CN112748213B - 一种单面针薄层色谱鉴别方法 - Google Patents
一种单面针薄层色谱鉴别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种单面针薄层色谱鉴别方法。该方法以木兰花碱和氯化两面针碱为对照品，明确了单面针薄层色谱的特有斑点，可用于鉴别单面针、区分单面针与两面针。该方法重复性好、准确度高、分离好，斑点清晰，且简单可行、快速、成本低，适合用于区分单面针与两面针，以及单面针药材的质量控制和真伪鉴别。而且该方法安全性好、经济环保，安全，效率高，应用前景好。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种单面针薄层色谱鉴别方法。
背景技术
单面针为芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylun)蚬壳花椒(Zanthoxylumdissitum Hemsley)和刺壳花椒(Z.echinocarpum Hemsley)常绿木质藤本，主要以蚬壳花椒为名始载于《全国中草药汇编》，收载于《中国植物志》、《湖南省中药材标准》、《广西特色中草药资源选编》等中药专著中。民间常用于治疗腰痛、牙痛、跌打损伤、疝气痛、治妇女月经过多等。根、茎、叶均可入药，药用价值高，主治牙痛、腰痛、妇女月经过多，产后月经不调等症。单面针以蚬壳花椒为主作为妇科千金胶囊、妇科千金片等中成药的主要原料药，用途广泛。
而两面针做为我国历史悠久的传统中药，也已经被《中国药典》所收录。两面针具有活血化瘀、行气止痛、祛风通络、解毒消肿的功效，主要用于跌扑损伤，胃痛，牙痛，风湿痹痛，毒蛇咬伤；外治烧烫伤等。
单面针与两面针的外形极为相似，难以区分，两者的化学成分也较为相似。因单面针缺乏完善的质量控制标准，造成单面针与两面针混淆使用严重的现象。因此，单面针与两面针的比较研究亦越来越受到学者的重视。如本申请人的专利200710064499.2等，为了更好地控制单面针饮片的质量，完善了单面针饮片标准，申请人团队不断对单面针标准进行研究，提升单面针饮片的控制指标，有效保证单面针饮片的质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于鉴别单面针与两面针的薄层色谱检测方法，为区分单面针与两面针，以及单面针药材的质量控制和真伪鉴别提供了一种全新的方法。本发明经过大量实验探索得到一种可用于鉴别单面针与双面针、控制单面针质量和真伪的薄层色谱特征斑点，构建了鉴别单面针与两面针的薄层色谱检测方法，重复性好、准确度高，且简单可行、快速、成本低，适合用于区分单面针与两面针，以及单面针药材的质量控制和真伪鉴别。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种单面针薄层色谱鉴别方法，包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液，溶剂乙醇；
(2)制备对照品溶液，对照品分别为木兰花碱和氯化两面针碱，溶剂乙醇；
(3)薄层色谱检测：
对照品溶液和供试品溶液分别点于同一硅胶薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺为展开剂，展开剂蒸汽达到饱和后展开，取出，干燥，检视；
(4)检视结果分析：供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点：在Rf＝(0.76-0.88)和Rf＝(0.90-0.98)处有明显的两个红色斑点(分别命名为DD-1和DD-2)，则供试品为单面针，而两面针和伪品均无此斑点。
上述方法中，为了更准确的控制鉴别结果的稳定性和准确性，优选地，步骤(1)中供试品溶液的制备：按照(1.2-2.8g)：(30-50ml)的比例取供试品加入乙醇中，密闭条件下超声处理60-90min，过滤，水浴蒸干，残渣加乙醇溶解，作为供试品溶液。
优选地，步骤(1)中木兰花碱对照品的浓度为0.8-1.5mg/mL，氯化两面针碱对照品的浓度为0.4-0.7mg/mL。
更优选地，木兰花碱对照品的浓度为1mg/mL，氯化两面针碱对照品的浓度为0.5mg/mL。
优选地，展开剂为三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺＝(35-45):(8-12):(0.5-1.2):(0.06-0.12)。
更优选地，展开剂为三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺＝40:10:1:0.1。
优选地，步骤(3)中展开剂蒸汽达到饱和15-30min后展开，展至6-12cm。
更优选地，步骤(3)中展开剂蒸汽达到饱和20min后展开，展至8cm。
优选地，步骤(3)中点样量：对照品溶液5-10μl，供试品溶液5-10μl。
更优选地，步骤(3)中点样量：对照品溶液5μl，供试品溶液5-10μl。
