CN112390846B - 一种抗肿瘤药物的晶型及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两种介芬胺的晶型及其制备方法，以及含有治疗有效剂量的该类化合物的药物组合物和在治疗肿瘤中的应用。晶型制备工艺简单，收率高，适合工业化生产。

Description

一种抗肿瘤药物的晶型及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物的晶型，具体涉及介芬胺不同的晶型及其制备方法和用途。

背景技术

Hedgehog基因是一种分节极性基因，因突变的果蝇胚胎呈多毛团状，酷似受惊刺猬而得名。哺乳动物中存在三个Hedgehog的同源基因：SonicHedgehog(SHH)、IndianHedgehog(IHH)和Desert Hedgehog(DHH)，分别编码Shh、Ihh和Dhh蛋白。Hh蛋白家族成员均由两个结构域组成：氨基端结构域(Hh-N)及羧基端结构域(Hh-C)，其中Hh-N有Hh蛋白的信号活性，而Hh-C则具有自身蛋白水解酶活性及胆固醇转移酶功能。Hh前体蛋白在内质网中通过自身催化分裂成Hh-N及Hh-C两部分，其中Hh-C共价结合胆固醇分子、并将其转移到Hh-N的羧基端，随后在酰基转移酶的作用下Hh-N氨基端的半胱氨酸发生棕榈酰化。Hh蛋白只有通过这些翻译后的修饰过程才能获得完全功能。

Hedgehog信号转导通路是一个经典的控制胚胎发育的信号转导途径，在胚胎发育和胚胎形成后细胞的生长和分化过程中都起着重要的作用。目前大量的研究表明，Hedgehog信号通路的异常激活与肿瘤发生有关，研究Hedgehog信号通路抑制剂对于探明肿瘤的发生和发展从而有针对性地进行治疗具有重要的意义。

基底细胞癌是最常见的皮肤恶性肿瘤之一。基底细胞癌(BCC)虽然死亡率较低，但对患者身心健康的危害较大。电离辐射、紫外线、外伤等都与基底细胞癌的发病密切相关。近几年的研究表明Hedgehog信号通路在基底细胞癌的发病中起着重要作用。

介芬胺是一种天然化合物，属于甾族的介藜芦生物碱。介芬胺又被称为介藜芦碱，介藜芦胺，杰尔文和蒜藜芦碱等。介芬胺的英文名称是Jervine。它是最先从玉米百合花加州藜芦中分离出的一种化学物质，可导致独眼畸形。1957年美国农业部的科学家开始了长达11年的研究，最终发现环巴胺和介芬胺是导致美国当地山羊出生缺陷的罪魁祸首。介芬胺能与Hedgehog信号通路中的Smoothened(Smo)蛋白结合，从而抑制该蛋白活性。由于Hedgehog信号通路的突变与多种肿瘤的发病有关联，所以介芬胺可能成为治疗肿瘤，特别是基底细胞癌、髓母细胞瘤、肺癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、胃癌、脑癌、食管癌、肝癌等的药物。介芬胺的分子结构如下：

藜芦是多年生草本植物。鳞茎不明显膨大，根茎粗短，生长数根细长的肉质根。茎直立，上部密生白色毛，基部常有叶鞘腐烂后残留的叶脉所成棕毛状纤维。叶互生，椭圆状，披针形，基部渐窄，呈鞘状抱茎，叶上面绿色，下面灰绿。圆锥花序，雄蕊6，花药肾形，子房具乳突状毛，花柱3，由各心皮顶端生出。蒴果，种子有翅。藜芦有祛痰，催吐，杀虫。用于治疗中风痰壅、癫痫、淋巴管炎、疟疾、乳腺炎、骨折、跌打损伤、头癣、疥疮等症，还可用于灭蛆、蝇等。藜芦分布于东北、华北及陕西、甘肃、山东、河南、湖北、四川、贵州等地，生于海拔1200-3000m的山坡林下或草丛中。藜芦的品种包括牯岭藜芦、毛穗藜芦、兴安藜芦及毛叶藜芦。

