCallum(同上)来定义，而轻链CDR按照Kabat(同上)来定义。CDRH1、CDRH2和CDRH3表示重链CDR，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3表示轻链CDR。

当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”是指将要通过本文描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠科、猿猴、马科、牛科、猪科、犬科、猫科动物等)，更优选地包括人类。

当在本文中使用时，术语“有效量”是指化合物(例如本发明的化合物)的足以实现有益或所需结果的量。有效量可以在一次或多次给药、施用或剂量中给药，并且不打算限于特定剂型或给药途径。当在本文中使用时，术语“治疗”包括导致病症、疾病、障碍等的改善的任何效应例如减轻、降低、调节、改善或消除或改善其症状。

当在本文中使用时，术语“药物组合物”是指活性药剂与惰性或有活性的载体的组合，使得所述组合物特别适合于体内或离体诊断或治疗用途。

当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指任何标准的制药载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种不同类型的润湿剂。所述组合物也可以包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，《Remington's制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack Publ.Co.,Easton,PA[1975]。

当在本文中使用时，术语“可药用盐”是指本发明的化合物的任何制药上可接受的盐(例如酸或碱式盐)，其在给药到受试者后，能够提供本发明的化合物或其有活性的代谢物或残留物。正如本领域技术人员所知，本发明的化合物的“盐”可以源自于无机或有机酸和碱。示例性的酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸例如草酸，尽管本身不是可药用的，但可用于制备在获得本发明的化合物及其可药用酸加成盐中可用作中间体的盐。

示例性的碱包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨和式NW₄+的化合物(其中W是C_1-4烷基)等。

示例性的盐包括但不限于：乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，柠檬酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊烷丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，延胡索酸盐，氟代庚酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，2-羟基乙磺酸盐，乳酸盐，马来酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，苯基丙酸盐，苦味酸盐，新戊酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，甲苯磺酸盐，十一烷酸盐等。盐的其他实例包括与适合的阳离子例如Na⁺、NH₄ ⁺和NW₄ ⁺(其中W是C_1-4烷基)等化合的本发明的化合物的阴离子。

对治疗应用来说，设想的本发明的化合物的盐是可药用的。然而，不可药用的酸和碱的盐也可以在例如可药用化合物的制备或纯化中发现用途。

在整个本描述中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分时，或在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，设想了另外还存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本发明的组合物，并且还存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。

一般来说，除非另有规定，否则规定百分率的组成是以重量计的。此外，如果变量不伴有定义，则以所述变量的以前的定义为准。

I.蛋白质

本发明提供了结合癌细胞上的HER2和自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以活化自然杀伤细胞的多特异性结合蛋白。所述多特异性结合蛋白在本文描述的药物组合物和治疗方法中有用。所述多特异性结合蛋白与自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体的结合增强了所述自然杀伤细胞对癌细胞的破坏的活性。所述多特异性结合蛋白与癌细胞上的HER2的结合将所述癌细胞带到所述自然杀伤细胞附近，促进了所述癌细胞被所述自然杀伤细胞的直接和间接破坏。示例性的多特异性结合蛋白的进一步描述在下文中提供。

所述多特异性结合蛋白的第一组分结合到表达NKG2D受体的细胞，其可以包括但不限于NK细胞、NKT细胞、γδT细胞和CD8+αβT细胞。在结合NKG2D后，所述多特异性结合蛋白可以阻断天然配体例如ULBP6和MICA结合到NKG2D并活化NK细胞。

所述多特异性结合蛋白的第二组分结合表达HER2的细胞，其可以包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌和胃癌、涎腺导管癌、肺腺癌和子宫癌的侵袭形式例如子宫浆液性子宫内膜癌。

所述多特异性结合蛋白的第三组分结合到表达CD16的细胞，所述CD16是白细胞包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞和滤泡树突细胞的表面上的Fc受体。

本文描述的多特异性结合蛋白可以采取各种不同格式。例如，一种格式涉及一种异二聚体多特异性抗体，其包括第一免疫球蛋白重链、第二免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链(图1)。所述第一免疫球蛋白重链包括通过连接物或抗体铰链融合到Fab片段的第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域，所述Fab片段由包含重链可变结构域和重链CH1结构域的重链部分和包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域(CL)的轻链部分组成，其中所述Fab片段的重链和轻链部分配对并结合NKG2D。所述第二免疫球蛋白重链包括通过连接物或抗体铰链融合到单链可变片段(scFv)的第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域，所述scFv由配对并结合HER2抗原的重链可变结构域和轻链可变结构域组成。

在某些实施方式中，上述单链可变片段(scFv)通过铰链序列连接到所述抗体恒定结构域。在某些实施方式中，所述铰链包含氨基酸Ala-Ser。在某些其他实施方式中，所述铰链包含氨基酸Ala-Ser和Thr-Lys-Gly。所述铰链序列可以提供结合到所述靶抗原的柔性和柔性与最佳几何形状之间的平衡。

在某些实施方式中，上述单链可变片段(scFv)包括重链可变结构域和轻链可变结构域。在某些实施方式中，所述重链可变结构域与所述轻链可变结构域形成二硫键，以增强所述scFv的稳定性。例如，二硫键可以在所述重链可变结构域的C44残基与所述轻链可变结构域的C100残基之间形成，所述氨基酸位置在Kabat下编号。在某些实施方式中，所述重链可变结构域通过柔性连接物连接到所述轻链可变结构域。可以使用任何适合的连接物，例如(G4S)₄连接物(SEQ ID NO：203)。在所述scFv的某些实施方式中，所述重链可变结构域位于所述轻链可变结构域的N-端。在所述scFv的某些实施方式中，所述重链可变结构域位于所述轻链可变结构域的C-端。

本文描述的多特异性结合蛋白还可以包括一个或多个另外的抗原结合位点。所述另外的抗原结合位点可以任选地通过连接物序列融合到所述恒定区CH2结构域的C-端或所述恒定区CH3结构域的C-端。在某些实施方式中，所述另外的抗原结合位点采取单链可变区(scFv)的形式，其任选地被二硫键稳定，产生四价或三价多特异性结合蛋白。例如，多特异性结合蛋白包括NKG2D结合位点、HER2结合位点、结合肿瘤相关抗原的第三抗原结合位点以及抗体恒定区或其足以结合CD16的部分或结合CD16的第四抗原结合位点。这些抗原结合位点中的任一者可以采取Fab或scFv例如上文所述的scFv的形式。在某些实施方式中，所述第三抗原结合位点结合与HER2不同的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述第三抗原结合位点结合同一肿瘤相关抗原HER2，并且示例性格式示出在图2C和2D中。因此，所述多特异性结合蛋白可以提供HER2的二价衔接。HER2被所述多特异性蛋白的二价衔接可以使癌细胞表面上的HER2稳定，并增强NK细胞对所述癌细胞的细胞毒性。HER2被所述多特异性蛋白的二价衔接可以提供所述多特异性蛋白与所述癌细胞的更强结合，从而促进NK细胞对所述癌细胞、特别是对表达低水平HER2的癌细胞的更强的细胞毒性应答。

在所述Fc结构域内，CD16结合由铰链区和CH2结构域介导。例如，在人类IgG1内，与CD16的相互作用主要聚焦于CH2结构域中的氨基酸残基Asp 265–Glu 269、Asn 297–Thr299、Ala 327–Ile 332、Leu 234–Ser 239和糖残基N-乙酰基-D-葡萄糖胺(参见Sondermann等，Nature,406(6793):267-273)。基于已知的结构域，可以选择突变来增强或降低与CD16的结合亲和性，例如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示cDNA文库，或者可以在所述相互作用的已知三维结构的基础上设计。

在某些实施方式中，所述抗体恒定结构域包含IgG抗体例如人类IgG1抗体的CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方式中，将突变引入到所述抗体恒定结构域中，以便能够与另一个抗体恒定结构域异二聚化。例如，如果所述抗体恒定结构域源自于人类IgG1的恒定结构域，则所述抗体恒定结构域可以包含与人类IgG1抗体的第234-332位氨基酸至少90％同一性的氨基酸序列，并在选自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439的一个或多个位置处存在差异。本文公开的Fc结构域或铰链区中的所有氨基酸位置均根据EU编号系统编号。

在某些实施方式中，所述抗体恒定结构域可以包含与人类IgG1抗体的第234-332位氨基酸至少90％同一性的氨基酸序列，并通过选自Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E的一个或多个替换而有所不同。

所述多特异性结合蛋白的单个组分将在下文中更详细描述。

NKG2D结合位点

在与自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体和癌细胞上的肿瘤相关抗原结合后，所述多特异性结合蛋白可以衔接超过一种类型NK活化受体，并且可以阻断天然配体与NKG2D的结合。在某些实施方式中，所述蛋白质可以在人类中激动NK细胞。在某些实施方式中，所述蛋白质可以在人类以及其他物种例如啮齿动物和食蟹猴中激动NK细胞。

表1列出了相组合可以结合到NKG2D的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。在某些实施方式中，所述重链可变结构域和轻链可变结构域以Fab格式排布。在某些实施方式中，所述重链可变结构域和轻链可变结构域可以融合在一起以形成scFv。

表1中列出的NKG2D结合结构域可以在它们对NKG2D的结合亲和性方面有所不同，然而它们都活化人类NK细胞。

除非另有指明，否则表1中提供的CDR序列在Kabat下确定。

可选地，由SEQ ID NO：110表示的重链可变结构域可以与由SEQ ID NO：111表示的轻链可变结构域配对，以形成如US 9,273,136中所示的可以结合到NKG2D的抗原结合位点。

SEQ ID NO：110

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO：111

QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL

可选地，由SEQ ID NO：112表示的重链可变结构域可以与由SEQ ID NO：113表示的轻链可变结构域配对，以形成如US 7,879,985中所示的可以结合到NKG2D的抗原结合位点。

SEQ ID NO：112

QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO：113

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK

所述多特异性结合蛋白可以结合到表达NKG2D的细胞，所述细胞包括但不限于NK细胞、γδT细胞和CD8+αβT细胞。在结合NKG2D后，所述多特异性结合蛋白可以天然配体例如ULBP6和MICA结合NKG2D并活化NK细胞。

所述多特异性结合蛋白结合表达CD16的细胞，所述CD16是白细胞包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和滤泡性树突细胞的表面上的Fc受体。本公开的蛋白质以2nM至120nM，例如2nM至110nM、2nM至100nM、2nM至90nM、2nM至80nM、2nM至70nM、2nM至60nM、2nM至50nM、2nM至40nM、2nM至30nM、2nM至20nM、2nM至10nM、约15nM、约14nM、约13nM、约12nM、约11nM、约10nM、约9nM、约8nM、约7nM、约6nM、约5nM、约4.5nM、约4nM、约3.5nM、约3nM、约2.5nM、约2nM、约1.5nM、约1nM、约0.5nM至约1nM之间、约1nM至约2nM、约2nM至3nM、约3nM至4nM、约4nM至约5nM、约5nM至约6nM、约6nM至约7nM、约7nM至约8nM、约8nM至约9nM、约9nM至约10nM、约1nM至约10nM、约2nM至约10nM、约3nM至约10nM、约4nM至约10nM、约5nM至约10nM、约6nM至约10nM、约7nM至约10nM或约8nM至约10nM的K_D的亲和性结合NKG2D。在某些实施方式中，NKG2D结合位点以10至62nM的K_D结合NKG2D。

HER2结合位点

本文公开的多特异性结合蛋白的HER2结合位点包含融合在一起以形成scFv的重链可变结构域和轻链可变结构域。

表2列出了相组合可以结合HER2的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。

可选地，可以结合HER2的新的抗原结合位点可以通过筛选与由SEQ ID NO：138定义的氨基酸序列或其成熟的细胞外片段的结合来鉴定。

MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV(SEQ IDNO：138)。

所述scFv的VH和VL可以以各种不同取向放置。在某些实施方式中，所述VL位于所述VH的N-端。在某些实施方式中，所述VL位于所述VH的C-端。

所述scFv的VH和VL可以通过连接物例如肽连接物相连。在某些实施方式中，所述肽连接物是柔性连接物。关于所述连接物的氨基酸组成，选择具有提供柔性，不干扰本发明的蛋白质的其他结构域的结构和功能，并且抵抗蛋白酶切割的性质的肽。例如，甘氨酸和丝氨酸残基通常提供蛋白酶抗性。在某些实施方式中，所述VL位于所述VH的N-端并通过连接物连接到所述VH。

所述连接物(例如柔性连接物)的高度可以“短”，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基，或者“长”，例如至少13个氨基酸残基。在某些实施方式中，所述连接物的长度为10-50、10-40、10-30、10-25、10-20、15-50、15-40、15-30、15-25、15-20、20-50、20-40、20-30或20-25个氨基酸残基。

在某些实施方式中，所述连接物包含(GS)_n(SEQ ID NO：204)、(GGS)_n(SEQ ID NO：205)、(GGGS)_n(SEQ ID NO：206)、(GGSG)_n(SEQ ID NO：207)、(GGSGG)_n(SEQ ID NO：208)和(GGGGS)_n(SEQ ID NO：209)序列或由所述序列构成，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些实施方式中，所述连接物包含选自表3中所列出的SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ IDNO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152和SEQ ID NO：154的氨基酸序列或由所述氨基酸序列构成。在某些实施方式中，所述连接物是由SEQ ID NO：143的序列构成的(G4S)₄(SEQ ID NO：203)连接物。

Fc结构域

在所述Fc结构域内，CD16结合由所述铰链区和CH2结构域介导。例如，在人类IgG1内，与CD16的相互作用主要聚焦于氨基酸残基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr 299、Ala327-Ile 332、Leu 234-Ser 239和CH2结构域中的糖残基N-乙酰基-D-葡萄糖胺(参见Sondermann等，Nature, 406(6793):267-273)。在所述已知结构域的基础上，可以选择突变以提高或降低与CD16的结合亲和性，例如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示cDNA文库，或者可以在相互作用的已知三维结构的基础上设计突变。

异二聚体抗体重链的组装可以通过在同一细胞中表达两种不同抗体重链序列来实现，这可能导致每种抗体重链的同二聚体的组装以及异二聚体的组装。促进异二聚体的偏好性组装可以通过在每种抗体重链恒定区的CH3结构域中并入不同的突变来实现，如US13/494870、US16/028850、US11/533709、US12/875015、US13/289934、US14/773418、US12/811207、US13/866756、US14/647480和US14/830336中所示。例如，可以在人类IgG1的基础上在CH3结构域中制造突变，并在第一多肽和第二多肽内并入不同对的氨基酸替换，以允许这两条链选择性地彼此异二聚化。下面示出的氨基酸替换的位置都按照Kabat中的EU指数来编号。

在一种情形中，所述第一多肽中的氨基酸替换将原始氨基酸用选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)的较大氨基酸代替，并且所述第二多肽中的至少一个氨基酸替换将原始氨基酸用选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)的较小氨基酸代替，使得所述较大氨基酸替换(突起)契合到所述较小氨基酸替换(孔穴)的表面中。例如，一个多肽可以包含T366W替换，并且另一个多肽可以包含三个替换，包括T366S、L368A和Y407V。