优选地，步骤(3)中硅胶薄层板为硅胶GF254薄层板。
优选地，干燥方式为晾干。
优选地，显色方式为碘熏至显色清晰。
优选地，检视方式为254nm、366nm及显色后可见光。
另外优选地，本文所用乙醇为95％乙醇。
作为一种最优选的方案，所述单面针薄层色谱鉴别方法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液：
取2g供试品粉末过二号筛，加乙醇40ml，密闭，超声处理60min，过滤，水浴蒸干，残渣加2ml乙醇溶解，作为供试品溶液(优选加2ml乙醇溶解之后过滤一下再作为供试品溶液使用)；
(2)制备对照品溶液：
取木兰花碱对照品，加乙醇制成1mg/mL的对照品溶液；
取氯化两面针碱对照品，加乙醇制成0.5mg/mL的对照品溶液；
(3)薄层色谱检测：
取对照品溶液5μl、供试品溶液5-10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺(40:10:1:0.1)为展开剂，展开剂蒸汽达到饱和20分钟后展开，展至8cm，取出，晾干，在366nm下检视；
(4)检视结果分析：供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点：在Rf＝0.85附近和Rf＝0.95附近处有明显的两个红色斑点(分别命名为DD-1和DD-2)，则供试品为单面针，而两面针和伪品均无此斑点。
另外，为了获得更准确的检测结果，该方法实施过程需要控制环境的湿度不能过高，最好控制在50％RH以下(优选31％RH-45％RH)。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种可用于鉴别单面针与两面针的薄层色谱检测方法，明确了单面针薄层色谱的特有斑点，可用于鉴别单面针、区分单面针与两面针。该方法重复性好、准确度高，且简单可行、快速、成本低，适合用于区分单面针与两面针，以及单面针药材的质量控制和真伪鉴别，应用前景好。
而且本发明的方法中，以乙醇为提取溶剂，安全性更好；GF254薄层板分离度更好，更经济环保；以三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺(40:10:1:0.1)为展开剂，分离度更好，斑点更清晰；显色方法为直接366nm检视，无需显色剂，如10％硫酸乙醇加热处理，可以直接显色，经济安全，效率更高。
附图说明
图1为单面针及对照品薄层色谱图；1-空白溶剂(乙醇)、2-木兰花碱对照品溶液、3-氯化两面针碱对照品溶液、4～10-单面针供试品、11～14-两面针供试品、15～17-单面针伪品供试品。
图2为实施例4中供试品提取溶剂考察结果图；1-对照品混标、2-单面针95％乙醇提取、3-70％乙醇提取、4-甲醇提取、5-乙酸乙酯提取。
图3为实施例4中供试品提取方式考察结果图；1-对照品混标、2-单面针Z2019030073-超声提取、3-回流提取、4-水浴提取。
图4为实施例4中供试品提取时间考察结果图；1-对照品混标、2-单面针Z2019030073-超声提取30min、3-超声提取60min、4-超声提取90min。
图5为实施例4中展开剂-1考察结果；1-对照品混标、2-单面针Z2019030073、3-单面针Z2019030074、4-单面针Z2019030077、5-单面针Z2019030078、6-单面针Z2019030085。
图6为实施例4中展开剂-2考察结果；1-对照品混标、2-单面针Z2019030073、3-单面针Z2019030074、4-单面针Z2019030077、5-单面针Z2019030078、6-单面针Z2019030085。
图7为实施例4中展开剂-3考察结果；1-对照品混标、2-单面针Z2019030073、3-单面针Z2019030074、4-单面针Z2019030077、5-单面针Z2019030078、6-单面针Z2019030085。
图8为实施例4中展开剂-4考察结果；1-对照品混标、2-单面针Z2019030073、3-单面针Z2019030074、4-单面针Z2019030077、5-单面针Z2019030078、6-单面针Z2019030085。
图9为实施例4中展开剂-5考察结果；1-对照品混标、2-单面针Z2019030073、3-单面针Z2019030074、4-单面针Z2019030077、5-单面针Z2019030078、6-单面针Z2019030085。
图10为实施例4中展开剂-6考察结果；1-对照品混标、2-单面针Z2019030073、3-单面针Z2019030074、4-单面针Z2019030077、5-单面针Z2019030078、6-单面针Z2019030085。
图11为实施例4中显色方式一的考察结果；1-对照品混标、2-单面针Z2019030073、3-单面针Z2019030074、4-单面针Z2019030077、5-单面针Z2019030078、6-单面针Z2019030085。