化合物的不同晶型在人体中具有不同的生物利用度，所以晶型的研究对口服药物的制剂很重要。

发明内容

本发明的目的在于提供介芬胺的晶型I和II，晶型采用了X-射线粉末衍射表征，使用的Cu-Ka辐射。

本发明提供的晶型I，其X-射线粉末衍射图谱在2Θ(±0.2°)值为13.5097°、13.7117°、17.7732°、14.5810°处具有特征峰。更进一步的，本发明提供的晶型I，其X-射线粉末衍射图还在2Θ(±0.2°)值为6.7399°、8.7103°、10.9690°、11.0651°、12.1224°、15.0048°、16.1113°、20.2443°、20.6768°、23.1278°、26.2035°、27.1966°、27.6453°、41.0536°处具有特征峰。更进一步的，本发明提供的晶型I，其X-射线粉末衍射图如图1所示。

本发明提供的晶型II，其X-射线粉末衍射图谱在2Θ(±0.2°值为13.6199°、13.3548°、14.6803°、15.0188°、14.4729°、20.7405°、20.9599°、17.1282°、8.8458°、16.3034°处具有特征峰。

更进一步的，本发明提供的晶型II，其X-射线粉末衍射图还在2Θ(±0.2°)值为16.0515°、19.7802°、15.8398°、9.1034°、11.6825°、21.2135°、20.4846°、17.7607°、20.2196°、26.0347°、23.3938°、25.7750°、24.0115°、18.2995°、44.4657°、27.4530°、31.6225°、35.6230°、30.7323°、26.3009°、42.2070°处具有特征峰。

更进一步的，本发明提供的晶型II，其X-射线粉末衍射图如图2所示。

本发明的另一目的在于提供介芬胺晶型I和II的制备方法。

本发明提供的晶型I的制备方法，其制备方法包括以下步骤：

1.室温下，将介芬胺溶于甲醇中，得到澄清溶液，

2.蒸去甲醇至固体析出，

3.过滤样品即得晶型I。

本发明提供的晶型II的制备方法，其制备方法包括以下步骤：

1.室温下，将介芬胺溶于乙腈中，得到澄清溶液，

2.蒸去乙腈至固体析出，

3.过滤样品即得晶型II。

介芬胺的制备

介芬胺的提取通常采用水浸和醇浸法。把藜芦的地下根茎洗净然后剪断成1-2厘米的长度，然后磨成粉，加水或者95％乙醇煎煮过夜。蒸干后用硅胶柱分离得介芬胺。

介芬胺的药理试验

1.介芬胺抑制Hedgehog信号通路IC50的测定

采用文献方法测定了介芬胺抑制Hedgehog信号通路IC50，结果为50nM。这表明介芬胺是一种很强的Hedgehog信号通路的抑制剂。

2.应用人肿瘤异种移植裸鼠模型进行介芬胺的抗肿瘤有效性试验

在介芬胺有效抑制Hedgehog信号通路的基础上，应用人肿瘤异种移植裸鼠模型(皮下接种)评价介芬胺的抗肿瘤作用，受试的肿瘤细胞包括人胰腺癌细胞BXPC-3、人肺癌细胞NCI-H2122和基底细胞癌细胞A431。结果(见图3-5)显示，介芬胺强烈抑制这3种肿瘤生长，同时未发现介芬胺具有明显的副作用，包括体重的变化。这些数据表明，介芬胺能明显抑制体内肿瘤生长，是开发新的抗肿瘤药物的很好的候选化合物。

此外还进行了下列试验：

介芬胺在小鼠体内的药代动力学试验

口服给药的介芬胺在3个CD-1小鼠体内的药代动力学参数见表3，介芬胺的生物利用度为41％。实验数据表明介芬胺能在体内保持一定的药物浓度，有利于抗肿瘤的效果。

小鼠口服给药的最大耐受剂量实验

BALB/c裸小鼠以剂量80mg/kg每天一次连续口服给药14天，所有受试小鼠生长良好，体重无明显变化，无小鼠死亡。实验结果表明介芬胺对BALB/c裸小鼠的最大耐受剂量大于80毫克每千克。

介芬胺盐酸盐的制备

把介芬胺溶解在无水乙醇中，然后向溶液中滴加盐酸析出介芬胺盐酸盐。

附图说明

图1晶型I的X-射线粉末衍射图

图2晶型II的X-射线粉末衍射图

图3介芬胺和GDC-0449对人肺癌细胞NCI-H2122在BALB/c裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用