本发明的抗体重链可变结构域可以被任选地偶联到与抗体恒定区、例如包括铰链、CH2和CH3结构域并含有或不含CH1结构域的IgG恒定区至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述恒定区的氨基酸序列与人类抗体恒定区例如人类IgG1恒定区、IgG2恒定区、IgG3恒定区或IgG4恒定区至少90％同一性。在某些其他实施方式中，所述恒定区的氨基酸序列与来自于另一种哺乳动物例如兔、狗、猫、小鼠或马的抗体恒定区至少90％同一性。与人类IgG1恒定区相比可以在所述恒定区内并入一个或多个突变，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439处。示例性的替换包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。

在某些实施方式中，可以并入到人类IgG1恒定区的CH1中的突变可以在氨基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171和/或V173处。在某些实施方式中，可以并入到人类IgG1恒定区的Cκ中的突变可以在氨基酸E123、F116、S176、V163、S174和/或T164处。

氨基酸替换可以选自下面表4中示出的成组替换。

表4
				第一多肽	第二多肽
组1	S364E/F405A	Y349K/T394F
			组2	S364H/D401K	Y349T/T411E
组3	S364H/T394F	Y349T/F405A
			组4	S364E/T394F	Y349K/F405A
组5	S364E/T411E	Y349K/D401K
			组6	S364D/T394F	Y349K/F405A
组7	S364H/F405A	Y349T/T394F
			组8	S364K/E357Q	L368D/K370S
组9	L368D/K370S	S364K
			组10	L368E/K370S	S364K
组11	K360E/Q362E	D401K
			组12	L368D/K370S	S364K/E357L
组13	K370S	S364K/E357Q
			组14	F405L	K409R
组15	K409R	F405L

可选地，氨基酸替换可以选自下面表5中示出的成组替换。

表5
				第一多肽	第二多肽
组1	K409W	D399V/F405T
			组2	Y349S	E357W
组3	K360E	Q347R
			组4	K360E/K409W	Q347R/D399V/F405T
组5	Q347E/K360E/K409W	Q347R/D399V/F405T
			组6	Y349S/K409W	E357W/D399V/F405T

可选地，氨基酸替换可以选自下面表6中示出的成组替换。

可选地，每条多肽链中的至少一个氨基酸替换可以选自表7。

可选地，至少一个氨基酸替换可以选自下面表8中的成组替换，其中在所述第一多肽列中标注的位置被任何已知的带负电荷的氨基酸代替，并且在所述第二多肽列中标注的位置被任何已知的带正电荷的氨基酸代替。

表8
		第一多肽	第二多肽
K392，K370，K409或K439	D399，E356或E357

可选地，至少一个氨基酸替换可以选自下面表9中的成组替换，其中在所述第一多肽列中标注的位置被任何已知的带正电荷的氨基酸代替，并且在所述第二多肽列中标注的位置被任何已知的带负电荷的氨基酸代替。

表9
		第一多肽	第二多肽
D399，E356或E357	K409，K439，K370或K392

可选地，氨基酸替换可以选自下面表10中的成组替换。

表10
		第一多肽	第二多肽
T350V，L351Y，F405A和Y407V	T350V，T366L，K392L和T394W

可选地或另外地，异多聚体蛋白的结构稳定性可以通过在所述第一或第二多肽链任一者上引入S354C并在相对的多肽链上引入Y349C来提高，所述突变在所述两个多肽的界面内形成人造二硫键。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在T366位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、L368和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、L368和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在T366位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、D399、S400和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、N390、K392、K409和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、N390、K392、K409和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、D399、S400和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Q347、Y349、K360和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Q347、E357、D399和F405的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Q347、E357、D399和F405的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、K360、Q347和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自K370、K392、K409和K439的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自D356、E357和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自D356、E357和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自K370、K392、K409和K439的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、E356、T366和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、L351、L368、K392和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、L351、L368、K392和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、E356、T366和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于S354C替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于Y349C替换。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于Y349C替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于S354C替换。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于K360E和K409W替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于Q347R、D399V和F405T替换。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于Q347R、D399V和F405T替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于K360E和K409W替换。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T366W替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T366S、T368A和Y407V替换。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T366S、T368A和Y407V替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T366W替换。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T350V、L351Y、F405A和Y407V替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T350V、T366L、K392L和T394W替换。

在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T350V、T366L、K392L和T394W替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T350V、L351Y、F405A和Y407V替换。

本公开中描述的某些蛋白质具有Fc结构域，其包含降低所述Fc序列诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)的能力的一个或多个突变。至少一个突变位于包括第232-239、265-270、296-299和325-332氨基酸位置的区域中(参见Want等，Protein Cell(2018)9(1):63-73)。所述突变可以包括在第233、234、235、297和329位的一个或多个位置处的氨基酸替换(相对于野生型人类IgG1)。所述一个或多个突变可以包括相对于野生型人类IgG1的E233P，L234A，L235A，N297A、N297Q、N297G或N297D，和/或P329A、P329G或P329R。所述一个或多个突变可以包括相对于野生型人类IgG1的L234A和L235A。可选地，所述一个或多个突变可以包括相对于野生型人类IgG1的L234A、L235A和P329A。所述突变可能存在于所述Fc结构域的两条多肽链中的每一条上。

示例性多特异性结合蛋白

下面列出了包含各自连接到抗体恒定区的结合HER2的scFv和结合NKG2D的Fab的TriNKET的实例，其中所述抗体恒定区包括能够使两条Fc链异二聚化的突变。所述scFv包含源自于抗HER2抗体(例如曲妥珠单抗)的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，并且进一步包含VL的第100位和VH的第44位氨基酸残基被Cys的替换，从而促进所述scFv的VH和VL之间的二硫键的形成。所述VL通过(G4S)₄连接物(SEQ ID NO：203)连接到VH的N-端，并且所述VH通过Ala-Ser连接物连接到Fc的N-端。所述Ala-Ser连接物被包括在肘铰链区序列处，以在柔性和最佳几何形状之间建立平衡。在某些实施方式中，可以将另外的序列Thr-Lys-Gly添加到所述铰链处Ala-Ser序列的N-端或C-端。当在本文中用于描述这些示例性TriNKET时，Fc包括抗体铰链、CH2和CH3。

因此，每个下文描述的TriNKET包含下述三条多肽链：

A链，其从N-端到C-端包含：结合NKG2D的Fab的VH，CH1和Fc；

B链，其从N-端到C-端包含：结合HER2的scFv的VL，(G4S)₄连接物(SEQ ID NO：203)，结合HER2的scFv的VH，Ala-Ser连接物和Fc；以及

C链，其从N-端到C-端包含：结合NKG2D的Fab的VL和CL。

示例性TriNKET的氨基酸序列概述在表11中。

在某些实施方式中，本公开的多特异性结合蛋白包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，其中所述第一、第二和第三多肽链分别包含表11中公开的TriNKET的A链、B链和C链的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第一、第二和第三多肽链分别由表11中公开的TriNKET的A链、B链和C链的氨基酸序列构成。

在示例性实施方式中，所述连接到结合NKG2D的Fab片段的Fc结构域包含突变Q347R、D399V和F405T，并且所述连接到HER2scFv的Fc结构域包含匹配的突变K360E和K409W以用于形成异二聚体。在另一个示例性实施方式中，所述连接到结合NKG2D的Fab片段的Fc结构域包含杵突变T366S、L368A和Y407V，并且所述连接到结合HER2的scFv的Fc结构域包含“臼(hole)”突变T366W。在示例性实施方式中，所述连接到结合NKG2D的Fab片段的Fc结构域包括CH3结构域中的S354C替换，其与所述连接到结合HER2的scFv的Fc上的Y349C替换形成二硫键。

特定TriNKET和它们的多肽链在下文更详细描述。在所述氨基酸序列中，(G4S)₄(SEQ ID NO：203)和Ala-Ser连接物为粗体并下划线；scFv中形成二硫键的Cys残基为粗体加斜体并下划线；Fc异二聚化突变为粗体并下划线；Kabat下的CDR序列被下划线。

例如，本公开的TriNKET是A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括：源自于曲妥珠单抗的结合HER2的单链可变片段(scFv)(SEQ ID NO：139)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和源自于A49的结合NKG2D的Fab片段，其包括包含重链可变结构域(SEQ ID NO：94)和CH1结构域的重链部分和包含轻链可变结构域(SEQ IDNO：98)和轻链恒定结构域的轻链部分，其中所述重链可变结构域连接到所述CH1结构域，并且所述CH1结构域连接到所述Fc结构域。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQ IDNO：140、SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142的序列的三条多肽。

SEQ ID NO：140代表了通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的结合HER2的scFv(scFv-Fc)的全序列。所述连接到scFv的Fc结构域包括用于异二聚化的Q347R、D399V和F405T替换和用于与下文所述的SEQ ID NO：141中的Y349C替换形成二硫键的S354C替换。所述scFv(SEQ ID NO：139)包括曲妥珠单抗的重链可变结构域，其通过(G4S)₄连接物(SEQ IDNO：203)连接到曲妥珠单抗的轻链可变结构域的N-端，所述scFv被表示为VL-(G₄S)₄-VH(“(G₄S)₄”由SEQ ID NO：203或SEQ ID NO：143表示)。作为VL和VH中分别的Q100C和G44C替换的结果，所述scFv的重链和轻链可变结构域也通过VL的C100与VH的C44之间的二硫键相连。

曲妥珠单抗scFv

曲妥珠单抗scFv-Fc(RVT)

SEQ ID NO：141代表所述Fab片段的重链部分，其包含NKG2D结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO：94)和CH1结构域，并连接到Fc结构域。SEQ ID NO：141中的Fc结构域包括所述CH3结构域中的Y349C替换，其与连接到结合HER2的scFv的Fc(SEQ ID NO：140)上的S354C替换形成二硫键。在SEQ ID NO：141中，所述Fc结构域还包括K360E和K409W替换，用于与SEQ ID NO：140中的Fc异二聚化。

A49VH

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：94)

A49VH-CH1-Fc(EW)

SEQ ID NO：142代表所述Fab片段的轻链部分，其包含NKG2D结合位点的轻链可变结构域(SEQ ID NO：98)和轻链恒定结构域。

A49VL

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：98)

A49VL-LC

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：142)

本公开的另一个TriNKET是A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗。A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括：与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合HER2的scFv(SEQID NO：139)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和源自于A49MI的结合NKG2D的Fab片段，其包括包含重链可变结构域(SEQ ID NO：144)和CH1结构域的重链部分和包含轻链可变结构域(SEQ ID NO：98)和轻链恒定结构域的轻链部分，其中所述重链可变结构域连接到所述CH1结构域，并且所述CH1结构域连接到所述Fc结构域。A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQ ID NO：140(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)、SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：142(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

SEQ ID NO：145代表所述Fab片段的重链部分，其包含NKG2D结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO：144)和CH1结构域，并被连接到Fc结构域。在SEQ ID NO：144中，SEQ IDNO：94的CDR3中的甲硫氨酸已被异亮氨酸替换(M→I替换；示出在SEQ ID NO：144和SEQ IDNO：145中的第三个括号[]内)。SEQ ID NO：145中的Fc结构域包括CH3结构域中的Y349C替换，其与连接到结合HER2的scFv的Fc(SEQ ID NO：140)中的S354C替换形成二硫键。在SEQID NO：145中，所述Fc结构域也包括K360E和K409W替换。

A49MI VH

A49MI VH-CH1-Fc(EW)

本公开的另一个TriNKET是A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗。KiH是指“杵臼结构”(knobs-into-holes)(KiH)Fc技术，其包括将CH3结构域工程化改造以在每条重链中产生“杵”或“臼”，以促进异二聚化。隐藏在KiH Fc技术之后的概念是通过用大体积残基替换小残基(例如EU编号中的T366W_CH3A)而在一个CH3结构域(CH3A)中引入“杵”。为了容纳所述“杵”，通过用较小的残基代替与杵最邻近的残基(例如T366S/L368A/Y407V_CH3B)，在另一个CH3结构域(CH3B)上产生互补的“臼”表面。所述“臼”突变通过结构指导的噬菌体文库筛选进行优化(Atwell S,Ridgway JB,Wells JA,Carter P.，“从使用噬菌体展示文库重塑同二聚体的结构域界面得到的稳定的异二聚体”(Stable heterodimers from remodeling thedomain interface of a homodimer using a phage display library)，J.Mol.Biol.(1997)270(1):26–35)。KiH Fc变体的X-射线晶体结构(Elliott JM,Ultsch M,Lee J,TongR,Takeda K,Spiess C等，“杵和臼非糖基化半抗体同二聚体的反向平行构象由CH2-CH3疏水相互作用介导”(Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylatedhalf-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3hydrophobic interaction)，J.Mol.Biol.(2014)426(9):1947–57；Mimoto F,Kadono S,Katada H,Igawa T,KamikawaT,Hattori K.，“对FcγR具有改进的亲和性的新的不对称工程化改造的Fc变体的晶体结构”(Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variantwithimproved affinity for FcγRs)，Mol.Immunol.(2014)58(1):132–8)证实，异二聚化在热力学上受益于由CH3结构域间核心界面处的空间互补性所驱动的疏水相互作用，而杵–杵和臼-臼界面分别由于空间位阻和有利相互作用的破坏而不利于同二聚化。

A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括：与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：139)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到包含“臼”替换T366S、L368A和Y407V的Fc结构域；和与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到包含“杵”替换T366W的Fc结构域。A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：142(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

SEQ ID NO：146代表了通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：139)(scFv-Fc)的全序列。所述连接到scFv的Fc结构域包括用于异二聚化的T366S、L368A和Y407V替换和用于与如下所述的SEQ ID NO：147中的Y349C替换形成二硫键的S354C替换。

曲妥珠单抗scFv-Fc(KiH)

SEQ ID NO：147代表Fab片段的重链部分，其包含源自于A49的NKG2D结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO：94)和CH1结构域，并连接到Fc结构域。SEQ ID NO：147中的Fc结构域包括S354C替换，其与连接到结合HER2的scFv的Fc(SEQ ID NO：146)的CH3结构域中的Y349C替换形成二硫键。在SEQ ID NO：147中，所述Fc结构域还包括T366W替换。

A49VH-CH1-Fc(KiH)

本公开的另一个TriNKET是A49MI-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括：与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：139)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到包含“臼”替换T366S、L368A和Y407V的Fc结构域；和与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到包含“杵”替换T366W的Fc结构域。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQ ID NO：146(与A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)、SEQ ID NO：194和SEQ IDNO：142(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

SEQ ID NO：194代表Fab片段的重链部分，其包含源自于A49MI的NKG2D结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO：144)和CH1结构域，并连接到Fc结构域。SEQ ID NO：194中的Fc结构域包括S354C替换，其与连接到结合HER2的scFv的Fc(SEQ ID NO：146)的CH3结构域中的Y349C替换形成二硫键。在SEQ ID NO：194中，所述Fc结构域还包括T366W替换。

A49MI VH-CH1-Fc(KiH)