图12为实施例4中显色方式一的考察结果；1-对照品混标、2-单面针Z2019030073、3-单面针Z2019030074、4-单面针Z2019030075、5-单面针Z2019030079、6-单面针伪品Z2019030098、7-单面针伪品Z2019030099。
图13为实施例4中优化后薄层色谱鉴别方法的检视结果；1-对照品混标-5μl、2-单面针Z2019030073-5μl、3-单面针Z2019030074-5μl、4-单面针Z2019030077-5μl、5-两面针Z2019030093-1μl、6-单面针伪品Z2019030098-1μl。
图14为方法的专属性考察结果(上-显色前366nm、下-显色后可见光)；1-空白溶剂(乙醇)、2-木兰花碱对照品溶液、3-氯化两面针碱对照品溶液、4～7-单面针供试品(批号依次为Z2019030073、Z2019030074、Z2019030075、Z2019030076)、8～10-刺壳花椒供试品(批号依次为Z2019030100、Z2019030101、Z2019030102)、11～14-两面针供试品(批号依次为Z2019030093、Z2019030094、Z2019030095、Z2019030096)、15～17-单面针伪品供试品(批号依次为Z2019030097、Z2019030098、Z2019030099)。
图15为不同温度下展开的检视结果(A-10℃、B-20℃、C-30℃，烟台市化学工业研究所/HSGF254，左-显色前366nm、右-显色后可见光)；1-混合对照品溶液(从上到下依次为氯化两面针碱、木兰花碱)、2-单面针Z2019030073、3-单面针Z2019030074、4-单面针Z2019030077、5-单面针Z2019030078、6-单面针Z2019030085。
图16为不同湿度下展开的检视结果(A-31％RH、B-45％RH、C-78％RH，烟台市化学工业研究所/HSGF254，左-显色前366nm、右-显色后可见光)；1-混合对照品溶液(从上到下依次为氯化两面针碱、木兰花碱)、2-单面针Z2019030073、3-单面针Z2019030074、4-单面针Z2019030077、5-单面针Z2019030078、6-单面针Z2019030085。
图17为不同点样方式的检视结果(A-圆点、B-条带，烟台市化学工业研究所/HSGF254，左-显色前366nm、右-显色后可见光)；1-混合对照品溶液(从上到下依次为氯化两面针碱、木兰花碱)、2-单面针Z2019030073、3-单面针Z2019030074、4-单面针Z2019030077、5-单面针Z2019030078、6-单面针Z2019030085。
图18为供试品和对照品溶液稳定性考察结果(烟台市化学工业研究所/HSGF254，左-显色前366nm、右-显色后可见光)；1-混合对照品溶液(从上到下依次为氯化两面针碱、木兰花碱)、2～6-单面针供试品(0h、8h、48h、72h、96h)。
图19为多批次单面针样品的检测(烟台市化学工业研究所/HSGF254，左-显色前366nm、右-显色后可见光)；1-混合对照品溶液(从上到下依次为氯化两面针碱、木兰花碱)、2～17-单面针供试品(批号依次为Z2019030077、Z2019030078、Z2019030079、Z2019030080、Z2019030081、Z2019030082、Z2019030083、Z2019030084、Z2019030085、Z2019030086、Z2019030087、Z2019030088、Z2019030089、Z2019030090、Z2019030091、Z2019030092)。
图20为对比例1中实验一单面针中木兰花碱的薄层鉴别比较图；A：展开剂(二氯甲烷：甲醇＝6：4)；B：展开剂(三氯甲烷：甲醇＝6：4)；C：展开剂(三氯甲烷：甲醇：水：氨水＝6：4：1：0.25)。
图21为对比例1中实验二单面针中木兰花碱的薄层鉴别比较图(A：4μL；B：8μL；C：10μL)。
图22为对比例1的方法14两面针(LS26～LS39)和13批单面针(S1～S13)木兰花碱的薄层鉴别图。
图23为对比例2方法检视图(显色前254nm)(烟台市化学工业研究所，HSGF254)。
图24为对比例2方法检视图(显色前366nm，烟台市化学工业研究所，HSGF254)；1-白屈菜红碱、2-木兰花碱、3-白鲜碱、4-氯化两面针碱、5-单面针Z2019030073、6-单面针伪品Z2019030097、7-单面针伪品Z2019030098、8-单面针伪品Z2019030099、9-双面针Z2019030093、10-双面针Z2019030094、11-双面针Z2019030095、12-双面针Z2019030096、13-不同基源单面针Z2019030100、14-不同基源单面针Z2019030101、15-不同基源单面针Z2019030102。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中用到的实验仪器与材料等来源如下：