图4介芬胺和GDC-0449对人基底癌细胞A431在BALB/c裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用

图5介芬胺和GDC-0449对人胰腺癌细胞BXPC-3在BALB/c裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例详细描述本发明，所述的实施例用于描述本发明，而不是限制本发明。

实施例1介芬胺的制备

取在四川省采集获得的藜芦2kg磨成粉末，然后用95％乙醇(20L)萃取。萃取液真空浓缩后获得350g浓缩物，然后用乙酸乙酯溶解。用纯净水洗涤有机相，弃去水相。有机相在用无水硫酸钠干燥后真空蒸干，得80克浓缩物。将浓缩物装入硅胶层析柱，用CHCl3-MeOH(20∶1)进行洗脱。通过这一过程，可制得200毫克介芬胺。

实施例2晶型I的制备

称取300毫克JNSW10032在溶解在300ml甲醇中，待完全溶解后用旋转蒸发仪进行旋蒸，直至有固体析出，放入冰箱中冷却，固体析出后过滤，得晶型I，其XRPD图谱如图1所示。

实施例3晶型II的制备

称取300毫克JNSW10032在溶解在300ml乙腈中，待完全溶解后用旋转蒸发仪进行旋蒸，直至有固体析出，放入冰箱中冷却，固体析出后过滤，得晶型II，其XRPD图谱如图2所示。

实施例4体外试验：检测介芬胺抑制Hedgehog信号通路的实验方法

4.1细胞培养

Hedgehog信号通路的Gli报告基因-NIH3T3细胞培养在含10％小牛血清500微克/毫升的G-418硫酸盐1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中。

4.2测定方法

Hedgehog信号通路的Gli报告基因-NIH3T3细胞接种在白色透明底96孔微量板(每孔含有25,000细胞和100微升生长培养基)。细胞在CO2培养箱(37℃和5％CO2)下培养过夜。第二天用测定培养基(Opti-MEM低血清培养基+0.5％小牛血清+1％非必需氨基酸+1mM的丙酮酸钠+10mM HEPES+1％青霉素/链霉素)稀释介芬胺到要检测的浓度。取出在96孔微量板的培养基，在每孔加入45微升的配制的介芬胺溶液，把细胞放回CO2培养箱培养2小时。然后在每孔中加入5微升的用测定培养基稀释的mShh(最后[mShh]＝1微克/毫升)。在无细胞对照孔中加入50微升测定培养基。把细胞放回CO2培养箱继续培养27小时。然后，溶解细胞，并进行荧光素酶测定：在每孔中加入50微升萤光素酶试剂，并在室温下放置约20分。使用光度计测量发光(BioTek的SynergyTM 2酶标仪)

4.3数据分析

使用计算机软件GraphPad分析发光强度数据。在没有加入介芬胺时，发光强度(LT)被定义为100％。在不存在细胞的发光强度(LB)被定义为0％。在介芬胺存在下的百分发光是按照下列公式计算：％荧光＝(L-LB)/(LT-LB)，其中L＝在介芬胺的存在下的发光强度，LB＝在无细胞的发光强度，LT＝在没有介芬胺的发光强度。

依据百分发光与化合物浓度的值，绘制S形剂量-响应曲线的非线性回归分析的方程：Y＝B+(T-B)/1+10^{((LogEC50-X)×Hill Slope)}，其中Y＝％发光，B＝最小百分比发光，T＝最大百分比发光，X＝对数化合物，希尔斜率(Hill slope)＝斜率因子或希尔系数。IC 50是达到一半最大活性百分比的化合物浓度。

通过上面的实验得出介芬胺抑制Hedgehog信号通路的IC50是50nM。

实施例5介芬胺对肿瘤细胞NCI-H2122和A431在BALB/c裸小鼠皮下肿瘤模型上的药效学和药物安全性评价

通过在BALB/c裸小鼠皮下接种NCI-H2122和A431两种肿瘤细胞建立移植瘤模型，进行介芬胺和GDC-0449在这些肿瘤模型上的药效和安全性评价。

1.细胞培养

将NCI-H2122肿瘤细胞培养于含10％胎牛血清的RMPI1640培养基中，A431肿瘤细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，所有细胞按照常规使用含有EDTA胰蛋白酶消化，每周传代两次，放置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。