本公开的另一个示例性TriNKET是A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗。A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括：与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合HER2的scFv(SEQID NO：139)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和源自于A44的结合NKG2D的Fab片段，其包括包含重链可变结构域(SEQ ID NO：86)和CH1结构域的重链部分和包含轻链可变结构域(SEQ ID NO：90)和轻链恒定结构域的轻链部分，其中所述重链可变结构域连接到所述CH1结构域，并且所述CH1结构域连接到所述Fc结构域。A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQ ID NO：140(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)、SEQ ID NO：155和SEQID NO：149的序列的三条多肽。

SEQ ID NO：155代表源自于A44的NKG2D结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO：86)，并连接到Fc结构域。SEQ ID NO：155中的Fc结构域包括所述CH3结构域中的Y349C替换，其与连接到结合HER2的scFv的Fc(SEQ ID NO：140)上的S354C替换形成二硫键。在SEQ IDNO：155中，所述Fc结构域还包括K360E和K409W替换。

A44VH

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGGYYDSGAGDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：86)

A44VH-CH1-Fc(EW)

SEQ ID NO：149代表所述Fab片段的轻链部分，其包含NKG2D结合位点的轻链可变结构域(SEQ ID NO：90)和轻链恒定结构域。

A44VL

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSYPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：90)

A44VL-CL

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSYPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：149)

本公开的另一个示例性TriNKET是A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗。A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括：与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：139)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到包含“臼”替换T366S、L368A和Y407V的Fc结构域；和与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到包含“杵”替换T366W的Fc结构域。A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQID NO：146(与A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)、SEQ ID NO：148和SEQID NO：149(与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

SEQ ID NO：148代表源自于A44的NKG2D结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO：86)，并连接到Fc结构域。SEQ ID NO：148中的Fc结构域包括CH3结构域中的Y349C替换，其与连接到结合HER2的scFv的Fc(SEQ ID NO：146)上的S354C替换形成二硫键。在SEQ ID NO：148中，所述Fc结构域还包括T366W替换。

A44VH-CH1-Fc(KiH)

本公开的另一个TriNKET是A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗。A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括：源自于帕妥珠单抗的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：189)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括Q347R、D399V和F405T替换，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括K360E和K409W替换。A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：141(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ ID NO：142(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

SEQ ID NO：190代表通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的结合HER2的scFv(scFv-Fc)的全序列。所述连接到scFv的Fc结构域包括用于异二聚化的Q347R、D399V和F405T替换和用于与如上所述的SEQ ID NO：141中的Y349C替换形成二硫键的S354C替换。所述scFv(SEQ ID NO：189)包括帕妥珠单抗的重链可变结构域，其通过(G4S)₄连接物(SEQ IDNO：203)连接到帕妥珠单抗的轻链可变结构域的N-端，所述scFv被表示为VL-(G₄S)₄-VH(“(G₄S)₄”由SEQID NO：203或SEQ ID NO：143表示)。作为VL和VH中分别的Q100C和G44C替换的结果，所述scFv的重链和轻链可变结构域也通过VL的C100与VH的C44之间的二硫键相连。

帕妥珠单抗scFv

帕妥珠单抗scFv-Fc

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGCGTKVEIKR

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKCLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSA

本公开的另一个示例性TriNKET是A49MI-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗。A49MI-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括：与A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗中相同的结合HER2的scFv(SEQID NO：189)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括Q347R、D399V和F405T替换，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括K360E和K409W替换。A49MI-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO：190(与A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗中相同)、SEQ ID NO：145(与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ ID NO：142(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

本公开的另一个示例性TriNKET是A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗。A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括：与A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗中相同的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：189)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括“臼”替换T366S、L368A和Y407V，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括“杵”替换T366W。A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：147(与A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ ID NO：142(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

SEQ ID NO：191代表通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：189)(scFv-Fc)的全序列。所述连接到scFv的Fc结构域包括用于异二聚化的T366S、L368A和Y407V替换以及用于与如上所述的SEQ ID NO：191中的Y349C替换形成二硫键的S354C替换。

帕妥珠单抗scFv-Fc(KiH)

本公开的另一个示例性TriNKET是A49MI-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括：与A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗中相同的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：189)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括“臼”替换T366S、L368A和Y407V，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括“杵”替换T366W。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO：191(与A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗中相同)、SEQ ID NO：194(与A49MI-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ ID NO：142(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

本公开的另一个示例性TriNKET是A44-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗。A44-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括：与A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗中相同的结合HER2的scFv(SEQID NO：189)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括Q347R、D399V和F405T替换，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括K360E和K409W替换。A44-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO：190(与A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗中相同)、SEQ ID NO：155(与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ ID NO：149(与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

本公开的另一个示例性TriNKET是A44-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗。A44-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括：与A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗中相同的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：189)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括“臼”替换T366S、L368A和Y407V，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括“杵”替换T366W。A44-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO：191(与A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗中相同)、SEQ ID NO：148(与A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ ID NO：149(与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

本公开的另一个TriNKET是A49-F3’-TriNKET-MGAH22。A49-F3’-TriNKET-MGAH22包括：源自于MGAH22的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：171)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括Q347R、D399V和F405T替换，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括K360E和K409W替换。A49-F3’-TriNKET-MGAH22包括具有SEQID NO：192、SEQ ID NO：141(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ ID NO：142(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

SEQ ID NO：192代表通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的结合HER2的scFv(scFv-Fc)的全序列。所述连接到scFv的Fc结构域包括用于异二聚化的Q347R、D399V和F405T替换以及用于与如上所述的SEQ ID NO：141中的Y349C替换形成二硫键的S354C替换。所述scFv(SEQ ID NO：171)包括帕妥珠单抗的重链可变结构域，其通过(G4S)₄连接物(SEQID NO：203)连接到帕妥珠单抗的轻链可变结构域的N-端，所述scFv被表示为VL-(G₄S)₄-VH(“(G₄S)₄”由SEQ ID NO：203或SEQ ID NO：143表示)。作为VL和VH中分别的G100C和G44C替换的结果，所述scFv的重链和轻链可变结构域也通过VL的C100与VH的C44之间的二硫键相连。

MGAH22scFv

MGAH22scFv-Fc

本公开的另一个TriNKET是A49MI-F3’-TriNKET-MGAH22。A49MI-F3’-TriNKET-MGAH22包括：与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：171)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括Q347R、D399V和F405T替换，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括K360E和K409W替换。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括具有SEQ ID NO：192(与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同)、SEQ ID NO：145(与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ ID NO：142(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

本公开的另一个TriNKET是A49-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22。A49-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括：与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：171)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括“臼”替换T366S、L368A和Y407V，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括“杵”替换T366W。A49-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括具有SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：147(与A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ ID NO：142(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

SEQ ID NO：193代表通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：171)(scFv-Fc)的全序列。所述连接到scFv的Fc结构域包括用于异二聚化的T366S、L368A和Y407V替换以及用于与如上所述的SEQ ID NO：147中的Y349C替换形成二硫键的S354C替换。

MGAH22scFv-Fc(KiH)

本公开的另一个示例性TriNKET是A49MI-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括：与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同的结合HER2的scFv(SEQ IDNO：171)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括“臼”替换T366S、L368A和Y407V，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括“杵”替换T366W。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括具有SEQ ID NO：193(与A49-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22中相同)、SEQ ID NO：194(与A49MI-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ IDNO：142(与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

本公开的另一个示例性TriNKET是A44-F3’-TriNKET-MGAH22。A44-F3’-TriNKET-MGAH22包括：与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：171)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括Q347R、D399V和F405T替换，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括K360E和K409W替换。A44-F3’-TriNKET-MGAH22包括具有SEQ ID NO：192(与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同)、SEQ IDNO：155(与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ ID NO：149(与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

本公开的另一个示例性TriNKET是A44-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22。A44-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括：与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：171)，其通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域；和与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的结合NKG2D的Fab片段，其CH1结构域连接到Fc结构域。所述连接到scFv的Fc结构域包括“臼”替换T366S、L368A和Y407V，并且所述连接到Fab片段的Fc结构域包括“杵”替换T366W。A44-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括具有SEQ ID NO：193(与A49-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22中相同)、SEQ ID NO：148(与A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)和SEQ ID NO：149(与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同)的序列的三条多肽。

在某个实施方式中，本公开的TriNKET与上述包括EW-RVT Fc突变的示例性TriNKET之一一致，区别在于所述连接到结合NKG2D的Fab片段的Fc结构域包含替换Q347R、D399V和F405T，并且所述连接到结合HER2的scFv的Fc结构域包含用于形成异二聚体的匹配的替换K360E和K409W。在某些实施方式中，本公开的TriNKET与上述包括KiH Fc突变的示例性TriNKET之一一致，区别在于所述连接到结合NKG2D的Fab片段的Fc结构域包含“臼”替换T366S、L368A和Y407V，并且所述连接到结合HER2的scFv的Fc结构域包含用于形成异二聚体的“杵”替换T366W。

在某些实施方式中，本公开的TriNKET与上述示例性TriNKET之一一致，区别在于所述连接到结合NKG2D的Fab片段的Fc结构域包括CH3结构域中的S354C替换，并且所述连接到结合HER2的scFv的Fc结构域在CH3结构域中包括用于形成二硫键的匹配的Y349C替换。

本领域技术人员将会认识到，在蛋白质生产和/或储存期间，N-端谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)可以被环化以形成内酰胺(例如自发地或被生产和/或储存期间存在的酶催化)。因此，在其中多肽的氨基酸序列的N-端残基是E或Q的某些实施方式中，本文中还设想了所述E或Q被焦谷氨酸代替的相应的氨基酸序列。

本领域技术人员将会认识到，在蛋白质生产和/或储存期间，蛋白质的C-端赖氨酸(K)可以被移除(例如自发地或被生产和/或储存期间存在的酶催化)。这种K的移除通常在使用C-端包含Fc结构域的蛋白质的情况下被观察到。因此，在其中多肽的氨基酸序列(例如Fc结构域序列)的C-端残基是K的某些实施方式中，本文中还设想了所述K被移除的相应的氨基酸序列。

上述的多特异性蛋白可以使用本领域技术人员公知的重组DNA技术来制造。例如，可以将编码所述第一免疫球蛋白重链的第一核酸序列克隆到第一表达载体中；可以将编码所述第二免疫球蛋白重链的第二核酸序列克隆到第二表达载体中；可以将编码所述免疫球蛋白轻链的第三核酸序列克隆到第三表达载体中；并且可以将所述第一、第二和第三表达载体一起稳定转染到宿主细胞中，以产生所述多聚体蛋白。

为了获得所述多特异性蛋白的最高产量，可以探索所述第一、第二和第三表达载体的不同比率，以确定用于转染到所述宿主细胞中的最佳比率。在转染后，可以使用本领域中已知的方法例如有限稀释法、ELISA、FACS、显微术或Clonepix来分离单一克隆，用于细胞库产生。

可以将克隆在适合于生物反应器规模放大的条件下培养，并维持所述多特异性蛋白的表达。所述多特异性蛋白可以使用本领域中已知的方法包括离心、深度过滤、细胞裂解、匀浆、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用交换层析和混合模式层析来分离和纯化。

II.多特异性蛋白的特征

在某些实施方式中，包括结合NKG2D的Fab片段和结合HER2的scFv结构域的本公开的多特异性结合蛋白例如A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗，以比具有相同的HER2结合结构域的单克隆抗体更高的水平结合到表达低水平HER2的细胞。例如，包括结合NKG2D的Fab结构域和源自于曲妥珠单抗的结合HER2的svFv结构域的多特异性结合蛋白例如A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗，可以以比曲妥珠单抗更高的水平结合到低HER2表达的细胞。

此外，本文描述的多特异性结合蛋白在减少肿瘤生长和杀死癌细胞方面更加有效。例如，本公开的靶向表达HER2的肿瘤/癌细胞的多特异性结合蛋白比曲妥珠单抗更加有效。本公开的TriNKET A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗(其包含：通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：139)(scFv-Fc，由SEQ ID NO：140表示)；和结合NKG2D的Fab片段，其包括包含ADI-27749(A49)的重链可变结构域(SEQ ID NO：94)和CH1结构域的重链部分以及包含轻链可变结构域(SEQ ID NO：98)和轻链恒定结构域的轻链部分，其中所述重链可变结构域连接到所述CH1，并且所述CH1结构域连接到所述Fc结构域(重链部分被表示为VH-CH1-Fc，氨基酸序列阐述在SEQ ID NO：141中))有效地促进具有低水平HER2表达的人类癌细胞系(HER2+)的NK介导的细胞裂解，而曲妥珠单抗对这种细胞系表现出很低活性。此外，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗与曲妥珠单抗相比对具有比HER2+细胞系更高表达的人类癌细胞系(HER2++)具有更优的NK介导的细胞裂解。并且甚至对具有最高水平的HER2表达(与HER+和HER2++细胞系相比)的人类癌细胞系(HER2+++)，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗与曲妥珠单抗相比具有更优的NK介导的细胞裂解。

在某些实施方式中，本文描述的包括NKG2D结合结构域的多特异性结合蛋白(例如A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗、A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗、A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗、A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)与包括相同肿瘤抗原结合结构域的单克隆抗体相比更有效地延迟肿瘤的发展。在某些实施方式中，所述包括NKG2D结合结构域的多特异性结合蛋白(例如A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗、A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗、A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗、A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)与包括相同肿瘤抗原结合结构域的单克隆抗体相比更有效地对抗癌症转移。

本文描述的包括NKG2D结合结构域的多特异性结合蛋白(例如A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗、A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗、A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗、A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)以与结合到HER2++癌细胞(中等水平的表达)相近的程度结合到非癌性人类细胞(例如人类心肌细胞)。然而，尽管所述结合相当，但所述多特异性结合蛋白不诱导健康的非癌性人类细胞(例如人类心肌细胞)的NK介导的灭杀。

本文描述的包括NKG2D结合结构域的多特异性结合蛋白(例如A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗、A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗、A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗、A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)引发肿瘤相关抗原阳性(TAA+)肿瘤细胞的CD8+T细胞裂解。例如，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗以剂量依赖性方式增强人类原代CD8+T细胞在与IL-15培养后的细胞毒性活性(图13A)。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗也增强人类原代CD8+T细胞在与IL-2培养后的细胞毒性活性(图13B)。相反，抗HER2单克隆抗体马格妥昔单抗或曲妥珠单抗不具有类似的效果。

马格妥昔单抗(也被称为MGAH22)是一种结合HER2的Fc优化的单克隆抗体。马格妥昔单抗的重链可变结构域由SEQ ID NO：130表示，并且马格妥昔单抗的轻链可变结构域由SEQ ID NO：134表示。马格妥昔单抗在Fc结构域中包括F243L、R292P、Y300L和P396L替换，它们被设计为增强ADCC的突变。所述重链和轻链序列分别被提供在SEQ ID NO：151和SEQ IDNO：153中。所述F243L、R292P、Y300L和P396L替换为粗体并下划线。

MGAH22重链

MGAH22轻链

DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQKPGHSPKLLIYSASFRYTGVPDRFTGSRSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYTTPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：153)