表1仪器
表2试剂
| 序号 | 品名 | 规格 | 纯度 | 批号 | 来源 |
| 1 | 甲醇 | 500ml | 分析纯 | P1441123 | General-Reagent |
| 2 | 95％乙醇 | 500ml | 分析纯 | P1433419 | General-Reagent |
| 3 | 三氯甲烷 | 500ml | 分析纯 | P1318320 | General-Reagent |
| 4 | 乙醇(无水) | 500ml | 分析纯 | P1437228 | General-Reagent |
| 5 | 乙酸乙酯 | 500ml | 分析纯 | P1429095 | General-Reagent |
| 6 | 氨水 | 500ml | 分析纯 | P1375833 | General-Reagent |
| 7 | 二氯甲烷 | 500ml | 分析纯 | P1454839 | General-Reagent |
| 8 | 二乙胺 | 500ml | 分析纯 | P1382819 | General-Reagent |
表3对照品
表4样品来源
表5样品批号
实施例1单面针薄层色谱鉴别方法
以单面针供试品、两面针供试品、单面针伪品供试品为样品，同时以空白乙醇溶剂为对照，进行薄层色谱分析，包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液：
取2g供试品粉末(过二号筛)，置具塞锥形瓶，加乙醇40ml，密闭，超声处理60min，过滤，水浴蒸干，残渣加2ml乙醇溶解，作为供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：
取木兰花碱对照品，加乙醇制成1mg/mL的对照品溶液；
取氯化两面针碱对照品，加乙醇制成0.5mg/mL的对照品溶液；
所用乙醇为95％乙醇。
(3)薄层色谱检测：(参照中国药典2015年版四部附录0502)
取对照品溶液5μl、供试品溶液8μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，点样方式为8mm条带，以三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺(40:10:1:0.1)为展开剂，展开剂蒸汽达到饱和20分钟后展开，展至8cm，取出，晾干，在366nm下检视；
(4)检视结果分析：供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点：在Rf＝0.85和Rf＝0.95处有明显的两个红色斑点(分别命名为DD-1和DD-2)。如图1所示，而单面针伪品、两面针无此斑点。
实施例2单面针薄层色谱鉴别方法
一种单面针薄层色谱鉴别方法，包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液：
取1.2g单面针供试品粉末(过二号筛)，置具塞锥形瓶，加乙醇30ml，密闭，超声处理90min，过滤，水浴蒸干，残渣加2ml乙醇溶解，作为供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：
取木兰花碱对照品，加乙醇制成0.8mg/mL的对照品溶液；
取氯化两面针碱对照品，加乙醇制成0.4mg/mL的对照品溶液；
(3)薄层色谱检测：(参照中国药典2015年版四部附录0502)
取对照品溶液10μl、供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，点样方式为8mm条带，以三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺＝35:8:0.5:0.06为展开剂，展开剂蒸汽达到饱和15min后展开，展至6cm，取出，晾干，在254nm下检视；
(4)检视结果同实施例1，供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点：在Rf＝0.85和Rf＝0.95处有明显的两个红色斑点(分别命名为DD-1和DD-2)。
实施例3单面针薄层色谱鉴别方法
一种单面针薄层色谱鉴别方法，包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液：
取2.8g单面针供试品粉末(过二号筛)，置具塞锥形瓶，加乙醇50ml，密闭，超声处理60min，过滤，水浴蒸干，残渣加2ml乙醇溶解，作为供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：
取木兰花碱对照品，加乙醇制成1.5mg/mL的对照品溶液；
取氯化两面针碱对照品，加乙醇制成0.7mg/mL的对照品溶液；
