CN112755042A - 一种抗肿瘤药物的联合使用治疗白血病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用抗肿瘤药物的联合使用来治疗急性骨髓性白血病或其他恶性血液肿瘤的方法，其特征在于该方法是以介芬胺或其药学上可接受的盐作为有效成分与低剂量的阿糖胞苷联合使用。本发明通过实验证明介芬胺是一个非常有效的Hedgehog信号通路的抑制剂，在以介芬胺或其药学上可接受的盐作为有效成分与低剂量的阿糖胞苷联用治疗急性骨髓性白血病或其他恶性血液肿瘤中，介芬胺被证明是一种有效的抗肿瘤剂，能够抑制急性骨髓性白血病或其他恶性血液肿瘤的生长。介芬胺具有被开发成联合治疗急性骨髓性白血病或其他恶性血液肿瘤的潜力。

Description

一种抗肿瘤药物的联合使用治疗白血病的方法

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物的联合使用，具体是关于一种以介芬胺或其药学上可接受的盐作为有效成分的抗肿瘤药物与低剂量的阿糖胞苷或者其他治疗白血病的药物联合应用来治疗急性骨髓性白血病或其他恶性血液肿瘤的方法。

背景技术

Hedgehog基因是一种分节极性基因，因突变的果蝇胚胎呈多毛团状，酷似受惊刺猬而得名。哺乳动物中存在三个Hedgehog的同源基因：SonicHedgehog(SHH)、IndianHedgehog(IHH)和Desert Hedgehog(DHH)，分别编码Shh、Ihh和Dhh蛋白。Hh蛋白家族成员均由两个结构域组成：氨基端结构域(Hh-N)及羧基端结构域(Hh-C)，其中Hh-N有Hh蛋白的信号活性，而Hh-C则具有自身蛋白水解酶活性及胆固醇转移酶功能。Hh前体蛋白在内质网中通过自身催化分裂成Hh-N及Hh-C两部分，其中Hh-C共价结合胆固醇分子、并将其转移到Hh-N的羧基端，随后在酰基转移酶的作用下Hh-N氨基端的半胱氨酸发生棕榈酰化。Hh蛋白只有通过这些翻译后的修饰过程才能获得完全功能。

Hedgehog信号转导通路是一个经典的控制胚胎发育的信号转导途径，在胚胎发育和胚胎形成后细胞的生长和分化过程中都起着重要的作用。目前大量的研究表明，Hedgehog信号通路的异常激活与肿瘤发生有关，研究Hedgehog信号通路抑制剂对于探明肿瘤的发生和发展从而有针对性地进行治疗具有重要的意义。Hedgehog信号通路是与白血病肿瘤细胞的增殖密切相关的一种信号通路，其组成结构与功能的变化影响白血病细胞的自我更新能力。针对Hedgehog为靶点的药物研究为白血病的治疗提供了独特的办法。

AML是一种进展迅速的血液和骨髓癌症。由于恶性白血球的不受控增殖和积累，导致它们不但功能失常，而且影响正常血细胞的生成。根据美国国家癌症研究所(NCI)统计，美国在2018年大约有19520名患者被诊断患有AML，大约10670名患者因此去世。2016年1月，中国医学科学院陈万青教授在全球癌症领域顶级杂志《CA Cancer J Clin》发表文章“Cancer Statistics in China，2015”，预计2015年我国白血病发病人数约为7.53万；另中国医学科学院学报文章显示，按照白血病发病率分布，AML约占白血病发病的58％，每年新增AML病人数大概为4.36万。