与几种靶向HER2的TriNKET相比，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗对表达NKG2D的细胞表现出弱的结合。本文描述的包括NKG2D结合结构域的多特异性结合蛋白(例如A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)与Fc沉默的TriNKET(“A49si-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗”；其恒定区的氨基酸序列具有L234A、L235A和P329G(LALAPG)突变，这降低了所述Fc的效应物功能)和曲妥珠单抗的组合相比，当靶细胞是HER2+(786-O细胞)(图19)或HER2++(H661细胞)(图20)时，表现出效能和靶细胞的最大裂解的显著优势，表明A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗可以介导表达HER2的癌细胞的鲁棒的效应细胞依赖性灭杀。

因此，与单克隆抗体相比，本文描述的多特异性结合蛋白(例如A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)在治疗表达HER2的癌症中有利。

III.治疗性应用

本发明提供了使用本文中描述的多特异性结合蛋白和/或本文中描述的药物组合物治疗癌症的方法。通过向需要的患者给药治疗有效量的本文描述的多特异性结合蛋白，所述方法可用于治疗表达HER2的各种不同的癌症。

所述治疗方法可以根据待治疗的癌症来表征。例如，在某些实施方式中，所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌和胃癌、涎腺导管癌、肺的腺癌和子宫癌的侵袭形式例如子宫浆液性子宫内膜癌。

在某些其他实施方式中，所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌或胃癌、涎腺导管癌、肺的腺癌或子宫癌的侵袭性形式例如浆液性子宫内膜癌。在某些其他实施方式中，所述癌症是脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌或子宫癌。在其他实施方式中，所述癌症是鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、肉瘤(例如血管肉瘤或软骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、胆管癌、甲状腺癌、肢端黑色素瘤、光化性角化病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形胶质细胞瘤、巴氏腺癌、基底细胞癌、胆管癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺体癌、类癌瘤、胆管癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓系白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊腺瘤、消化系统癌症、十二指肠癌、内分泌系统癌症、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、内皮细胞癌、室管膜癌、上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、眼和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、胃窦癌、胃底癌、胃泌素瘤、成胶质细胞瘤、胰高血糖素瘤、心脏癌症、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、回肠癌、胰岛细胞瘤、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞瘤变、肝内胆管癌、侵入性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、卡波斯肉瘤、盆腔癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、恶性黑素瘤、恶性间皮肿瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移性癌、口腔癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神经系统癌症、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、非上皮性皮肤癌、非霍奇金氏淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突神经胶质癌、口腔癌、骨肉瘤、浆液性乳头状腺癌、阴茎癌、舌咽癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌症、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、分泌生长抑素的肿瘤、脊椎癌、鳞状细胞癌、横纹肌癌、间皮下癌、浅表扩散性黑素瘤、T细胞白血病、舌癌、未分化癌、输尿管癌、尿道癌、尿道膀胱癌、泌尿系统癌症、宫颈癌、宫体癌、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、疣状癌、血管活性肠肽瘤、外阴癌、高分化癌或肾母细胞瘤(Wilms tumor)。

在某些其他实施方式中，所述癌症是非霍奇金氏淋巴瘤例如B-细胞淋巴瘤或T-细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，所述非霍奇金氏淋巴瘤是B-细胞淋巴瘤，例如弥漫性大B-细胞淋巴瘤、原发性纵隔B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B-细胞淋巴瘤、淋巴结外边缘区B-细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B-细胞淋巴瘤、脾边缘区B-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病或原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。在某些其他实施方式中，所述非霍奇金氏淋巴瘤是T-细胞淋巴瘤，例如前T淋巴母细胞淋巴瘤、外周T-细胞淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T-细胞淋巴瘤、淋巴结外自然杀伤细胞/T-细胞淋巴瘤、肠病型T-细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T-细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤或外周T-细胞淋巴瘤。

在某些其他实施方式中，所述癌症是乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺的腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈部癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、肉瘤和胆囊癌。

所述待治疗的癌症可以根据所述癌细胞表面上表达的特定抗原的存在来表征。在某些实施方式中，除了HER2之外，所述癌细胞还可以表达下述抗原中的一者或多者：CD2，CD19，CD20，CD30，CD38，CD40，CD52，CD70，EGFR/ERBB1，IGF1R，HER3/ERBB3，HER4/ERBB4，MUC1，cMET，SLAMF7，PSCA，MICA，MICB，TRAILR1，TRAILR2，MAGE-A3，B7.1，B7.2，CTLA4和PD1。

IV.组合疗法

本发明的另一方面提供了组合疗法。本文描述的多特异性结合蛋白可以与其他治疗剂组合使用以治疗癌症。

可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的示例性治疗剂包括例如辐射、丝裂霉素、维甲酸、盐酸苯达莫司汀(ribomustin)、吉西他滨、长春新碱、依托泊苷、克拉屈滨、二溴甘露醇、甲氨蝶呤、多柔比星、卡波醌、喷司他丁、硝基可润、净司他丁、西曲瑞克、来曲唑、雷替曲塞、柔红霉素、法倔唑、福莫司汀、胸腺法新、索布佐生、奈达铂、阿糖胞苷、比卡鲁胺、长春瑞滨、维司力农、氨鲁米特、安吖啶、丙谷胺、依利醋铵、酮色林、去氧氟尿苷、依曲替酯、异维甲酸、链脲佐菌素、尼莫司汀、长春地辛、氟他胺、drogenil、布缩宫素、卡莫氟、雷佐生、西佐喃、卡铂、二溴卫矛醇、替加氟、异环磷酰胺、泼尼莫司汀、毕西巴尼、左旋咪唑、替尼泊苷、英丙舒凡、依诺他滨、麦角乙脲、羟甲烯龙、他莫昔芬、孕酮、美雄烷、环硫雄醇、福美司坦、干扰素-α、干扰素-2α、干扰素-β、干扰素-γ(IFN-γ)、集落刺激因子-1、集落刺激因子-2、地尼白介素、白介素-2、黄体生成激素释放因子和上述药剂的可能表现出对同源受体的差异结合或增加或减少的血清半衰期的变化形式。

可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的另一类药剂是免疫检查点抑制剂。示例性的免疫检查点抑制剂包括抑制下述一者或多者的药剂：(i)细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，(ii)程序化细胞死亡蛋白1(PD1)，(iii)PDL1，(iv)LAG3，(v)B7-H3，(vi)B7-H4，和(vii)TIM3。CTLA4抑制剂伊匹单抗已被美国食品和药品监督管理局(United StatesFood and Drug Administration)批准用于治疗黑素瘤。

可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的另一类药剂是靶向非检查点靶的单克隆抗体(例如赫赛汀)和非细胞毒性药剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)。

另一类抗癌药剂包括例如：(i)选自ALK抑制剂、ATR抑制剂、A2A拮抗剂、碱基切除修复抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、Bruton's酪氨酸激酶抑制剂、CDC7抑制剂、CHK1抑制剂、周期蛋白依赖性激酶抑制剂、DNA-PK抑制剂、DNA-PK和mTOR两者的抑制剂、DNMT1抑制剂、DNMT1抑制剂加2-氯-脱氧腺苷、HDAC抑制剂、Hedgehog信号传导途径抑制剂、IDO抑制剂、JAK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂、MELK抑制剂、MTH1抑制剂、PARP抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂、PARP1和DHODH两者的抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶-II抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂和WEE1抑制剂的抑制剂；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的激动剂；和(iii)选自IL-12、IL-15、GM-CSF和G-CSF的细胞因子。

本发明的蛋白质也可用作原发性病灶的手术去除的辅助物。

为了实现所需的组合治疗效果，可以选择多特异性结合蛋白和其他治疗剂的量和给药的相对时间安排。例如，当向需要这种给药的患者给药组合疗法时，所述组合的治疗剂或包含所述治疗剂的一种或多种药物组合物可以以任何顺序给药，例如顺序、并行、一起、同时给药等。此外，例如，多特异性结合蛋白可以在所述其他治疗剂发挥其预防或治疗效果的时间内给药，或与之相反。

V.药物组合物

本发明还描述了含有治疗有效量的本文中描述的蛋白质的药物组合物。所述组合物可以被配制成用于各种不同的药物递送系统。对于适合的剂型来说，一种或多种生理上可接受的赋形剂或载体也可以包含在所述组合物中。适合在本公开中使用的剂型参见《Remington's制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCompany,Philadelphia,Pa.,17th ed.,1985)。对于用于药物递送的方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。

本公开的静脉内药物递送剂型可以包含在袋子、笔或注射器中。在某些实施方式中，所述袋子可以被连接到包含管和/或针头的通道。在某些实施方式中，所述剂型可以是冷冻干燥剂型或液体剂型。在某些实施方式中，所述剂型可以被冷冻干燥(冻干)并包含在12至60个小瓶中。在某些实施方式中，所述剂型可以被冷冻干燥，并且可以将45mg所述冷冻干燥的剂型包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，可以将约40mg-约100mg所述冷冻干燥的剂型包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，将来自于12、27或45个小瓶的冷冻干燥的剂型合并，以获得所述蛋白质在静脉内药物剂型中的治疗剂量。在某些实施方式中，所述剂型可以是液体剂型，并以约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶储存。在某些实施方式中，所述剂型可以是液体剂型并以约600mg/小瓶储存。在某些实施方式中，所述剂型可以是液体剂型并以约250mg/小瓶储存。

所述蛋白质可以以水性液体药物剂型的形式存在，其在形成剂型的缓冲溶液中包括治疗有效量的所述蛋白质。

这些组合物可以通过常规的灭菌技术灭菌，或者可以除菌过滤。得到的水性溶液可以原样包装以备使用，或者可以被冷冻干燥，所述冷冻干燥的制剂在给药之前与无菌水性载体合并。所述制剂的pH通常在3至11之间，更优选地在5至9之间或6至8之间，最优选地在7至8之间，例如7至7.5。所述得到的固体形式的组合物可以被包装在多个单一剂量单元中，各自含有固定量的上述一种或多种药剂。所述固体形式的组合物也可以以灵活的量包装在容器中。

在某些实施方式中，本公开提供了具有延长的储存期限的剂型，其包含本公开的蛋白质与甘露糖醇、单水柠檬酸、柠檬酸钠、二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、氯化钠、聚山梨醇酯80、水和氢氧化钠的组合。

在某些实施方式中，制备了一种水性剂型，其在pH缓冲的溶液中包含本公开的蛋白质。本发明的缓冲液可以具有约4至约8，例如约4.5至约6.0或约4.8至约5.5范围内的pH，或者可以具有约5.0至约5.2的pH。在上述pH之间的范围也打算作为本公开的一部分。例如，打算包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值范围。将pH控制在这个范围之内的缓冲剂的实例包括乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡萄糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。

在某些实施方式中，所述剂型包括含有柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲系统，以将pH维持在约4至约8的范围内。在某些实施方式中，所述pH范围可以是约4.5至约6.0或约pH 4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的pH范围内。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括单水柠檬酸、柠檬酸钠、二水磷酸氢二钠和/或二水磷酸二氢钠。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括约1.3mg/mL柠檬酸(例如1.305mg/mL)、约0.3mg/mL柠檬酸钠(例如0.305mg/mL)、约1.5mg/mL二水磷酸氢二钠(例如1.53mg/mL)、约0.9mg/mL二水磷酸二氢钠(例如0.86)和约6.2mg/mL氯化钠(例如6.165mg/mL)。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括约1至1.5mg/mL柠檬酸、约0.25至0.5mg/mL柠檬酸钠、约1.25至1.75mg/mL二水磷酸氢二钠、约0.7至1.1mg/mL二水磷酸二氢钠和约6.0至6.4mg/mL氯化钠。在某些实施方式中，所述剂型的pH用氢氧化钠调节。

充当等渗剂并且可以使抗体稳定的多元醇，也可以包含在所述剂型中。所述多元醇以可能根据剂型的所需等渗性而变的量添加到所述剂型。在某些实施方式中，所述水性剂型可以是等渗的。添加的多元醇的量也可能根据所述多元醇的分子量而变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比，可以添加较低量的单糖(例如甘露糖醇)。在某些实施方式中，可以在所述剂型中用作等渗剂的多元醇是甘露糖醇。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约5至约20mg/mL。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约7.5至15mg/mL。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约10-14mg/mL。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约12mg/mL。在某些实施方式中，多元醇山梨糖醇可以包含在所述剂型中。

也可以向所述剂型添加去污剂或表面活性剂。示例性的去污剂包括非离子型去污剂例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。添加的去污剂的量使得它减少所述配制的抗体的聚集和/或将所述剂型中颗粒物的形成降至最低和/或减少吸附。在某些实施方式中，所述剂型可以包含作为表面活性剂的聚山梨醇酯。在某些实施方式中，所述剂型可以含有去污剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80是用于描述聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯的术语(参见Fiedler,Lexikon der Hifsstoffe,EditioCantor Verlag Aulendorf,4th ed.,1996)。在某些实施方式中，所述剂型可以含有约0.1mg/mL至约10mg/mL之间或约0.5mg/mL至约5mg/mL之间的聚山梨醇酯80。在某些实施方式中，可以在所述剂型中添加约0.1％聚山梨醇酯80。

在实施方式中，本公开的蛋白质产品被配制成液体剂型。所述液体剂型可以以约10mg/mL的浓度存在于USP/Ph Eur I型50R小瓶中，用橡胶塞封闭并用铝制压合密封盖密封。所述橡胶塞可以由符合USP和Ph Eur的弹性体制成。在某些实施方式中，小瓶可以装填有约61.2mL所述蛋白质产品溶液，以便允许可抽出体积为约60mL。在某些实施方式中，可以将所述液体剂型用约0.9％盐水溶液稀释。

在某些实施方式中，本公开的液体剂型可以被制备成浓度为10mg/mL的溶液，并与稳定剂水平的糖相组合。在某些实施方式中，所述液体剂型可以在水性载体中制备。在某些实施方式中，稳定剂可以以不超过可能产生对静脉内给药来说不理想或不适合的黏度的量添加。在某些实施方式中，所述糖可以是二糖例如蔗糖。在某些实施方式中，所述液体剂型也可以包括一种或多种缓冲剂、表面活性剂和防腐剂。

在某些实施方式中，所述液体剂型的pH可以通过添加可药用酸和/或碱来设定。在某些实施方式中，所述可药用酸可以是盐酸。在某些实施方式中，所述碱可以是氢氧化钠。

除了聚集之外，脱酰胺是肽和蛋白质在发酵、收获/细胞澄清、纯化、药物物质/药物制品储存期间和样品分析期间可能发生的常见产品变异。脱酰胺是从蛋白质失去NH₃，形成琥珀酰亚胺中间体，其可能经历水解。所述琥珀酰亚胺中间体引起母体肽的质量减少17道尔顿。随后的水解导致质量增加18道尔顿。由于在水性条件下不稳定，所述琥珀酰亚胺中间体的分离是困难的。因此，脱酰胺通常可检测为质量增加1道尔顿。天冬酰胺的脱酰胺产生天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺速率的参数包括pH、温度、溶剂介电常数、离子强度、一级序列、局部多肽构象和三级结构。在肽链中与Asn相邻的氨基酸残基影响脱酰胺速率。蛋白质序列中Asn之后的Gly和Ser导致对脱酰胺更高的敏感性。