(3)薄层色谱检测：(参照中国药典2015年版四部附录0502)
取对照品溶液8μl、供试品溶液5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，点样方式为8mm条带，以三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺＝45:12:1.2:0.12为展开剂，展开剂蒸汽达到饱和30min后展开，展至12cm，取出，晾干，在366nm下检视；
(4)检视结果同实施例1，供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点：在Rf＝0.85和Rf＝0.95处有明显的两个红色斑点(分别命名为DD-1和DD-2)。
实施例4单面针薄层色谱方法优化
本实施例呈现部分单面针薄层色谱鉴别方法中条件的优化实验及数据(供试品提取方式、展开剂、显色方式)。
1、供试品提取工艺的优化
(1)供试品提取溶剂的考察
供试品溶液的制备：取供试品粉末(过二号筛)2g，置具塞锥形瓶，分别加95％乙醇、70％乙醇、甲醇、乙酸乙酯40ml，密闭，超声处理60min，过滤，水浴蒸干，残渣加1ml乙醇溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：木兰花碱对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的对照品溶液。氯化两面针碱对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的对照品溶液。
点样量：对照品(5μl)；供试品(10μl)
点样方式：条带，8mm
展开剂：三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺(40:10:1:0.1)
展至：8cm
干燥方式：晾干
检视方式：展开后晾干在254nm、366nm下检视。
结果如图2：95％乙醇、70％乙醇、甲醇提取效果比较一致，乙酸乙酯提取成分较少。综合考虑，选择95％乙醇作为提取溶剂。
(2)供试品提取方式的考察
供试品溶液的制备：取供试品粉末(过二号筛)2g，置具塞锥形瓶，加95％乙醇40ml，密闭，分别用超声、水浴50℃、回流处理60min，过滤，水浴蒸干，残渣加1ml乙醇溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：木兰花碱对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的对照品溶液。氯化两面针碱对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的对照品溶液。
点样量：对照品(5μl)；供试品(10μl)
点样方式：条带，8mm
展开剂：三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺(40:10:1:0.1)
展至：8cm
干燥方式：晾干
检视方式：在254nm及366nm下检视。
结果如图3：三种提取方式提取效果比较一致。综合各因素考虑，选择超声作为提取方式。
(3)供试品提取时间的考察
供试品溶液的制备：取供试品粉末(过二号筛)2g，置具塞锥形瓶，加95％乙醇40ml，密闭，分别超声处理30min、60min、90min，过滤，水浴蒸干，残渣加1ml乙醇溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：木兰花碱对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的对照品溶液。氯化两面针碱对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的对照品溶液。
点样量：对照品(5μl)；供试品(10μl)
点样方式：条带，8mm
展开剂：三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺(40:10:1:0.1)
展至：8cm
干燥方式：晾干
检视方式：在254nm及366nm下检视。
结果如图4：60min与90min提取效果一致，提取30min色谱条带稍浅。选择60min作为提取时间。
2、展开剂的优化
展开剂分别为：
展开剂-1：三氯甲烷:甲醇:水:氨水(6:4:1:0.25)
展开剂-2：三氯甲烷:丙酮:甲醇:甲酸(15:0.5:0.5:1)
展开剂-3：三氯甲烷:甲醇(25:1)
展开剂-4：三氯甲烷:甲醇:水:氨水(40:10:1:0.2)
展开剂-5：三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺(40:10:1:0.2)
展开剂-6：三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺(40:10:1:0.1)。