2.实验动物

BALB/c裸小鼠，雌性，6-8周龄，体重约18-22g，数量为110只，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司。所有的小鼠均饲养于SPF级动物房IVC恒温恒压系统中，其中温度为20.5-24.5℃，湿度为40-75％，光照周期12小时明12小时暗。每个饲养笼内饲养4只小鼠，饲养笼的规格为325mm x 210mm x 180mm，笼内使用垫料为玉米芯，每周更换两次。在整个实验过程中，所有实验小鼠均可以自由饮食，饲料和水均经过高压灭菌，每周更换2次。每只饲养笼均有对应的明确的详细标签，标签内容包括：动物数目、性别、品系、接收日期、项目编号、组别、目前实验阶段和实验负责人等。采用小鼠耳朵打孔器进行动物编号。所有实验动物均适应一周后开始实验。

3.接种细胞

收集对数生长期细胞，用PBS和Matrigel调整细胞浓度分别为NCI-H2122(5x10⁷/ml)、NCI-H1703(1x10⁸/ml)、A431(5x10⁷/ml)，用1ml注射器将0.1ml细胞悬液接种于每只小鼠右侧靠近背部皮下。观察和测量肿瘤体积，平均肿瘤体积达到约200(150-250)mm³时进行分组和给药。具体分组和给药如下表1：

表1

Note：N：动物数量；

p.o.口服给药，

QD：每天一次.

给药体积：0.1ml/10g

小鼠体重减轻＞15％时，需调整给药时间。

4.随机分组

为避免各组内的平衡性误差，根据测量的肿瘤体积，我们先进行配对(群)分组，之后再随机抽样分配到不同组别。

5.实验观察

实验方案和实验中的实验动物使用等均通过维亚生物(IACUC)委员会审核、讨论、修订和批准。在整个实验过程中，对实验动物的使用和观察均按照AAALAC的规定进行。实验动物在接种肿瘤细胞后，每天进行观察，记录其发病和死亡等。在按照常规实验过程中，对所有的实验动物进行行为、进食、进水、体重改变、毛发光泽和其他一些异常情况的监测和记录。

6.无菌操作

实验中涉及的药物溶液的配制、实验动物的观察、给药、肿瘤和体重的测量等操作均在生物安全柜内进行。

7.实验结束处理

荷瘤鼠肿瘤体积达到3000mm³或者组内平均肿瘤体积达到2000mm³、在实验动物出现极度消瘦或昏迷前，均需进行麻醉并安乐死。在实验过程中，实验动物体重减轻达到20％时，需停止给药并进行观察，直到体重恢复到10％再重新开始给药。本次实验中，当肿瘤平均体积达到2000mm³或者在给药结束后继续观察到59天后，麻醉处理所有荷瘤鼠，并收集肿瘤块，进行称重和拍照。

8.评估指标

8.1使用游标卡尺每周两次测量肿瘤体积，计算公式为V＝0.5a x b²，a，b分别代表肿瘤的长度和宽度。

8.2 T/C百分比，T，C分别代表给药组和对照组的肿瘤体积。

8.3 T-C，指在化合物不同给药组肿瘤块达到一定体积时，与对照组比较所延迟的天数。

8.4 (1-((Td-T0)/(Cd-C0))x100％即不同化合物组在给药后一定时间内对肿瘤的生长抑制率。

8.5肿瘤块的重量。

9.统计学分析

实验数据使用统计学分析软件SPSS18.0进行分析，采用单因素方差分析方法，与对照组比较，*p＜0.05或**P＜0.01则认为具有统计学意义的显著性差异。

实验结果表明介芬胺能有效的抑制NCI-H2122肿瘤的生长，T/C值在给药剂量21天，给药剂量40毫克/千克，60毫克/千克和80毫克/千克时分别为0.79，0.701和0.594。对照药GDC-0449的T/C值在给药剂量40毫克/千克时，为0.794。实验结果在图3中。在给药期间，小鼠的体重基本没有变化。