治疗AML的标准疗法为高强度阿糖胞苷化疗，但是接近一半的AML患者由于合并症和与阿糖胞苷相关的毒性而无法接受高强度化疗，从而使用靶向药物与低剂量的阿糖胞苷的联合治疗成了一个可供考虑的选择。由于Hedgehog信号通路是与恶性血液肿瘤的发生发展密切相关的一种信号通路，所以Hedgehog信号通路的抑制剂与低剂量的阿糖胞苷的联合治疗可能会使恶性血液瘤得到抑制，从而为不能接受高强度阿糖胞苷化疗的患病人群提供帮助。急性髓性白血病(AML)多见于老年患者，其中位诊断年龄为67岁。老年(年龄＞60岁)AML患者的完全缓解(CR)率和无疾病生存(DFS)率都较年轻患者低。据报道，5年总体生存(OS)率在55～64岁患者中为18.4％，在65-74岁患者中为8％，在≥75岁患者中为1.7％。老年与年轻患者之间的这种生存差异，部分可以用并发症来解释。同时人们也认识到AML的生物学特性在老年患者中有所不同。例如，老年患者发生不良染色体核型和主要抗药性的机率较高，患有未发现的骨髓增生异常综合征(MDS)的比例亦较高。

介芬胺是一种天然化合物，属于甾族的介藜芦生物碱。介芬胺又被称为介藜芦碱，介藜芦胺，杰尔文和蒜藜芦碱等。介芬胺的英文名称是Jervine。它是最先从玉米百合花加州藜芦中分离出的一种化学物质，可导致独眼畸形。1957年美国农业部的科学家开始了长达11年的研究，最终发现环巴胺和介芬胺是导致美国当地山羊出生缺陷的罪魁祸首。介芬胺能与Hedgehog信号通路中的Smoothened(Smo)蛋白结合，从而抑制该蛋白活性。由于Hedgehog信号通路的突变与多种肿瘤的发病有关联，所以介芬胺可能成为治疗肿瘤，特别是基底细胞癌、白血病、髓母细胞瘤、肺癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、胃癌、脑癌、食管癌、肝癌等的药物。介芬胺的分子结构如下：

藜芦是多年生草本植物。鳞茎不明显膨大，根茎粗短，生长数根细长的肉质根。茎直立，上部密生白色毛，基部常有叶鞘腐烂后残留的叶脉所成棕毛状纤维。叶互生，椭圆状，披针形，基部渐窄，呈鞘状抱茎，叶上面绿色，下面灰绿。圆锥花序，雄蕊6，花药肾形，子房具乳突状毛，花柱3，由各心皮顶端生出。蒴果，种子有翅。藜芦有祛痰，催吐，杀虫。用于治疗中风痰壅、癫痫、淋巴管炎、疟疾、乳腺炎、骨折、跌打损伤、头癣、疥疮等症，还可用于灭蛆、蝇等。藜芦分布于东北、华北及陕西、甘肃、山东、河南、湖北、四川、贵州等地，生于海拔1200-3000m的山坡林下或草丛中。藜芦的品种包括牯岭藜芦、毛穗藜芦、兴安藜芦及毛叶藜芦。

阿糖胞苷(Cytarabine或Cytosine arabinoside)用于治疗恶性血液病的药物，适应症包括急性骨髓性白血病和非霍奇金氏淋巴瘤等。阿糖胞苷又被称为Ara-C(Arabinofuranosyl Cytidine的缩写)。它的作用原理是通过干扰DNA合成来消灭肿瘤细胞。

发明内容

本发明提供一种以介芬胺或其药学上可接受的盐作为有效成分的抗肿瘤药物的组合。所述的抗肿瘤药物的组合中含有抗肿瘤有效量的介芬胺或其药学上可接受的盐及可药用载体和/或赋形剂。药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐及其它可以在医学上应用的盐。

本发明通过实验证明介芬胺是一个非常有效的Hedgehog信号通路的抑制剂，在介芬胺与低剂量阿糖胞苷联合治疗急性髓系白血病药效学实验中，介芬胺被证明是一种有效的抗肿瘤剂，能够抑制急性髓系白血病在小鼠体内的生长。介芬胺具有被开发成联合用药治疗急性髓系白血病的潜力。