在某些实施方式中，本公开的液体剂型可以在防止所述蛋白质产品脱酰胺的pH和湿度条件下保存。

本文中感兴趣的水性载体是可药用(对于向人类给药来说安全且无毒)并且可用于制备液体剂型的水性载体。说明性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

防腐剂可以任选地添加到本发明的剂型以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)剂型。

在特定情况下，例如当患者在医院中在移植后通过IV途径接受所有药物时，静脉内(IV)剂型可能是优选的给药途径。在某些实施方式中，在给药前将所述液体剂型用0.9％氯化钠溶液稀释。在某些实施方式中，所述稀释的注射用药物产品是等渗的，并适合于通过静脉内输注给药。

在某些实施方式中，盐或缓冲剂组分可以以约10mM至200mM的量添加。所述盐和/或缓冲剂是可药用的，并源自于各种不同的已知酸(无机和有机酸)和“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲剂，在所述情况下，钠、钾或铵离子可以充当平衡离子。

本公开的蛋白质可以以冷冻干燥剂型的形式存在，其包括所述蛋白质和冻干保护剂。所述冻干保护剂可以是糖例如二糖。在某些实施方式中，所述冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。所述冷冻干燥剂型也可以包括一种或多种缓冲剂、表面活性剂、增量剂和/或防腐剂。

可用于使所述冷冻干燥的药物制品稳定的蔗糖或麦芽糖的量可以是蛋白质与蔗糖或麦芽糖至少1:2的重量比。在某些实施方式中，所述蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以为1:2至1:5。

在某些实施方式中，在冷冻干燥之前，所述剂型的pH可以通过添加可药用酸和/或碱来设定。在某些实施方式中，所述可药用酸可以是盐酸。在某些实施方式中，所述可药用碱可以是氢氧化钠。

在冷冻干燥之前，含有本公开的蛋白质的溶液的pH可以被调整到6至8之间。在某些实施方式中，用于所述冷冻干燥的药物制品的pH范围可以是7至8。

在某些实施方式中，盐或缓冲剂组分可以以10mM-200mM的量添加。所述盐和/或缓冲剂是可药用的，并源自于各种不同的已知酸(无机和有机酸)和“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲剂，在所述情况下，钠、钾或铵离子可以充当平衡离子。

在某些实施方式中，可以添加“增量剂”。“增量剂”是为冻干混合物增添质量并对冻干饼的物理结构有贡献(例如便于生产维持开放孔隙结构的基本上均匀的冻干饼)的化合物。说明性的增量剂包括甘露糖醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冷冻干燥剂型可以含有这些增量剂。

在某些实施方式中，所述冷冻干燥的药物制品可以用水性载体构造。本文中感兴趣的水性载体是可药用(例如对于向人类给药来说安全且无毒)并且可用于在冷冻干燥后制备液体剂型的水性载体。说明性稀释剂包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

在某些实施方式中，本公开的冷冻干燥的药物制品用USP级无菌注射用水(SWFI)或USP级的约0.9％氯化钠注射液重构。在重构期间，将所述冷冻干燥的粉剂溶解在溶液中。

在某些实施方式中，本公开的冷冻干燥的蛋白质产品构造到约4.5mL注射用水，并用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。

本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得对特定患者、组合物和给药方式来说有效实现所需治疗响应并且对所述患者无毒的活性成分的量。

具体剂量可以是对每位患者来说均一的剂量，例如50至5000mg蛋白质。或者，患者的剂量可以根据所述患者的近似体重或表面积定制。确定适合剂量的其他因素可以包括待治疗或预防的疾病或病症、疾病的严重性、给药途径和患者的年龄、性别和医疗状况。确定用于治疗的适合剂量所必需的计算的进一步精化由本领域技术人员按常规进行，特别是根据本文中公开的剂量信息和测定法。所述剂量也可以通过使用用于确定使用剂量的已知测定法并联合适合的剂量响应数据来确定。当监测到疾病进展时，个体患者的剂量可以进行调整。可以测量患者中可靶向构建物或复合物的血液水平，以观察是否需要调整剂量来达到或维持有效浓度。可以使用药物基因组学来确定哪些可靶向构建物和/或复合物及其剂量最可能对给定个体有效(Schmitz等，Clinica ChimicaActa 308:43-53,2001；Steimer等，Clinica Chimica Acta 308:33-41,2001)。

一般来说，基于体重的剂量是每kg体重约0.01μg至约100mg，例如约0.01μg至约100mg/kg体重、约0.01μg至约50mg/kg体重、约0.01μg至约10mg/kg体重、约0.01μg至约1mg/kg体重、约0.01μg至约100μg/kg体重、约0.01μg至约50μg/kg体重、约0.01μg至约10μg/kg体重、约0.01μg至约1μg/kg体重、约0.01μg至约0.1μg/kg体重、约0.1μg至约100mg/kg体重、约0.1μg至约50mg/kg体重、约0.1μg至约10mg/kg体重、约0.1μg至约1mg/kg体重、约0.1μg至约100μg/kg体重、约0.1μg至约10μg/kg体重、约0.1μg至约1μg/kg体重、约1μg至约100mg/kg体重、约1μg至约50mg/kg体重、约1μg至约10mg/kg体重、约1μg至约1mg/kg体重、约1μg至约100μg/kg体重、约1μg至约50μg/kg体重、约1μg至约10μg/kg体重、约10μg至约100mg/kg体重、约10μg至约50mg/kg体重、约10μg至约10mg/kg体重、约10μg至约1mg/kg体重、约10μg至约100μg/kg体重、约10μg至约50μg/kg体重、约50μg至约100mg/kg体重、约50μg至约50mg/kg体重、约50μg至约10mg/kg体重、约50μg至约1mg/kg体重、约50μg至约100μg/kg体重、约100μg至约100mg/kg体重、约100μg至约50mg/kg体重、约100μg至约10mg/kg体重、约100μg至约1mg/kg体重、约1mg至约100mg/kg体重、约1mg至约50mg/kg体重、约1mg至约10mg/kg体重、约10mg至约100mg/kg体重、约10mg至约50mg/kg体重、约50mg至约100mg/kg体重。

药剂可以每日、每周、每月或每年给药一次或多次，或甚至每2至20年给药一次，本领域普通技术人员可以根据体液或组织中可靶向构建物或复合物的测量到的停留时间和浓度，容易地估算给药的重复率。本发明的给药可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内、通过导管灌注或通过直接病灶内注射。这可以给药每日一次或多次、每周一次或多次、每月一次或多次或每年一次或多次。

上面的描述描述了本发明的多个方面和实施方式。本申请具体来说设想了所述方面和实施方式的所有组合和排列。

实施例

现在正一般性描述的本发明，通过参考下面的实施例将更容易被理解，包括所述实施例仅仅是出于说明本发明的某些方面和实施方式的目的，并且不打算限制本发明。

实施例1–原代人类NK细胞的细胞毒性测定法：

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。将分离的PBMC洗涤并准备用于NK细胞分离。使用磁珠通过负选择技术分离NK细胞，分离的NK细胞的纯度通常>90％CD3-CD56+。将分离的NK细胞静息过夜，并将静息的NK细胞在第二天用于细胞毒性测定法中。

DELFIA细胞毒性测定法：

从培养物收获表达HER2的人类癌细胞系，将细胞用HBS洗涤并以10⁶/mL的密度重悬浮在生长培养基中，以备用BATDA试剂(PerkinElmer AD0116)标记。遵照制造商的说明书进行靶细胞的标记。在标记后，将细胞用HBS清洗三次并以0.5-1.0x10⁵/mL的密度重悬浮在培养基中。为了制备背景孔，将标记的细胞的等分试样放在一边，并将细胞从培养基中离心出来。向孔一式三份小心地添加100μL培养基，以避免扰动沉积的细胞。向96孔板的每个孔添加100μL BATDA标记的细胞。保留用于测量从靶细胞的自发释放的孔，并准备用于通过添加1％Triton-X将靶细胞最大裂解的孔。将针对HER2的单克隆抗体或TriNKET(A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗(其包含：通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的结合HER2的scFv(SEQ ID NO：139)(scFv-Fc，由SEQ ID NO：140表示)；和结合NKG2D的Fab片段，其包括包含ADI-27749(A49)的重链可变结构域(SEQ ID NO：94)和CH1结构域的重链部分和包含轻链可变结构域(SEQ ID NO：98)和轻链恒定结构域的轻链部分，其中所述重链可变结构域连接到所述CH1，并且所述CH1结构域连接到所述Fc结构域(重链部分被表示为VH-CH1-Fc，氨基酸序列阐述在SEQ ID NO：141中)))在培养基中稀释，并向每个孔添加50μL稀释的mAb或TriNKET。从培养物收获静息NK细胞，将细胞清洗，并根据所需的E:T比例以10⁵-2.0x10⁶/mL的密度重悬浮在培养基中。向所述板的每个孔添加50μL NK细胞，以提供总共200μL培养体积。在测定法显色之前，将所述板在37℃和5％CO₂下温育2-3小时。

在培养2-3小时后，将板从温箱取出，并通过以200g离心5分钟将细胞沉积。将20μL培养上清液转移到由制造商提供的干净的微孔板，并向每个孔添加200μL室温铕溶液。将板避光并在摇板器上以250rpm温育15分钟。使用Victor 3或SpectraMax i3X仪器读板。如下计算特异性裂解的％：特异性裂解的％＝((实验释放–自发释放)/(最大释放–自发释放))*100％。

长期人类PBMC细胞毒性测定法：

使用IncuCyte NucLight Green试剂(目录号4475)产生稳定地表达NucLightGreen的SkBr-3细胞。将表达NucLight Green的细胞在嘌呤霉素中进行选择，以获得均质群体。在用于测定法之前，将SkBr-3-NucLight Green细胞维持在含有嘌呤霉素的生长培养基中。如下所述制备用于细胞毒性测定的SkBr-3-NucLight Green靶细胞。

从培养物收获表达NucLight Green的细胞，将其清洗以除去残留的选择抗生素，将细胞重悬浮在新鲜培养基中，并接种在96孔平底板中。将所述板在IncuCyte S3中放置过夜，以监测细胞附着和生长。第二天，使用密度梯度离心分离人类PBMC，并在原代细胞培养基中制备A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗或mAb稀释液。将稀释的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和mAb添加到SkBr-3-NucLight Green细胞，然后添加新鲜分离的PBMC。然后将所述板放回到IncuCyte S3中。

在IncuCyte S3上设置图像采集。每小时采集阶段和绿色通道的图像，每个孔2张图像。图像分析使用IncuCyte S3软件进行。为绿色通道产生分数，以计数SkBr-3肿瘤细胞的数目。生长百分数如下计算：生长的％＝((X时的绿色物体计数)/(0时的绿色物体计数))*100％。

图3、图4和图5示出了具有不同HER2表达水平的三种细胞系的TriNKET介导的灭杀。与抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗相比，TriNKET针对所有HER2阳性细胞系提供更有效且更高的最大灭杀。

图3示出了HER2 1+人类癌细胞系786-O的NK介导的细胞裂解。曲妥珠单抗对HER21+细胞系显示出极小活性，将特异性裂解提高到略高于背景灭杀。然而，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗(其包含：通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的结合HER2的scFv(SEQIDNO：139)(由SEQ ID NO：140表示的scFv-Fc)；和结合NKG2D的Fab片段，其包括包含ADI-27749(A49)的重链可变结构域(SEQ IDNO：94)和CH1结构域的重链部分以及包含轻链可变结构域(SEQ IDNO：98)和轻链恒定结构域的轻链部分，其中所述重链可变结构域连接到所述CH1结构域，并且所述CH1结构域连接到所述Fc结构域(重链部分由VH-CH1-Fc表示，氨基酸序列阐述在SEQ ID NO：141中))和A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗(其包含：通过包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的包含SEQ ID NO：139的结合HER2的scFv(由SEQ ID NO：146表示的scFv-Fc)；和结合NKG2D的Fab片段，其包括包含ADI-27744(A44)的重链可变结构域(SEQ ID NO：86)和CH1结构域的重链部分以及包含轻链可变结构域(SEQ ID NO：90)和轻链恒定结构域的轻链部分，其中所述重链可变结构域连接到所述CH1结构域，并且所述CH1结构域连接到所述Fc结构域(重链部分由VH-CH1-Fc表示，氨基酸序列阐述在SEQ ID NO：148中))与单克隆抗体相比在靶向786-O细胞方面更加有效，显示出更高的特异性裂解。

图4演示了具有比786-O细胞系更高的HER2表达水平(被称为HER2++)的人类癌细胞系H661的NK介导的细胞裂解。与786-O细胞系相比，针对H661靶细胞上表达的更高水平的HER2，曲妥珠单抗显示出提高的灭杀。尽管由曲妥珠单抗介导的裂解提高，但A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗在效能和最大灭杀两方面仍显示出对H661靶细胞的出众裂解。

图5示出了在所测试的三种细胞系中具有最高的HER2表达水平(被称为HER2+++)的癌细胞系SkBr-3的NK介导的细胞裂解。曲妥珠单抗与HER2+和HER2++细胞系相比显示出对SkBr-3细胞的提高的效能，但A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗仍显示出出众的效能和最大灭杀。

图6和图7示出了TriNKET或mAb对人类PBMC和SkBr-3HER2+靶细胞的72小时共培养物的效应。当在没有效应细胞PBMC的情况下培养时，SkBr-3细胞在72小时时间段内增殖约3倍。在效应细胞PBMC中，供体变化性是明显的。当将PBMC添加到SkBr-3培养物时，SkBr-3靶细胞的生长名义上降低(图6)。在另一个实验中，添加PBMC效应细胞对SkBr-3细胞生长具有可忽略的影响(图7)。当向所述共培养物添加曲妥珠单抗时，效应细胞PBMC具有提高的裂解SkBr-3靶细胞的能力，在图6和图7中被指示为生长的％的降低。当向所述共培养物添加A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗(图6和图7)和A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗(图7)时，与曲妥珠单抗相比效应细胞PBMC在裂解SkBr-3靶细胞方面甚至更加有效，导致SkBr-3细胞的更快且更完全的减少。

实施例2-人类全血中TriNKET的结合

向每个管/孔添加100μl肝素化人类全血。将三特异性结合蛋白(TriNKET)或单克隆Ab(mAb)直接添加到全血中，并将样品在室温温育20分钟。为了检测未标记的TriNKET/mAb，在与TriNKET温育后将血液清洗三次。向样品添加直接标记的免疫表型分型mAb和特异性针对曲妥珠单抗的第二抗体。在温育20分钟后，向每个样品添加2mL 1x RBC裂解/固定溶液，在室温(RT)15分钟，然后清洗样品以除去红细胞细胞(RBC)。在清洗后，将样品重悬浮，用于FACS分析。

将A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的结合与曲妥珠单抗和第二抗体对照样品进行比较。图8A-8F示出了A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗(来自于克隆ADI-27749的结合NKG2D的结构域；和源自于曲妥珠单抗单克隆抗体的包含SEQ ID NO：139的结合HER2的scFv)在人类全血中的结合。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗在人类全血中的结合与曲妥珠单抗相同。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和曲妥珠单抗对血液中的所有免疫细胞群体表现出极低结合。在B细胞和单核细胞两个群体中，与第二抗体对照样品相比，对曲妥珠单抗和A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗观察到少量变化。在B细胞和单核细胞上观察到的结合可能可以归因于FcR相互作用，而不是Fab特异的。