供试品溶液的制备：取供试品粉末(过二号筛)2g，置具塞锥形瓶，加乙醇40ml，密闭，超声处理60min，过滤，水浴蒸干，残渣加1ml乙醇溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：木兰花碱、氯化两面针碱对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的对照品溶液。
点样量：对照品(5μl)；供试品(10μl)
点样方式：条带，8mm
展至：8cm
干燥方式：晾干
检视方式：在254nm下及366nm下检视。
结果如图5-10：
展开剂-1(图5)：对照品和供试品相对应位置都有相同斑点清晰可见，但氯化两面针碱Rf过高，条带被遮挡。
展开剂-2(图6)：整体条带清晰，但对照品比移值过低。
展开剂-3(图7)：条带拖尾，且对照品比移值过低。
展开剂-4(图8)：条带拖尾，且对照品比移值过低。
展开剂-5(图9)：条带拖尾，且对照品比移值过低。
展开剂-6(图10)：对照品条带比移值合适，在0.2-0.8范围内。
综上所述，确定单面针薄层鉴别展开剂为展开剂-6，即三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺(40:10:1:0.1)。
3、不同显色方式的考察
供试品溶液的制备：取供试品粉末(过二号筛)2g，置具塞锥形瓶，加乙醇40ml，密闭，超声处理60min，过滤，水浴蒸干，残渣加1ml乙醇溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：木兰花碱、氯化两面针碱对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的对照品溶液。
点样量：对照品(5μl)；供试品(5μl)
点样方式：条带，8mm
展开剂：三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺(40:10:1:0.1)
展至：8cm
干燥方式：晾干
显色方式分别为：
显色方式一：喷稀碘化铋钾，静置10min后喷以10％亚硝酸钠50％乙醇，加热105℃显色。
显色方式二：碘熏至显色清晰。
结果如图11-12所示：
显色方式一(如图11)：显色后无明显优化，不选择该显色方法。
显色方式二(如图12)：显色后单面针与伪品在比移值0.1处多一个鉴别斑点，选择该显色方法。
综上结果，通过对以上实验参数的考察，优化后的薄层色谱方法，条件如下：
供试品溶液的制备：取供试品粉末(过二号筛)2g，置具塞锥形瓶，加乙醇40ml，密闭，超声处理60min，过滤，水浴蒸干，残渣加2ml乙醇溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：木兰花碱对照品，加乙醇制成1mg/mL对照品溶液。氯化两面针碱对照品，加乙醇制成0.5mg/mL对照品溶液。
点样量：对照品(5μl)；供试品(5-10μl)
点样方式：条带，8mm
展开剂：三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺(40:10:1:0.1)
展至：8cm
干燥方式：晾干
显色方式：碘熏至显色清晰
检视方式：显色前254nm、366nm及显色后可见光。检视结果如图13。
实施例5单面针薄层色谱方法的方法学验证
本实施例对上述优化的薄层色谱方法进行方法学验证，以证明该检测方法的科学性合理性、重现性和可行性。
1、优化后方法概述(同实施例1)：取木兰花碱、氯化两面针碱对照品适量，分别加乙醇制成1ml中含1mg、0.5mg的对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版四部附录0502)试验，吸取上述对照品溶液5μl；供试品溶液5-10μl分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-二乙胺(40:10:1:0.1)为展开剂，展开剂蒸汽达到饱和20分钟后展开，取出，晾干，在366nm下检视，在碘缸内熏蒸至显色清晰，在可见光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2、方法专属性
考察了7批单面针药材(包括3批刺壳花椒)、4批双面针及3批单面针伪品的薄层色谱行为。结果见图14。
结论：空白溶剂(乙醇)对色谱显色斑点无干扰。供试品在对照品相对应的位置，均有相同颜色的斑点检出。显色前366nm下，单面针供试品色谱中，在与对照品相对应的位置，显示相同颜色的荧光斑点，在在Rf＝0.85和Rf＝0.95处，各有两条亮红色斑点，可以作为单面针(包括不同基源)与两面针及伪品的鉴别点，说明方法的专属性良好。
3、不同展开温度的适用
分别考察了10℃、20℃、30℃温度下展开，实验结果见图15。