介芬胺的制备

介芬胺的提取通常采用水浸和醇浸法。把藜芦的地下根茎洗净然后剪断成1-2厘米的长度，然后磨成粉，加水或者95％乙醇煎煮过夜。蒸干后用硅胶柱分离得介芬胺。

介芬胺的药理试验

1.介芬胺抑制Hedgehog信号通路IC50的测定

采用文献方法测定了介芬胺抑制Hedgehog信号通路IC50，结果为50nM。这表明介芬胺是一种很强的Hedgehog信号通路的抑制剂。

2.介芬胺与低剂量阿糖胞苷联合治疗急性髓系白血病药效学实验

在本实验中，JNSW10037是指阿糖胞苷，JNSW10032是指介芬胺。利用急性髓系白血病人源化小鼠模型，在体内环境中验证了JNSW10032与JNSW10037联合治疗白血病的效果。实验以NOD-SCID IL2Rγ-/-(NSI)第三代免疫缺陷小鼠和人原代急性髓系白血病细胞(AML170218)为基础建立了白血病人源化小鼠模型，试验期间通过流式细胞术连续评估JNSW10032与JNSW10037对白血病的治疗效果。同时通过观测小鼠的体重变化、各项生理状态、活动能力和生存情况等，间接观测小鼠白血病发病进程。通过以上一系列结果，验证了JNSW10032与JNSW10037联合治疗可有效控制白血病疾病进程，且在停止给JNSW10037后，连续给JNSW10032可在一定程度上减缓小鼠外周血白血病细胞复发速度。

AML170218肿瘤细胞来源于AML患者外周血细胞，已在体内传代三次，经检测为CD33及CD123双阳性细胞群，在小鼠体内建模成功率为百分之百，恶性程度极高，发病速度快。参照供试品临床拟用信息，AML170218白血病细胞为尾静脉给药，注射后通过检测小鼠外周血评估建模情况并据此进行分组。阴性对照组进行40％Captisol灌胃和生理盐水皮下注射，阳性对照组为JNSW10037皮下注射及40％Captisol灌胃，待测药组为JNSW10032灌胃及生理盐水皮下，联合给药组为JNSW10037皮下及JNSW10032灌胃。阳性药或生理盐水连续皮下注射14天，Jnsw10032及40％Captisol连续灌胃28天，给药完成后观察七天后对小鼠骨髓、脾脏及外周血中肿瘤细胞进行定量分析。

在本试验条件下，阳性对照组及联合给药组连续给药八天后观测到肿瘤细胞水平明显下降，连续给药十四天小鼠外周血肿瘤细胞大幅度被清除。阳性药停药后肿瘤细胞比例逐渐上升，但继续给JNSW10032组上升趋势更为缓慢，提示JNSW10032可有助于减缓JNSW10037治疗后白血病复发进程。

此外还进行了下列试验：

介芬胺在小鼠体内的药代动力学试验

口服给药的介芬胺在3个CD-1小鼠体内的药代动力学参数见表1，介芬胺的生物利用度为41％。实验数据表明介芬胺能在体内保持一定的药物浓度，有利于抗肿瘤的效果。

小鼠口服给药的最大耐受剂量实验

BALB/c裸小鼠以剂量80mg/kg每天一次连续口服给药14天，所有受试小鼠生长良好，体重无明显变化，无小鼠死亡。实验结果表明介芬胺对BALB/c裸小鼠的最大耐受剂量大于80毫克每千克。

介芬胺盐酸盐的制备

把介芬胺溶解在无水乙醇中，然后向溶液中滴加盐酸析出介芬胺盐酸盐。

附图说明

图1 AML样本信息及实验流程图。

图2给药及观察期间小鼠体重变化曲线。图中JNSW10037是指阿糖胞苷，JNSW10032是指介芬胺。

图3小鼠外周血肿瘤细胞比例趋势图。图中JNSW10037是指阿糖胞苷，JNSW10032是指介芬胺。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例详细描述本发明，所述的实施例用于描述本发明，而不是限制本发明。

实施例1介芬胺的制备

取在四川省采集获得的藜芦2kg磨成粉末，然后用95％乙醇(20L)萃取。萃取液真空浓缩后获得350g浓缩物，然后用乙酸乙酯溶解。用纯净水洗涤有机相，弃去水相。有机相在用无水硫酸钠干燥后真空蒸干，得80克浓缩物。将浓缩物装入硅胶层析柱，用CHCl3-MeOH(20∶1)进行洗脱。通过这一过程，可制得200毫克介芬胺。