实施例3-A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗与人类心肌细胞和表达不同水平HER2的人类癌细胞的结合的评估

使用从诱导多能干细胞分化的人类心肌细胞(CellularDynamics/Fuji Film)、786-O、H661和SKBR3癌细胞来评估A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗与这些细胞的结合。所述人类肾细胞癌细胞系786-O表达低水平的HER2，所述人类肺癌细胞系H661表达中等水平的HER2，而所述人类乳腺癌细胞系SKBR3表达高水平的HER2。将TriNKET稀释到3.8e-4至100μg/mL，并将所述稀释液用作第一抗体染色剂。TriNKET的结合使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体来检测。通过流式细胞术来分析细胞。将与表达HER2的细胞的结合荧光强度(MFI)归一化到用对照(非特异性)TriNKET染色的细胞，以获得超过背景的倍数(FOB)值。

人类PBMC细胞毒性测定法

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离PBMC。将SKBR3靶细胞用BacMam3.0NucLight Green(#4622)标记，以允许追踪所述靶细胞。遵照制造商的流程进行SKBR3靶细胞的标记。人类心肌细胞未被标记。将单克隆抗体或TriNKET在培养基中稀释。向已经含有靶细胞的96孔板的孔添加50μl的TriNKET和人类PBMC，添加50μl完全培养基，以获得总共200μl培养体积。

在IncuCyte S3上设置图像采集。图像分析使用IncuCyte S3软件进行。为绿色通道产生分数，以计数肿瘤细胞的数目。阶段通道中心肌细胞的合生被用于评估细胞存活率和计算灭杀的％。

A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗结合到人类心肌细胞的程度与结合到H661细胞相近。图9示出了A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗与人类心肌细胞、SKBR3、H661和786-O癌细胞的结合，其中与心肌细胞的结合与H661细胞(中等HER2表面表达水平)相近。

原代人类PBMC细胞毒性测定法

图10A-10B和图11A-11B示出了在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗存在下SKBR3细胞被人类PBMC的灭杀，而心肌细胞的存活率受到极小影响。

图10A示出了SKBR3癌细胞的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗介导的人类PBMC灭杀；图10B显示出在以1：1的PBMC与靶细胞比例(E:T)下共培养3天后，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗不灭杀非恶性的健康心肌细胞。

图11A示出了的SKBR3癌细胞的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗介导的人类PBMC灭杀；图11B显示出在以20:1的E:T下共培养3天后，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗不灭杀非恶性的健康心肌细胞。

实施例4-TriNKET引发TAA+肿瘤细胞的CD8+T细胞裂解原代人类CD8T细胞细胞毒性测定法：原代人类CD8效应T细胞产生

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离人类PBMC。将分离的PBMC用1μg/mL伴刀豆球蛋白A(ConA)在37℃刺激18小时。然后除去ConA，并与25单位/mL的IL-2在37℃培养4天。使用磁珠通过负选择技术纯化CD8+T细胞，然后在含有25单位/mL IL-2或10ng/mLIL-15的培养基中在37℃培养8-10天。

原代人类CD8效应T细胞表征

将上面产生的人类效应CD8+T细胞通过流式细胞术分析CD8+T细胞纯度以及NKG2D和CD16表达。将细胞用荧光团偶联的针对CD3、CD8、NKG2D、CD16的抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。短期CD8效应T细胞DELFIA细胞毒性测定法

从培养物收获表达感兴趣的靶HER2的人类癌细胞系SkBr-3。将细胞清洗并以10⁶/mL重悬浮在生长培养基中，用于用BATDA试剂(Perkin Elmer AD0116)标记。遵照制造商的说明书标记所述靶细胞。在标记后，将细胞用HBS清洗三次，并以0.5x10⁵/mL重悬浮在培养基中。向96孔板的每个孔添加100μl BATDA标记的细胞。保留用于测量从靶细胞的自发释放的孔，并通过添加1％Triton-X制备用于靶细胞的最大裂解的孔。

将单克隆抗体、TriNKET和对照在培养基中稀释，向每个孔添加50μl稀释的mAb/TriNKET。从培养物收获CD8效应T细胞，清洗，并以5x10⁶/mL重悬浮在培养基中(E:T比例＝50:1)。然后向所述板的每个孔添加50μl CD8T细胞，以获得总共200μl的培养体积。在测定法显色之前将板在37℃和5％CO₂下温育3.5小时。温育后，将板从温箱取出，并通过以500g离心5分钟将细胞沉积。然后将20μl培养上清液转移到由制造商提供的干净的微孔板，向每个孔添加200μl室温铕溶液。将板避光并在摇板器上以250rpm温育15分钟。使用Victor3或SpectraMax i3X仪器读板。如下计算特异性裂解的％：特异性裂解的％＝((实验释放–自发释放)/(最大释放–自发释放))*100％。长期CD8效应T细胞Incucyte细胞毒性测定法

将表达感兴趣的靶HER2的人类癌细胞系SkBr-3用BacMam 3.0NucLight Green(#4622)标记，以允许追踪所述。从培养物收获SkBr-3靶细胞，清洗，重悬浮在生长培养基中，并以5,000/孔的密度在96孔板中铺板。将所述板在37℃和5％CO₂下温育过夜。将单克隆抗体、TriNKET和对照在培养基中稀释；向每个孔添加50μl稀释的mAb或TriNKET。从培养物收获CD8效应T细胞，清洗，并以1x10⁶/mL重悬浮在培养基中(E:T比例＝10:1)。然后向板的每个孔添加50μl CD8+T细胞，以获得总共200μl培养体积。将所述板在37℃和5％CO₂下温育最长7天。在IncuCyte S3上设置图像采集。每小时采集阶段和绿色通道的图像，每个孔2张图像。图像分析使用IncuCyte S3软件进行。使用绿色物体计数/孔来度量活肿瘤细胞的数目。

在细胞毒性测定法中使用的CD8T效应细胞的表征

使用conA刺激产生并与IL-15培养的CD8+T细胞具有高纯度(99％的CD3+CD8+细胞)，并且都表达NKG2D但不表达CD16(图12A-12C)。对使用IL-2培养产生的CD8+T细胞观察到相似的结果。

短期CD8效应T细胞DELFIA细胞毒性测定法

测定了A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗对与IL-15培养后的人类原代CD8+T细胞的细胞毒性活性的影响。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗以剂量依赖性方式增强与IL-15培养后的人类原代CD8+T细胞的细胞毒性活性(图13A)。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗也增强与IL-2培养后的人类原代CD8+T细胞的细胞毒性活性(图13B)。

马格妥昔单抗或赫塞汀没有显示出使用A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗观察到的效应。

长期CD8效应T细胞Incucyte细胞毒性测定法

单独培养或与CD8+T细胞共培养的SkBr-3细胞在培养中增殖(图14A)。当将所述细胞用A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗处理时，由于HER2信号阻断，SkBr-3的生长显示出一定的抑制(图14A)。在抗CD3抗体(通过F(ab’)2交联到抗mIgG1抗体的mIgG1抗体)存在下(图14A)，向SkBr-3细胞和CD8T细胞的共培养物添加A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗显示出比单独的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗高得多的肿瘤细胞生长抑制，表明A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗增强CD8+T细胞的细胞毒性活性。当T细胞未被抗CD3抗体活化时，CD8+T细胞的添加不进一步抑制细胞生长，表明A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗增强CD8+T细胞的细胞毒性的能力依赖于T细胞被抗CD3抗体的活化(图14B)。

实施例5-TriNKET与表达人类癌抗原的细胞的结合的评估TriNKET结合测定法

使用表达HER2的人类癌细胞系来评估TriNKET(A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)和单克隆抗体的肿瘤抗原结合。人类肾细胞癌细胞系786-O表达低水平的HER2，人类肺癌细胞系NCI-H661表达中等水平的HER2，人类乳腺癌细胞系SkBr-3表达高水平的HER2。所有三种细胞系都被用于评估它们对TriNKET的结合亲和性。将TriNKET稀释成一系列浓度，并与相应的细胞温育。

TriNKET(A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)与细胞的结合使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体来检测，并通过流式细胞术分析所述细胞。在每种TriNKET(A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)浓度下的结合水平被计算为细胞的中值荧光强度(MFI)相对于使用与670nMTriNKET温育的细胞观察到的最大MFI的百分率值。或者，在每种TriNKET浓度下的结合水平被计算为所述细胞的MFI相对于使用与仅仅第二抗体温育的细胞观察到的背景MFI的超过背景的倍数(FOB)值。在每个实验中使用曲妥珠单抗代替TriNKET作为对照。

如图15A-15B、16A-16B和17A-17B中所示，所述TriNKET(A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)和曲妥珠单抗对具有高HER2表达水平(HER+++)的SkBr-3细胞表现出最强结合(图15A)。靶向HER2的TriNKET和曲妥珠单抗对具有中等HER2表达水平(HER2++)的NCI-H661的结合亲和性(图16A)近似但略高于对具有低HER2表达水平(HER2+)的786-O细胞的结合亲和性(图17A)。该结果表明靶向HER2的TriNKET和曲妥珠单抗对表达HER2的细胞的亲和性通常与HER2在细胞上的表达水平相关。

使用所述三种细胞系中的每一者，曲妥珠单抗显示出比TriNKET(A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)更高的结合亲和性(SkBr-3(图15A)、NCI-H661(图16A)和786-O(图17A))。然而，当表示为超过背景的倍数(FOB)值时，所述TriNKET与三种细胞系中的每一者的最大结合均高于曲妥珠单抗的最大结合(SkBr-3(图15B)、NCI-H661(图16B)和786-O(图17B))。使用具有高HER2表达水平的SkBr-3细胞时所述差异特别显著(图15B)。

TriNKET对表达NKG2D的EL4细胞的亲和性通过类似的方法来测量。如图18A-18B中所示，在TriNKET中使用的不同NKG2D靶向结构域引起与EL4细胞上表达的NKG2D的不同结合水平。克隆A44、F63和E79的TriNKET强烈结合到NKG2D(图18A和图18B)，而克隆A49的TriNKET微弱结合到NKG2D(图18A和图18B)。

原代人类NK细胞的细胞毒性测定法

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离PBMC并清洗。使用磁珠通过负选择技术从所述PBMC分离NK细胞。通常，使用这种技术收获的细胞中超过90％为CD3-CD56+。将所述分离的NK细胞静息过夜。将所述静息的NK细胞在第二天用于细胞毒性测定法中。

DELFIA细胞毒性测定法

从培养物收获表达感兴趣的靶的人类癌细胞系。将所述细胞用HBS清洗，并以10⁶细胞/mL重悬浮在生长培养基中，以备用BATDA试剂(Perkin Elmer AD0116)标记。遵照制造商的说明书进行靶细胞的标记。在标记后，将细胞用HBS清洗三次并以0.5-1.0x10⁵/mL的密度重悬浮在培养基中。向96孔板的每个孔添加100μL BATDA标记的细胞。将曲妥珠单抗和A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗在培养基中稀释，并向每个用于实验的相应孔分别添加50μL稀释的曲妥珠单抗和A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗。从培养物收获静息和/或活化的NK细胞。将细胞清洗，并根据所需的E:T比例以10⁵-2.0x10⁶/mL的密度重悬浮在培养基中。向所述板的每个孔添加50μL NK细胞，以提供总共200μL培养体积。为了测量BATDA水解产物的自发释放(例如由于自发细胞死亡)，不向所述靶细胞添加NK细胞、mAb或TriNKET。为了测量BATDA水解产物的最大释放，通过添加1％Triton-X将所述靶细胞裂解。将所述板在37℃和5％CO₂下温育2-3小时。

在培养2-3小时后，将板从温箱取出，并通过以200g离心5分钟将细胞沉积。将20μL培养上清液转移到由制造商提供的干净的微孔板，并向每个孔添加200μL室温铕溶液。将板避光并在摇板器上以250rpm温育15分钟。使用Victor 3或SpectraMax i3X仪器读板。

如下计算特异性裂解的％：特异性裂解的％＝(实验释放–自发释放)/(最大释放–自发释放)*100％。

为了模拟TriNKET在分开的分子上的结合性质，将接合NKG2D和HER2的双特异性抗体与曲妥珠单抗组合，并与在一个分子上含有所有三个结合结构域的TriNKET进行比较。因此，在靶向HER2的TriNKET、曲妥珠单抗、Fc沉默的TriNKET(包含SEQ ID NO：156和SEQ IDNO：157，两者都在Fc结构域中包含L234A、L235A和P329G(LALAPG)替换(示出在括号[]中))或Fc沉默的TriNKET与曲妥珠单抗的组合存在下，将786-O和H661靶细胞与分离的NK细胞温育。引人注目的是，当靶细胞是786-O细胞(图19)或H661细胞(图20)时，与Fc沉默的TriNKET和曲妥珠单抗的组合相比，TriNKET在效能和靶细胞的最大裂解方面表现出显著优势。

scFv-Fc

(包括L234A、L235A和P329G(LALAPG)替换(示出在括号[])中)

完整链VH-CH1-Fc

(包括L234A、L235A和P329G(LALAPG)替换(示出在括号[])中)

实施例6–ADI-27749的变体和含有所述变体的TriNKET

如上所述，ADI-27749(A49)含有尤其是具有GAPMGAAAGWFDP(SEQ ID NO：169)的氨基酸序列的重链CDR3。SEQ ID NO：94的第102位(即该CDR3序列的第4位)的Met可以被Gln、Leu、Ile、Phe或Val代替，从而分别产生具有表1中提供的相应重链可变区、轻链可变区和CDR序列的NKG2D结合位点A49MQ、A49ML、A49MI、A49MF和A49MV。

A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗(“TriNKET A”)和TriNKET A的具有Met被Ile的替换的突变体形式(“TriNKET A*”)与人类NKG2D和鼠类Fc的融合蛋白(“mFc-hNKG2D”)的结合，在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)来表征。利用稳态亲和拟合来获得平衡亲和数据。计算平衡亲和常数，并将来自于TriNKET A*的两个独立实验和TriNKET A的独立实验的数据平均。

如表12中所示，从所述亲和拟合获得的平衡亲和常数(K_D)在平行样之间非常相近，这表明所测量的参数的高置信度。所述K_D值表明M102变体与TriNKET A相比对人类NKG2D具有降低不到2倍的亲和性。TriNKET A*的K_D为(4.81±0.39)x 10^-7M，而TriNKET A的K_D为(3.37±0.30)x 10-⁷M(从亲和拟合计算)。这些K_D值表明M102突变对含有A49的TriNKET与人类NKG2D的结合仅有少量影响。