结论：不同展开温度下，在显色前366nm与显色后可见光下检视时，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点，表明方法在10℃～30℃的耐用性良好。
4、不同展开湿度的适用
分别考察了31％RH、45％RH、78％RH湿度下展开，检视结果见图16。
结论：31％RH、45％RH湿度下，在显色前366nm与显色后可见光下检视时，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点，表明该方法在31％RH～45％RH内湿度的重现性良好。78％RH湿度下，在显色前366nm与显色后可见光下检视时，供试品色谱中，在与木兰花碱对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点，但供试品中氯化两面针碱对照品亮绿色斑点处分离度不高，显现蓝色斑点，即在与氯化两面针碱对照品色谱相应的位置上，未显相同颜色的斑点。因此该方法不适用于高湿环境，故在实验过程中应控制湿度。
7、不同点样方式
分别考察了圆点点样以及条带点样的方式。检视结果见图17。
结论：分别采用圆点与条带点样，在显色前366nm与显色后可见光下检视时，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点，表明圆点点样与条带点样的薄层色谱行为基本一致。
8、稳定性
(1)供试品稳定性
供试品溶液及对照品溶液制备后，在室温下存放不同时间点(0h、8h、48h、72h、96h)后进行点样、展开以及显色检视，结果见图18。
结论：不同分析时间点(条带序号为2～6)，显色前366nm下以及显色后可见光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点。因此表明供试品溶液在96h内稳定。
另外，实验方法开发、验证总共两个月间所用对照品均为初次配制所取，在每次色谱实验中均展现出同一效果，因此表明对照品溶液具有良好的稳定性。
结论：本方法以木兰花碱、氯化两面针碱为对照指标，检测单面针的有效成分，对原有的薄层鉴别方法进行了改进和优化，优化的薄层鉴别方法专属性强、重现性良好。显色前366nm下，单面针供试品色谱中，在Rf＝0.85和Rf＝0.95处，有两条亮红色斑点，可以作为单面针(包括不同基源)与两面针及伪品的鉴别点；显色后单面针比其伪品在比移值0.1处多一个鉴别斑点。
实施例6多批次单面针样本的薄层色谱鉴别
方法同实施例1，为本发明方法的最佳条件下进行单面针的薄层色谱鉴别。结果如图19，16批单面针供试品色谱中，显色前366nm与显色后可见光下检视，在与对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点。
对比例1
1、实验一：
取供试品粉末1g，加乙醇40ml，超声提取1小时，滤过，水浴蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取木兰花碱对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015版通则0502)试验，吸取上述两种溶液8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，同时考察如下A、B、C三种展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。
三种展开剂：
A：二氯甲烷：甲醇＝6：4；
B：三氯甲烷：甲醇＝6：4；
C：三氯甲烷：甲醇：水：氨水＝6：4：1：0.25。
结果表明：供试品色谱中，C展开系统在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，斑点圆整但不太清晰(见图20)。
2、实验二：
在实验一的基础上，对比不同的点样量，分别取对照品和供试品两种溶液A：4μL；B：8μL；C：10μL，分别点于不同的薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-氨水(6：4：1：0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。结果表明：供试品色谱中，A、B、C点样量均在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，其中B、C斑点圆整且清晰，基于经济性和效率性原则，B点样量即可(见图21)。
3、综上结果，确定单面针中木兰花碱的薄层鉴别方法为：取本品粉末1g，加乙醇40ml，超声提取1小时，滤过，水浴蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取木兰花碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015版通则0502)试验，吸取上述两种溶液8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-氨水(6：4：1：0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。将供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