实施例2体外试验：检测介芬胺抑制Hedgehog信号通路的实验方法

2.1细胞培养

Hedgehog信号通路的Gli报告基因-NIH3T3细胞培养在含10％小牛血清500微克/毫升的G-418硫酸盐1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中。

2.2测定方法

Hedgehog信号通路的Gli报告基因-NIH3T3细胞接种在白色透明底96孔微量板(每孔含有25，000细胞和100微升生长培养基)。细胞在CO2培养箱(37℃和5％CO2)下培养过夜。第二天用测定培养基(Opti-MEM低血清培养基+0.5％小牛血清+1％非必需氨基酸+1mM的丙酮酸钠+10mM HEPES+1％青霉素/链霉素)稀释介芬胺到要检测的浓度。取出在96孔微量板的培养基，在每孔加入45微升的配制的介芬胺溶液，把细胞放回CO2培养箱培养2小时。然后在每孔中加入5微升的用测定培养基稀释的mShh(最后[mShh]＝1微克/毫升)。在无细胞对照孔中加入50微升测定培养基。把细胞放回CO2培养箱继续培养27小时。然后，溶解细胞，并进行荧光素酶测定：在每孔中加入50微升萤光素酶试剂，并在室温下放置约20分。使用光度计测量发光(BioTek的SynergyTM 2酶标仪)

2.3数据分析

使用计算机软件GraphPad分析发光强度数据。在没有加入介芬胺时，发光强度(LT)被定义为100％。在不存在细胞的发光强度(LB)被定义为0％。在介芬胺存在下的百分发光是按照下列公式计算：％荧光＝(L-LB)/(LT-LB)，其中L＝在介芬胺的存在下的发光强度，LB＝在无细胞的发光强度，LT＝在没有介芬胺的发光强度。

依据百分发光与化合物浓度的值，绘制S形剂量-响应曲线的非线性回归分析的方程：Y＝B+(T-B)/1+10^{((LogEC50-X)×Hill Slope)}，其中Y＝％发光，B＝最小百分比发光，T＝最大百分比发光，X＝对数化合物，希尔斜率(Hill slope)＝斜率因子或希尔系数。IC 50是达到一半最大活性百分比的化合物浓度。

通过上面的实验得出介芬胺抑制Hedgehog信号通路的IC50是50nM。

实施例3介芬胺与低剂量阿糖胞苷联合治疗急性髓系白血病药效学实验

本试验选用NSI小鼠建立的AML人源化小鼠模型进行药效评价。NSI小鼠是在NOD-SCID基础上敲除IL2γ受体得到的重度免疫缺陷小鼠，是理想的肿瘤异种移植模型。AML170218样本是从人体获得的CD33及CD123双阳的AML原代肿瘤样本，在体内可稳定建模及传代，相较于CDX模型可更好地保留原代肿瘤的生理特性及特征，是一种良好的药效评估模型。

实验系统来源：NSI小鼠由湖南昭泰生物医药有限公司负责生产及饲养管理，湖南昭泰具有SPF级动物房和较高等级实验动物饲养条件，能够满足NSI小鼠生长存活和实验开展条件。

试验方法

白血病小鼠模型构建和分组给药

(1)从液氮取出冻存的AML170218细胞，37摄氏度快速溶解后置于含5ml PBS的15ml离心管中，300g离心5分钟；

(2)弃上清，沉淀用1mlPBS重悬，吹打混匀后分装至5个PCR管中，置于冰上，移至动物房；

(3)取8周龄NSI小鼠5只，辐照，剂量为1.5Gy/只；

(4)尾静脉注射细胞悬液至小鼠体内，建模一个月后开始每两周采集小鼠外周血进行流式检测，待外周血肿瘤细胞大于20％后取小鼠骨髓细胞获得大量肿瘤细胞。

(5)裂红后流式检测小鼠骨髓中肿瘤细胞比例，取2.1*10^7肿瘤细胞，用PBS重悬至浓度为2.5*10^6/ml，按每管200ul分装至40个PCR管中，置于冰上运送至动物房，尾静脉注射至1.5Gy辐照后的小鼠体内；