另外，在细胞毒性测定法中评估了M102突变对TriNKET的效能的影响。简单来说，通过反转录病毒转导产生表达CD16a的高亲和性变体(158V)的KHYG-1细胞。在转导后，将细胞在含有嘌呤霉素的生长培养基中选择，以产生KHYG-1-CD16V细胞的选定群体。将所述选定群体维持在含有10ng/mL人类IL-2的培养基中。为了制备在细胞毒性测定法中用作效应细胞的KHYG-1-CD16V细胞，从培养物收获所述细胞，沉积，在不含IL-2的培养基中清洗三次，重悬浮在不含IL-2的培养基中并静息24小时。

为了测量TriNKET A和TriNKET A*的活性，选择表达肿瘤抗原HER2的人类癌细胞系SKBR-3作为靶细胞。从培养物收获表达HER2的SKBR-3。将所述细胞用Hepes缓冲盐水(HBS)清洗，并以10⁶细胞/mL重悬浮在生长培养基中，以备使用BATDA(TDA的疏水酯化形式(2,2':6',2"-三联吡啶-6,6"-二甲酸双(乙酰氧基甲基)酯)试剂(PerkinElmer C136-100)标记(BATDA通过活细胞的细胞膜扩散并被细胞内酯酶水解，导致可透过膜的TDA在靶细胞内的积累。在将靶细胞与效应细胞温育后，从裂解的细胞释放到上清液中的TDA被Eu3+螯合，并通过测量形成的EuTDA螯合物的强烈荧光对NK细胞活性进行定量。(参见Blomberg等，J.Immunol.Methods(1996)193(2):199-206))。遵照制造商的说明书进行靶细胞的标记。标记后，将细胞用HBS清洗三次，并以0.5x10⁵细胞/mL重悬浮在培养基中。向96孔板的每个孔添加100μl BATDA标记的细胞。

将TriNKET在培养基中连续稀释，并向每个孔添加50μl稀释的TriNKET。从培养物收获静息的NK细胞，并以1.0x10⁶细胞/mL重悬浮在培养基中。向板的每个孔添加50μl NK细胞，以获得10:1的所需E:T比例，并在每个孔中提供总共200μl的培养体积。将所述板在37℃和5％CO₂下温育2-3小时。

在培养后，将板从温箱取出，并通过以200×g离心5分钟将细胞沉积。将20μL培养上清液转移到由制造商提供的干净的微孔板。将来自于在没有NK细胞的情况下单独温育的标记细胞的上清液用于测量荧光增强配体2,2':6',2"-三联吡啶-6,6"-二甲酸(TDA)的自发释放(参见Blomberg等，J.Immunol.Methods(1996)193(2):199-206)。将来自于与1％Triton-X温育的标记细胞的上清液用于测量靶细胞的最大裂解。将来自于温育2-3小时之前的标记细胞的上清液用于测量背景并用于质量控制目的。

向每个含有培养上清液的孔添加200μL室温铕溶液(Perkin ElmerC135-100)。将板避光并在摇板器上以250rpm温育15分钟。使用SpectraMax i3X仪器读板。荧光水平代表靶细胞的裂解。特异性裂解的％的值被计算为：特异性裂解的％＝((实验释放–自发释放)/(最大释放–自发释放))×100％。

所述特异性裂解的％的值作图于图21中，并且EC₅₀和最大特异性裂解的％的值概述在表13中。

表13
			蛋白质	EC<sub>50</sub>(nM)	最大裂解(％)
TriNKET A	0.39	35
			TriNKET A*	0.65	36

所述EC₅₀提高不到2倍，并且TriNKET A*的最大特异性裂解的％的值与TriNKET A一致，表明M102突变对TriNKET A的生物活性没有实质性影响。

编号的实施方式

本文公开的实施方式包括在本公开的编号实施方式中所提供的实施方式P1至P49：

实施方式P1：一种蛋白质，其包含：(a)第一抗原结合位点，其包含结合NKG2D的Fab片段；；(b)第二抗原结合位点，其包含结合HER2的单链可变片段(scFv)；和(c)抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分，或结合CD16的第三抗原结合位点。

实施方式P2：实施方式P1所述的蛋白质，其中所述scFv通过包含Ala-Ser的铰链连接到所述抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分或所述结合CD16的第三抗原结合位点，其中所述scFv包含重链可变结构域和轻链可变结构域。

实施方式P3：根据实施方式P2所述的蛋白质，其中所述scFv连接到所述抗体Fc结构域。

实施方式P4：根据实施方式P2或P3所述的蛋白质，其中所述scFv的重链可变结构域与所述scFv的轻链可变结构域形成二硫键。

实施方式P5：根据实施方式P4所述的蛋白质，其中所述二硫键在所述重链可变结构域的C44与所述轻链可变结构域的C100之间形成。

实施方式P6：根据实施方式P5所述的蛋白质，其中所述scFv连接到所述抗体Fc结构域，其中所述scFv的轻链可变结构域位于所述scFv的重链可变结构域的N-端，并通过柔性连接物(GlyGlyGlyGlySer)4((G4S)4)(SEQ ID NO：203)连接到所述scFv的重链可变结构域，并且所述Fab连接到所述抗体Fc结构域。

实施方式P7：根据实施方式P2-P6中的任一者所述的蛋白质，其中所述scFv的重链可变结构域通过柔性连接物连接到所述scFv的轻链可变结构域。

实施方式P8：根据实施方式P7所述的蛋白质，其中所述柔性连接物包含(GlyGlyGlyGlySer)4((G4S)4)(SEQ ID NO：203)。

实施方式P9：根据实施方式P2-P8中的任一者所述的蛋白质，其中所述scFv的重链可变结构域位于所述scFv的轻链可变结构域的N-端或C-端。

实施方式P10：根据实施方式P9所述的蛋白质，其中所述scFv的轻链可变结构域位于所述scFv的重链可变结构域的N-端。

实施方式P11：根据实施方式P1至P10中的任一者所述的蛋白质，其中所述Fab片段连接到所述抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分或所述结合CD16的第三抗原结合位点。

实施方式P12：根据实施方式P11所述的蛋白质，其中所述Fab片段的重链部分包含重链可变结构域和CH1结构域，并且其中所述重链可变结构域连接到所述CH1结构域。

实施方式P13：根据实施方式P11或P12所述的蛋白质，其中所述Fab连接到所述抗体Fc结构域。

实施方式P14：根据前述实施方式中的任一者所述的蛋白质，其包含SEQ ID NO：139的序列。

实施方式P15：根据实施方式P2-P14中的任一者所述的蛋白质，其包含连接到抗体Fc结构域的scFv，其中所述连接到抗体Fc结构域的scFv由选自SEQ ID NO：140和SEQ IDNO：146的序列表示。

实施方式P16：根据前述实施方式中的任一者所述的蛋白质，其包含SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147或SEQ ID NO：148的序列。

实施方式P17：一种蛋白质，其包含与SEQ ID NO：139的氨基酸序列至少90％同一性的序列。

实施方式P18：一种蛋白质，其包含与SEQ ID NO：139的氨基酸序列至少95％同一性的序列。

实施方式P19：一种蛋白质，其包含与SEQ ID NO：139的氨基酸序列至少99％同一性的序列。

实施方式P20：一种蛋白质，其包含与选自SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：146的氨基酸序列至少90％同一性的序列。

实施方式P21：一种蛋白质，其包含与选自SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：146的氨基酸序列至少95％同一性的序列。

实施方式P22：一种蛋白质，其包含与选自SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：146的氨基酸序列至少99％同一性的序列。

实施方式P23：根据实施方式P1-P13中的任一者所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含与选自SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：94的氨基酸序列至少90％同一性的重链可变结构域。

实施方式P24：根据实施方式P1-P13中的任一者所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：86至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：90至少90％同一性的轻链可变结构域。

实施方式P25：根据实施方式P1-P13中的任一者所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：86至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：90至少95％同一性的轻链可变结构域。

实施方式P26：根据实施方式P1-P13中的任一者所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98至少90％同一性的轻链可变结构域。

实施方式P27：根据实施方式P1-P13中的任一者所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98至少95％同一性的轻链可变结构域。

实施方式P28：根据实施方式P1-P13中的任一者所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：144至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98至少90％同一性的轻链可变结构域。

实施方式P29：根据实施方式P1-P13中的任一者所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：144至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98至少95％同一性的轻链可变结构域。

实施方式P30：根据实施方式P1-P13中的任一者所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：86相同的重链可变结构域和与SEQ ID NO：90相同的轻链可变结构域。

实施方式P31：根据实施方式P1-P13中的任一者所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94相同的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98相同的轻链可变结构域。

实施方式P32：根据实施方式P1-P13中的任一者所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：144相同的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98相同的轻链可变结构域。

实施方式P33：根据实施方式P1-P13和P23-P32中的任一者所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域包含人类IgG1抗体的铰链和CH2结构域。

实施方式P34：根据实施方式P33所述的蛋白质，其中所述Fc结构域包含与人类IgG1抗体的第234-332位氨基酸至少90％同一性的氨基酸序列。

实施方式P35：根据实施方式P33或P34所述的蛋白质，其中所述Fc结构域包含与人类IgG1的Fc结构域至少90％同一性的氨基酸序列，并在选自Q347、Y349、T350、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、K439的一个或多个位置处有差异。

实施方式P36：根据实施方式P1-P13和P23-P34中的任一者所述的蛋白质，其中所述Fc结构域是包含Q347R、D399V和F405T替换的人类IgG1的Fc结构域。

实施方式P37：根据实施方式P36所述的蛋白质，其中所述包含替换的Fc结构域连接到所述scFv。

实施方式P38：根据实施方式P1-P13和P23-P34中的任一者所述的蛋白质，其中所述Fc结构域是包含K360E和K409W替换的人类IgG1的Fc结构域。

实施方式P39：根据实施方式P38所述的蛋白质，其中所述包含替换的Fc结构域连接到所述Fab片段。

实施方式P40：根据实施方式P1-P13和P23-P34中的任一者所述的蛋白质，其中所述Fc结构域是包含T366W替换的人类IgG1的Fc结构域。

实施方式P41：根据实施方式P40所述的蛋白质，其中所述包含替换的Fc结构域连接到所述Fab片段。

实施方式P42：根据实施方式P1-P13和P23-P34中的任一者所述的蛋白质，其中所述Fc结构域是包含T366S、L368A和Y407V替换的人类IgG1的Fc结构域。

实施方式P43：根据实施方式P42所述的蛋白质，其中所述包含替换的Fc结构域连接到所述scFv。

实施方式P44：根据实施方式P1-P43中的任一者所述的蛋白质，其中所述蛋白质以KD为10nM或更低的亲和性结合NKG2D。

实施方式P45：一种剂型，其包含根据前述实施方式中的任一者所述的蛋白质和可药用载体。

实施方式P46：一种细胞，其包含表达根据实施方式P1-P44中的任一者所述的蛋白质的一种或多种核酸。

实施方式P47：一种直接和/或间接增加肿瘤细胞死亡的方法，所述方法包括将肿瘤和自然杀伤细胞暴露于根据实施方式P1-P44中的任一者所述的蛋白质。

实施方式P48：一种治疗癌症的方法，其中所述方法包括向患者给药根据实施方式P1-P44中的任一者所述的蛋白质或根据实施方式P45所述的剂型。

实施方式P49：实施方式P48所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺的腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈部癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、间皮瘤、肉瘤和胆囊癌。

通过参考并入

本文中提到的每个专利文献和科学论文的整个公开内容为所有目的通过参考并入本文。

等同性

本发明可以以其他特定形式体现而不背离其精神或本质特征。因此，前述实施方式应该在所有情况下被认为是说明性的而不是限制本文描述的发明。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是上面的描述指明，并且打算将进入权利要求书的意义和等同性范围之内的所有变化涵盖在其中。

序列表

<110> 蜻蜓疗法股份有限公司（DRAGONFLY THERAPEUTICS, INC.）

<120> 结合HER2、NKG2D和CD16的多特异性结合蛋白及其使用方法

<130> AJ4309PT2101

<140>

<141>

<150> 62/716,259

<151> 2018-08-08

<160> 209

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> PRT

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 26

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Pro Thr

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100 105

<210> 28

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 28

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

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100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Ser Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 32

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 32

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

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100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Ser Thr

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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 34

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 34

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Phe Ile Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 36

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 36

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 38

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 38

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 39

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 40

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 40

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 41

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Leu Tyr Ser Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 42

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 42

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 43

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Phe Ile Thr

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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 44

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 44

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 45

Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 46

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 47

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 47

Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 48

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 49

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 49

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 50

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 51

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr

1 5

<210> 52

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 52

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 53

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 53

Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly

1 5 10

<210> 54

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 54

Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 55

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 55

Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 56

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 56

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 57

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 57

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 58

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 58

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 59

Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro Thr

1 5

<210> 60

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 60

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 61

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 61

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Thr

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<210> 62

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 62

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly

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Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 63

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 64

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 65

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1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 66

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

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Lys

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 67

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Thr

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 68

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 69

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<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 70

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1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 72

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Gly

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 74

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

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65 70 75 80

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 78

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<211> 9

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 81

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Val

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 82

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 83

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 84

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 85

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 86

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 87

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 88

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Gly

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 89

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 90

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 91

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 93

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 94

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 95

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 96

Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 97

Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

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<210> 98

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 98

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 99

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<210> 100

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 100

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 101

Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg Thr

1 5

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<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 102

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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115 120 125

<210> 103

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 103

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

35 40

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<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 104

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

35 40

<210> 105

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 105

Ala Arg Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 106

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 106

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<210> 107

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 107

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 108

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 108

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 109

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 109

Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe Thr

1 5

<210> 110

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 110

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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115 120

<210> 111

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 111

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

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65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

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<210> 112

<211> 115

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 112

Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

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65 70 75 80

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85 90 95

Asn Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 113

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 113

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 114

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 114

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 115

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 115

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

1 5

<210> 116

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 116

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr

1 5

<210> 117

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 117

Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 118

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 118

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 119

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 119

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5

<210> 120

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 120

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 121

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 121

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 122

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 122

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 123

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 123

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

1 5

<210> 124

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 124

Asn Pro Asn Ser Gly Gly

1 5

<210> 125

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 125

Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 126

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 126

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 127

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 127

Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala

1 5

<210> 128

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 128

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 129

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 129

Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 130

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 130

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 131

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 131

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

1 5

<210> 132

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 132

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr

1 5

<210> 133

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 133

Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 134

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 134

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 135

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 135

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5

<210> 136

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 136

Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr

1 5

<210> 137

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 137

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 138

<211> 1255

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 138

Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

35 40 45

Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

50 55 60

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val

65 70 75 80

Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

85 90 95

Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

100 105 110

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro

115 120 125

Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

130 135 140

Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln

145 150 155 160

Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

165 170 175

Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

180 185 190

His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

195 200 205

Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

210 215 220

Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys

225 230 235 240

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

245 250 255

His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

260 265 270

Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg

275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

290 295 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

305 310 315 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

325 330 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

340 345 350

Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys

355 360 365

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

370 375 380

Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe

385 390 395 400

Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

405 410 415

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

420 425 430

Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu

435 440 445

Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

450 455 460

Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val

465 470 475 480

Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

485 490 495

Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

500 505 510

Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys

515 520 525

Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

530 535 540

Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys

545 550 555 560

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

565 570 575

Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

580 585 590

Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu

595 600 605

Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

610 615 620

Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys

625 630 635 640

Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser

645 650 655

Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

660 665 670

Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg

675 680 685

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

690 695 700

Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu

705 710 715 720

Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

725 730 735

Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

740 745 750

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu

755 760 765

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

770 775 780

Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu

785 790 795 800

Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

805 810 815

Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

820 825 830

Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

835 840 845

Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

850 855 860

Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp

865 870 875 880

Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

885 890 895

Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

900 905 910

Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala

915 920 925

Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

930 935 940

Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met

945 950 955 960

Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

965 970 975

Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

980 985 990

Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu

995 1000 1005

Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr

1010 1015 1020

Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly

1025 1030 1035

Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg

1040 1045 1050

Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu

1055 1060 1065

Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser

1070 1075 1080

Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu

1085 1090 1095

Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser

1100 1105 1110

Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val

1115 1120 1125

Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro

1130 1135 1140

Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro

1145 1150 1155

Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu

1160 1165 1170

Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly

1175 1180 1185

Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala

1190 1195 1200

Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp

1205 1210 1215

Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro

1220 1225 1230

Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr

1235 1240 1245

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val

1250 1255

<210> 139

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 139

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 140

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 140

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

260 265 270

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

275 280 285

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

290 295 300

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

305 310 315 320

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

325 330 335

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

340 345 350

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

355 360 365

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg

370 375 380

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

385 390 395 400

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

405 410 415

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser

420 425 430

Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

435 440 445

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

450 455 460

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 141

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 141

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 142

<211> 210

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 142

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

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Pro Ser Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