4、将上述方法用于鉴别区分单面针和两面针：
采用13批单面针和14批两面针样品，按照上述薄层鉴别方法鉴别，结果表明，供试品色谱中，均在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点。故此薄层鉴别方法不能有效区分单面针和两面针(见图22)。
对比例2
供试品溶液的制备：取供试品粉末(过二号筛)1g，置具塞锥形瓶，加乙醇40ml，密闭，超声处理60min，过滤，水浴蒸干，残渣加1ml乙醇溶解，过滤作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取木兰花碱、氯化两面针碱对照品，加甲醇制成为每1ml含1mg的对照品溶液。
点样量：对照品(10μl)；供试品(10μl)
点样方式：条带，8mm
展开剂：三氯甲烷:甲醇:水:氨水(6:4:1:0.25)(分层，取下层)
展至：8cm
干燥方式：晾干
检视方式：在显色前254nm下以及366nm下检视。
结果如图23、24，木兰花碱仅在显色前254nm Rf＝0.4处可见，白屈菜红碱、白鲜碱、氯化两面针碱Rf过高，双面针及单面针伪品浓度超载，无明显鉴别点。
Claims (10)
1.一种单面针薄层色谱鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备供试品溶液，溶剂乙醇；
（2）制备对照品溶液，对照品分别为木兰花碱和氯化两面针碱，溶剂乙醇；
（3）薄层色谱检测：
对照品溶液和供试品溶液分别点于同一硅胶薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺=40:10:1:0.1为展开剂，展开剂蒸汽达到饱和后展开，取出，干燥，检视；
（4）检视结果分析：供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点：在Rf=(0.76-0.88)和Rf=(0.90-0.98)处有两个红色斑点，则供试品为单面针，而两面针和伪品均无此斑点；
该方法实施过程需要控制环境的湿度在50%RH以下。
2.根据权利要求1所述单面针薄层色谱鉴别方法，其特征在于，步骤（1）中供试品溶液的制备：按照(1.2-2.8g)：(30-50ml)的比例取供试品加入乙醇中，密闭条件下超声处理60-90min，过滤，水浴蒸干，残渣加乙醇溶解，作为供试品溶液。
3.根据权利要求1所述单面针薄层色谱鉴别方法，其特征在于，步骤（1）中木兰花碱对照品的浓度为0.8-1.5mg/mL，氯化两面针碱对照品的浓度为0.4-0.7mg/mL。
4.根据权利要求1所述单面针薄层色谱鉴别方法，其特征在于，该方法实施过程需要控制环境的湿度为31%RH-45%RH。
5.根据权利要求1所述单面针薄层色谱鉴别方法，其特征在于，步骤（3）中展开剂蒸汽达到饱和15-30min后展开，展至6-12cm。
6.根据权利要求1所述单面针薄层色谱鉴别方法，其特征在于，步骤（3）中点样量：对照品溶液5-10μl，供试品溶液5-10μl。
7.根据权利要求1所述单面针薄层色谱鉴别方法，其特征在于，步骤（3）中硅胶薄层板为硅胶GF254薄层板。
8.根据权利要求1所述单面针薄层色谱鉴别方法，其特征在于，步骤（3）中干燥方式为晾干。
9.根据权利要求1所述单面针薄层色谱鉴别方法，其特征在于，显色方式为碘熏至显色清晰；检视方式为显色前254nm 、366nm及显色后可见光。
10.根据权利要求1-9任一所述单面针薄层色谱鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备供试品溶液：
取2g供试品粉末过二号筛，加乙醇40ml，密闭，超声处理60 min，过滤，水浴蒸干，残渣加2ml乙醇溶解，作为供试品溶液；
（2）制备对照品溶液：
取木兰花碱对照品，加乙醇制成1 mg/mL的对照品溶液；
取氯化两面针碱对照品，加乙醇制成0.5 mg/mL的对照品溶液；
（3）薄层色谱检测：
取对照品溶液5 μl、供试品溶液5-10 μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:水:二乙胺为展开剂，展开剂蒸汽达到饱和20分钟后展开，展至8cm，取出，晾干，在366nm下检视；
（4）检视结果分析：供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点：在Rf=0.85和Rf=0.95处有两个红色斑点，则供试品为单面针，而两面针和伪品均无此斑点。
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