(6)每四天抽取小鼠外周血进行流式检测，待外周血中可明显观测到肿瘤细胞存在后进行分组给药。所有小鼠注射后经观察状态良好，自细胞注射之日起，所有动物检疫驯养及试验期间每天至少1次观察死亡、发病、呼吸、分泌物、粪便以及饮食、饮水情况，每天测定小鼠体重。

(7)建模成功后，各组小鼠分别注射以下剂量供试品和对照品：

结果观察

(1)流式检测结果：对每次采集的小鼠外周血流式数据进行分析，即将外周血裂解后流式检测小鼠外周血中hCD45+hCD33+的细胞群体。

(2)小鼠体重：每三天称量小鼠体重并对其进行统计汇总，对记录的小鼠白血病发病及死亡情况进行汇总并绘制生存曲线，以反映供试品延长小鼠白血病模型生存期的能力。

(3)小鼠状态：给药前五天，小鼠陆续出现大便干涩粘稠，且色度偏黑的症状，且大部分小鼠出现大便粘在尾部等现象，后又陆续回复正常状态。阳性药给药组及联合给药组小鼠状态较供试品组及阴性对照组状态差，小鼠毛发粗糙偏黄，出现炸毛及毛发结团现象，部分小鼠体态虚弱并出现弓背现象，停药后小鼠状态逐渐恢复正常。

结果评定标准

将联合给药组与溶媒对照组、阳性对照组及供试品单独给药组进行统计学分析对比，观察是否具有统计学差异；将各组小鼠生存曲线进行统计学分析，观察是否具有统计学差异(p＜0.05)。

本实验中，建模成功的AML人源化小鼠被给予了不同的治疗，分别为随机分为四组，并进行了不同的药物注射，分别为溶媒组、阳性药给药组、供试品给药组及联合给药组。通过外周血检测结果可知供试品与阳性药联合使用可有效抑制AML人源化小鼠外周血肿瘤细胞增长，且在阳性药停药后，联合用药组比单独阳性药给药组的肿瘤细胞增殖更为缓慢，说明联合治疗可部分延缓AML肿瘤细胞的生长。

实施例4介芬胺的药代动力学实验

口服给药：取3只雄性8周龄CD-1小鼠，单次剂量10mg/kg经口给予介芬胺。分别于给药后2min、5min、15min、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时，经心脏穿刺采血并制得血浆，以测定介芬胺的血浆浓度。口饲给药的介芬胺在3个小鼠体内的药代动力学参数见表3，其中平均生物利用度为41.2％。这些实验数据说明介芬胺能在体内保持一定的药物浓度，从而有利于肿瘤的治疗。

表1介芬胺在小鼠体内的药代动力学数据

实施例5介芬胺对BALB/c裸小鼠的最大耐受剂量实验

取9只BALB/c裸小鼠，随机分成3组，口服每天一次给药50毫克每千克，80毫克每千克和150毫克每千克。150毫克每千克组有两只小鼠死亡，另外两组在连续用药14天没有小鼠死亡。初步确定介芬胺对BALB/c裸小鼠的最大耐受剂量大于80毫克每千克。

实施例6介芬胺盐酸盐的制备

把1克介芬胺加热溶解在30毫升无水乙醇中，冷却到室温后往里滴加盐酸至酸性，析出白色固体。过滤烘干得到1克介芬胺盐酸盐。

Claims (5)

1.一种用抗肿瘤药物的联合使用来治疗急性骨髓性白血病或其他恶性血液肿瘤的方法，其特征在于该方法是以介芬胺或其药学上可接受的盐作为有效成分与低剂量的阿糖胞苷联合使用。介芬胺的分子结构如下：

2.如权利要求1所述的抗肿瘤药物的联合使用，其特征在于该药物组合中含有抗肿瘤有效量的介芬胺或其药学上可接受的盐及可药用载体和/或赋形剂。

3.如权利要求1所述的药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐及其它可以在医学上应用的盐。

4.权利要求1中的其他恶性血液肿瘤，是指骨髓增生异常综合征或者慢性粒单核细胞白血病。

5.权利要求1中的低剂量的阿糖胞苷是指治疗有效剂量的阿糖胞苷。

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