115 120 125

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Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

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210

<210> 143

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 143

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 144

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 144

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

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Ala Arg Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 145

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 145

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

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275 280 285

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

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435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 146

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 146

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

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195 200 205

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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

245 250 255

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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

275 280 285

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

340 345 350

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

355 360 365

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg

370 375 380

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385 390 395 400

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<210> 147

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 147

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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65 70 75 80

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275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

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450

<210> 148

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 148

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

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Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 149

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 149

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg

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Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 150

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 150

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 151

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 151

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

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Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Val Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

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385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 152

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 152

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

85 90 95

Gly Gly Gly Ser

100

<210> 153

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 153

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

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85 90 95

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130 135 140

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

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Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 154

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 154

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

85 90 95

Gly Ser Gly Gly

100

<210> 155

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 155

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 156

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 156

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

260 265 270

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

275 280 285

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

290 295 300

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

305 310 315 320

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

325 330 335

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

340 345 350

Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

355 360 365

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg

370 375 380

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

385 390 395 400

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

405 410 415

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser

420 425 430

Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

435 440 445

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 157

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 157

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 158

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 158

Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 159

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 159

Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 160

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 160

Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly

1 5

<210> 161

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 161

Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 162

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 162

Ser Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 163

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 163

Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp

1 5 10 15

Val

<210> 164

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 164

Gly Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 165

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 165

Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 166

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 166

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 167

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 167

Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr

1 5 10

<210> 168

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 168

Ser Tyr Ser Met Asn

1 5

<210> 169

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 169

Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 170

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 170

Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 171

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 171

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

130 135 140

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

145 150 155 160

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Cys Leu Glu Trp Ile

165 170 175

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

180 185 190

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

195 200 205

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala

245

<210> 172

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 172

Ala Arg Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 173

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 173

Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 174

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 174

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Gln Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 175

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 175

Ala Arg Gly Ala Pro Gln Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 176

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 176

Gly Ala Pro Gln Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 177

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 177

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 178

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 178

Ala Arg Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 179

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 179

Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 180

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 180

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Phe Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 181

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 181

Ala Arg Gly Ala Pro Phe Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 182

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 182

Gly Ala Pro Phe Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 183

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 183

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 184

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 184

Ala Arg Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 185

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 185

Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 186

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (102)..(102)

<223> M, L, I, V, Q或F

<400> 186

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 187

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> M, L, I, V, Q或F

<400> 187

Ala Arg Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 188

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> M, L, I, V, Q或F

<400> 188

Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 189

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 189

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

145 150 155 160

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

195 200 205

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

245

<210> 190

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 190

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

145 150 155 160

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

195 200 205

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

260 265 270

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

275 280 285

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

290 295 300

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

305 310 315 320

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

325 330 335

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

340 345 350

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

355 360 365

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys

370 375 380

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

385 390 395 400

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

405 410 415

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly

420 425 430

Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

435 440 445

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

450 455 460

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 191

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 191

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

145 150 155 160

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

195 200 205

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

260 265 270

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

275 280 285

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

290 295 300

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

305 310 315 320

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

325 330 335

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

340 345 350

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

355 360 365

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser

370 375 380

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys

385 390 395 400

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

405 410 415

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

420 425 430

Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

435 440 445

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

450 455 460

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 192

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 192

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

130 135 140

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

145 150 155 160

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Cys Leu Glu Trp Ile

165 170 175

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

180 185 190

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

195 200 205

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr

245 250 255

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

275 280 285

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

290 295 300

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

305 310 315 320

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

325 330 335

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

340 345 350

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

355 360 365

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro

370 375 380

Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

385 390 395 400

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

405 410 415

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp

420 425 430

Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

435 440 445

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

450 455 460

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 193

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 193

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

130 135 140

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

145 150 155 160

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Cys Leu Glu Trp Ile

165 170 175

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

180 185 190

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

195 200 205

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr

245 250 255

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

275 280 285

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

290 295 300

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

305 310 315 320

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

325 330 335

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

340 345 350

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

355 360 365

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

370 375 380

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

385 390 395 400

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

405 410 415

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

420 425 430

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

435 440 445

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

450 455 460

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 194

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 194

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 195

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 195

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 196

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 196

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 197

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 197

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 198

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 198

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 199

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 199

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 200

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 200

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 201

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 201

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser

20

<210> 202

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 202

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 203

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 203

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 204

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> 杂项特点

<222> (1)..(40)

<223> 该序列可能涵盖1-20个“Gly Ser”重复单元

<400> 204

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

20 25 30

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

35 40

<210> 205

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> 杂项特点

<222> (1)..(60)

<223> 该序列可能涵盖1-20个“Gly Gly Ser”重复单元

<400> 205

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

50 55 60

<210> 206

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> 杂项特点

<222> (1)..(80)

<223> 该序列可能涵盖1-20个“Gly Gly Gly Ser”重复单元

<400> 206

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

<210> 207

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> 杂项特点

<222> (1)..(80)

<223> 该序列可能涵盖1-20个“Gly Gly Ser Gly”重复单元

<400> 207

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

35 40 45

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

65 70 75 80

<210> 208

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> 杂项特点

<222> (1)..(100)

<223> 该序列可能涵盖1-20个“Gly Gly Ser Gly Gly”重复单元

<400> 208

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

85 90 95

Gly Ser Gly Gly

100

<210> 209

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> 杂项特点

<222> (1)..(100)

<223> 该序列可能涵盖1-20个“Gly Gly Gly Gly Ser”重复单元

<400> 209

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

85 90 95

Gly Gly Gly Ser

100

Claims

1.一种蛋白质，其包含：

(a)第一抗原结合位点，其包含结合NKG2D的Fab片段；

(b)第二抗原结合位点，其包含结合HER2的单链可变片段(scFv)；和

(c)抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分，或结合CD16的第三抗原结合位点。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述scFv通过包含Ala-Ser的铰链连接到所述抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分或所述结合CD16的第三抗原结合位点。

3.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述scFv连接到所述抗体Fc结构域。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的蛋白质，其中所述scFv包含重链可变结构域和轻链可变结构域。

5.根据权利要求4所述的蛋白质，其中所述scFv的重链可变结构域与所述scFv的轻链可变结构域形成二硫键。

6.根据权利要求5所述的蛋白质，其中所述二硫键在所述重链可变结构域的C44与所述轻链可变结构域的C100之间形成。

7.根据权利要求4-6中的任一项所述的蛋白质，其中所述scFv的轻链可变结构域通过柔性连接物连接到所述scFv的重链可变结构域。

8.根据权利要求7所述的蛋白质，其中所述柔性连接物包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的蛋白质，其中所述柔性连接物由SEQ ID NO：143的氨基酸序列构成。

10.根据权利要求4-9中的任一项所述的蛋白质，其中所述轻链可变结构域位于所述重链可变结构域的N-端或C-端。

11.根据权利要求10所述的蛋白质，其中所述轻链可变结构域位于所述重链可变结构域的N-端。

12.根据权利要求1-11中的任一项所述的蛋白质，其中所述Fab片段连接到所述抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分或所述结合CD16的第三抗原结合位点。

13.根据权利要求1-12中的任一项所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含：

(a)包含分别由SEQ ID NO：168、96和169的氨基酸序列所表示的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ IDNO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(c)包含分别由SEQ ID NO：95、96和97的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；和包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；

(l)包含分别由SEQ ID NO：168、96和188的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域，和包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列所表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。

14.根据权利要求1-13中的任一项所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含与选自SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：94的氨基酸序列至少90％同一性的重链可变结构域。

15.根据权利要求1-14中的任一项所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含：

(a)与SEQ ID NO：94至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98至少90％同一性的轻链可变结构域；

(b)与SEQ ID NO：144至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98至少90％同一性的轻链可变结构域；或

(c)与SEQ ID NO：86至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：90至少90％同一性的轻链可变结构域。

16.权利要求1-15中的任一项所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含：

(a)与SEQ ID NO：94至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98至少95％同一性的轻链可变结构域；

(b)与SEQ ID NO：144至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98至少95％同一性的轻链可变结构域；或

(c)与SEQ ID NO：86至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：90至少95％同一性的轻链可变结构域。

17.权利要求1-16中的任一项所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的第一抗原结合位点包含：

(a)与SEQ ID NO：94相同的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98相同的轻链可变结构域；

(b)与SEQ ID NO：144相同的重链可变结构域和与SEQ ID NO：98相同的轻链可变结构域；或

(c)与SEQ ID NO：86相同的重链可变结构域和与SEQ ID NO：90相同的轻链可变结构域。

18.根据权利要求1-17中的任一项所述的蛋白质，其中当通过表面等离子体共振测量时，所述蛋白质以2nM至120nM的K_D结合NKG2D。

19.根据权利要求1-18中的任一项所述的蛋白质，其中所述结合HER2的第二抗原结合位点包含：

20.根据权利要求1-19中的任一项所述的蛋白质，其中所述结合HER2的第二抗原结合位点包含：

(a)包含与SEQ ID NO：195至少90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域和包含与SEQ ID NO：196至少90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；

(b)包含与SEQ ID NO：197至少90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域和包含与SEQ ID NO：198至少90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；或

(c)包含与SEQ ID NO：199至少90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域和包含与SEQ ID NO：200至少90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。

21.根据权利要求1-20中的任一项所述的蛋白质，其中所述结合HER2的第二抗原结合位点包含：

(a)包含与SEQ ID NO：195至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域和包含与SEQ ID NO：196至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；

(b)包含与SEQ ID NO：197至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域和包含与SEQ ID NO：198至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；或

(c)包含与SEQ ID NO：199至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域和包含与SEQ ID NO：200至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。

22.根据权利要求1-21中的任一项所述的蛋白质，其中所述结合HER2的第二抗原结合位点包含：

(a)包含与SEQ ID NO：195相同的氨基酸序列的重链可变结构域和包含与SEQ ID NO：196相同的氨基酸序列的轻链可变结构域；

(b)包含与SEQ ID NO：197相同的氨基酸序列的重链可变结构域和包含与SEQ ID NO：198相同的氨基酸序列的轻链可变结构域；或

(c)包含与SEQ ID NO：199相同的氨基酸序列的重链可变结构域和包含与SEQ ID NO：200相同的氨基酸序列的轻链可变结构域。

23.根据权利要求1-22中的任一项所述的蛋白质，其中所述结合HER2的第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：189或SEQ ID NO：171的氨基酸序列。

24.根据权利要求23所述的蛋白质，其中所述结合HER2的第二抗原结合位点包含SEQID NO：139的氨基酸序列。

25.根据权利要求1-24中的任一项所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域包含人类IgG1抗体的铰链和CH2结构域。

26.根据权利要求25所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域包含与人类IgG1抗体的第234-332位氨基酸至少90％同一性的氨基酸序列。

27.根据权利要求25或26所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域包含与人类IgG1的Fc结构域至少90％同一性的氨基酸序列，并在选自Q347、Y349、T350、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、K439的一个或多个位置处有差异。

28.根据权利要求1-27中的任一项所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域是包含Q347R、D399V和F405T替换的人类IgG1的Fc结构域。

29.根据权利要求28所述的蛋白质，其中所述包含替换的抗体Fc结构域连接到所述scFv。

30.根据权利要求1-29中的任一项所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域是包含K360E和K409W替换的人类IgG1的Fc结构域。

31.根据权利要求30所述的蛋白质，其中所述包含替换的抗体Fc结构域连接到所述Fab片段。

32.根据权利要求1-27中的任一项所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域是包含T366W替换的人类IgG1的Fc结构域。

33.根据权利要求32所述的蛋白质，其中所述包含替换的抗体Fc结构域连接到所述Fab片段。

34.根据权利要求1-27和32-33中的任一项所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域是包含T366S、L368A和Y407V替换的人类IgG1的Fc结构域。

35.根据权利要求34所述的蛋白质，其中所述包含替换的抗体Fc结构域连接到所述scFv。

36.根据权利要求1-35中的任一项所述的蛋白质，其包含SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：148的序列。

37.根据权利要求1-36中的任一项所述的蛋白质，其中所述连接到抗体Fc结构域的scFv由SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：146的氨基酸序列表示。

38.一种蛋白质，其包含：

(a)包含与SEQ ID NO：141至少90％同一性的氨基酸序列的第一多肽；

(b)包含与SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：190或SEQ ID NO：192至少90％同一性的氨基酸序列的第二多肽；和

(c)包含与SEQ ID NO：142至少90％同一性的氨基酸序列的第三多肽。

39.根据权利要求38所述的蛋白质，其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO：140至少90％同一性的氨基酸序列。

40.一种蛋白质，其包含：

(a)包含与SEQ ID NO：141至少95％同一性的氨基酸序列的第一多肽；

(b)包含与SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：190或SEQ ID NO：192至少95％同一性的氨基酸序列的第二多肽；和

(c)包含与SEQ ID NO：142至少95％同一性的氨基酸序列的第三多肽。

41.根据权利要求40所述的蛋白质，其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO：140至少95％同一性的氨基酸序列。

42.一种蛋白质，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的第一多肽；

(b)包含SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：190或SEQ ID NO：192的氨基酸序列的第二多肽；和

(c)包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的第三多肽。

43.根据权利要求42所述的蛋白质，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列。

44.一种剂型，其包含根据前述权利要求中的任一项所述的蛋白质和可药用载体。

45.一种细胞，其包含表达根据权利要求1-43中的任一项所述的蛋白质的一种或多种核酸。

46.一种直接和/或间接增加肿瘤细胞死亡的方法，所述方法包括将肿瘤和自然杀伤细胞暴露于根据权利要求1-43中的任一项所述的蛋白质。

47.一种治疗癌症的方法，其中所述方法包括向患者给药根据权利要求1-43中的任一项所述的蛋白质或根据权利要求44所述的剂型。

48.权利要求47所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺的腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈部癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、间皮瘤、肉瘤和胆囊癌。