实验结果同时表明介芬胺能有效的抑制A-431肿瘤的生长，T/C值在给药剂量21天，给药剂量40毫克/千克，60毫克/千克和80毫克/千克时分别为0.52，0.80和0.82。对照药GDC-0449的T/C值在给药剂量40毫克/千克时，为0.89。实验结果在图4中。在给药期间，小鼠的体重基本没有变化。

实施例6介芬胺对肿瘤细胞BXPC-3裸小鼠皮下肿瘤模型上的药效学和药物安全性评价

通过在BALB/c裸小鼠皮下接种BXPC-3肿瘤细胞建立移植瘤模型，进行介芬胺和GDC-0449在这些肿瘤模型上的药效学和安全性评价。

细胞培养

将BXPC-3肿瘤细胞培养于含10％胎牛血清的RMPI1640培养基中，所有细胞按照常规使用含有EDTA胰蛋白酶消化，每周传代两次，放置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。

实验动物

BALB/c裸小鼠，雌性，6-8周龄，体重约18-22g，数量为40只，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司。

接种细胞

收集对数生长期细胞，用PBS和Matrigel调整BXPC-3细胞浓度为(5x10⁷/ml)用1ml注射器将0.1ml细胞悬液接种于每只小鼠右侧靠近背部皮下。观察和测量肿瘤体积，平均肿瘤体积达到约200(150-250)mm³时进行分组和给药。具体分组和给药如下表2：

表2

Note：N：动物数量；

QD：每天一次.

给药体积：0.1ml/10g

小鼠体重减轻＞15％时，需调整给药时间。

随机分组，实验观察，无菌操作，实验结束处理，评估指标和统计学分析都同实施例5。

实验结果表明介芬胺能有效的抑制BXPC-3肿瘤的生长，对肿瘤的生长抑制率在给药剂量20毫克/千克，40毫克/千克和80毫克/千克时分别为25.8％，59.1％和54.2％。对照药GDC-0449对肿瘤的生长抑制率在给药剂量40毫克/千克时，对肿瘤的生长抑制率为80.7％。实验结果在图5中。在给药期间，小鼠的体重基本没有变化。

实施例7介芬胺的药代动力学实验

口服给药：取3只雄性8周龄CD-1小鼠，单次剂量10mg/kg经口给予介芬胺。分别于给药后2min、5min、15min、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时，经心脏穿刺采血并制得血浆，以测定介芬胺的血浆浓度。口饲给药的介芬胺在3个小鼠体内的药代动力学参数见表3，其中平均生物利用度为41.2％。这些实验数据说明介芬胺能在体内保持一定的药物浓度，从而有利于肿瘤的治疗。

表3 介芬胺在小鼠体内的药代动力学数据

实施例8介芬胺对BALB/c裸小鼠的最大耐受剂量实验

取9只BALB/c裸小鼠，随机分成3组，口服每天一次给药50毫克每千克，80毫克每千克和150毫克每千克。150毫克每千克组有两只小鼠死亡，另外两组在连续用药14天没有小鼠死亡。初步确定介芬胺对BALB/c裸小鼠的最大耐受剂量大于80毫克每千克。

实施例9介芬胺盐酸盐的制备

把1克介芬胺加热溶解在30毫升无水乙醇中，冷却到室温后往里滴加盐酸至酸性，析出白色固体。过滤烘干得到1克介芬胺盐酸盐。

Claims (4)

1.介芬胺的晶型I，其特征在于，其X-射线粉末衍射图谱在2θ(±0.2°)值为13.5097°、13.7117°、17.7732°、14.5810°、6.7399°、8.7103°、10.9690°、11.0651°、12.1224°、15.0048°、16.1113°、20.2443°、20.6768°、23.1278°、26.2035°、27.1966°、27.6453°、41.0536°处具有特征峰

介芬胺的分子结构如下：

。

2.根据权利要求1所述的晶型I，其特征在于，其X-射线粉末衍射图谱如图1所示。

3.一种制备权利要求1所述的晶型I的方法，包括以下步骤，

(1)将介芬胺溶于甲醇中，得到澄清溶液，

(2)蒸出溶剂至固体析出，过滤，得晶型I。

4.一种药物组合物，所述药用组合物包含有效量的权利要求1的晶型I及药学上可接受的赋形剂。

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