CN112746092B - 一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法 - Google Patents

一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法，本发明提供的方法包括：(1)羽毛的预处理：将羽毛粉碎，置于碱溶液中，加热，并同时用微波辅助加热过程，过滤，加去离子水混合后喷雾干燥，得到预处理后的羽毛粉；(2)分段酶解：将预处理后的羽毛粉先通过含有角蛋白酶和风味蛋白酶的混合酶Ⅰ进行一次酶解，再通过含有氨基肽酶和中性蛋白酶的混合酶Ⅱ进行二次酶解，获得羽毛粉的酶解产物；(3)金属螯合：将羽毛粉的酶解产物与金属盐进行反应，最终制得金属螯合肽。由本发明制得的金属螯合肽经实验证实具有较高的螯合率，适用范围广，为制备金属螯合肽提供了新的思路。

Description

一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法。
背景技术
我国蛋白资源缺乏，而常规饲料的蛋白原料包括豆粕、鱼粉等，长期依赖进口，具有较大的经济压力，因而迫切需要寻找质优价廉的新蛋白原料。羽毛是我国重要的资源之一，产量丰富，年产量可达百万吨级，由各种家禽羽毛为原料制成的羽毛粉蛋白含量高，羽毛中粗蛋白含量在80％以上，氨基酸含量在70％以上，氨基酸组成主要为甘氨酸、丝氨酸、胱氨酸及异亮氨酸，具有多种动物所需要的必需氨基酸，但分子形状与纤维相似，结构紧密坚实，密度大，特别是羽毛蛋白是一种高度交联的二硫键构成的角蛋白，不容易被胃蛋白酶，胰蛋白酶等一般蛋白酶降解，其本身难以被动物消化吸收，需进行特殊加工处理，变为可用于消化吸收的蛋白质。
金属螯合肽可以通过蛋白肽和可溶性的盐螯合而成，具有生物利用率高、能维持生物体内的酸碱平衡、增强免疫力和减少抗营养因子等优点，是近年来在生物技术领域的研究热点，但受限于一种有效获得蛋白原料的方法，通过从商业渠道直接购买或通过购买纯化的蛋白质来水解获得，其高昂的价格不利于金属螯合肽的大范围的使用，而家禽羽毛来源广泛，蛋白含量高且未能有效利用，有待于寻求一种可以从家禽羽毛中获得蛋白肽并与金属盐螯合的方法。
中国专利申请CN201210272913.X公开了一种小肽螯合锌复合物的制备方法与应用，包括加入蛋白酶震荡培养，酶解后加入水溶性锌盐螯合制得，但该方法仅适用于豆粕、玉米蛋白、马铃薯蛋白等植源性蛋白，而本发明是要从从家禽羽毛中获得蛋白肽，相较于植源性蛋白，家禽羽毛其特殊的分子形态不易被酶解，需要特殊的加工方法。
中国专利申请CN201710732795.9公开了一种鱼蛋白小肽螯合锌，包括脱脂、酶解、螯合的过程，提供了一种以鱼肉为原材料制备金属螯合肽的方法，但原材料价格仍然较高，未能广泛应用。
发明内容
本发明旨在提供一种制备具有高螯合率的金属螯合肽的方法，特别是该方法结合禽类羽毛的预处理和二次酶解有效增强了所得酶解产物中小肽的含量，本发明整体步骤简单、所用原料易于获得，为制得金属螯合肽提供了新思路。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法，包括以下步骤：
S1:羽毛的预处理：将羽毛粉碎，置于pH为7-9的碱溶液中，加热，并同时用微波辅助加热过程，过滤，加去离子水混合后喷雾干燥，得到预处理后的羽毛粉；
S2:分段酶解：
1)将预处理后的羽毛粉置于去离子水中，得到羽毛粉的混悬液，加入混合酶Ⅰ进行酶解，加入混合酶Ⅰ的量为羽毛粉质量的0.3-0.7％，得到一次酶解液；
2)在一次酶解液中再加入混合酶Ⅱ进行酶解，加入混合酶Ⅱ的量为羽毛粉质量的0.2-0.5％，得到二次酶解液；
3)将二次酶解液煮沸灭酶、离心、过滤残渣，将酶解液烘干，得到羽毛粉的酶解产物；
S3：金属螯合：
将所得羽毛粉的酶解产物加入到去离子水中，再加入金属盐，在pH为8,温度为65℃的条件下搅拌，离心、浓缩、干燥，制得金属螯合肽。
进一步地，所述步骤S1所述加热的具体条件为：加热至85-100℃，恒温30-50min。
进一步地，所述步骤S1所述微波的功率为300-400W。
进一步地，所述步骤S2所述混合酶Ⅰ为角蛋白酶和风味蛋白酶，其质量比为3-5:1。
进一步地，所述步骤S2加入混合酶Ⅰ进行酶解的具体条件为：酶解的pH为7-8，酶解时间为8-10h,酶解温度为45-60℃。
进一步地，所述步骤S2所述混合酶Ⅱ为氨基肽酶和中性蛋白酶，其质量比为2-5:1。
进一步地，所述步骤S2加入混合酶Ⅱ进行酶解的具体条件为：酶解的pH为8-10，酶解时间为4-6h，酶解温度为55-60℃
进一步地，所述步骤S3所述金属盐包括硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明以禽类羽毛为原材料制备金属螯合肽，先通过预处理改变羽毛蛋白的分子结构，使之处于易于酶解的状态，再通过混合酶Ⅰ和混合酶Ⅱ逐步酶解，保证了羽毛的充分酶解，最后再与金属盐螯合，整个流程操作简单，所用材料价格低廉且易于获得，实用性强。
(2)本发明的预处理方式为：先通过粉碎增大表面积，所得的羽毛粉在碱性条件加热，并在加热的同时进行微波辅助，最大限度的增强羽毛粉的活性，保证了后续对羽毛粉的充分酶解。
(3)本发明对经预处理后的羽毛粉逐步通过混合酶Ⅰ和混合酶Ⅱ进行酶解，经实验证实，该方法可以有效酶解羽毛粉，酶解产物中小肽的含量可达25％。
(4)本发明还进一步证实了由本发明提供的方法制得的金属螯合肽具有较高的螯合率，通过实验结果可知与铜元素、铁元素或锌元素，金属螯合肽的螯合率均在95％以上。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，将本发明的所述内容做进一步解释。但本发明上述主题的范围不仅限于以下实施例。
以下实施例中所用到的鸭毛、硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁等均为市场上普通的商品化原材料，需要重点说明的是：角蛋白酶购于山东唐正生物科技有限公司-货号065、风味蛋白酶购于西安大丰收生物科技有限公司-货号5685、氨基肽酶购于西安隆茂生物科技有限公司-货号002、中性蛋白酶购于广东欧斯曼生物科技有限公司-货号1。
实施例1、一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法
一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法，包括以下步骤：
S1:羽毛的预处理：将鸭毛粉碎，置于pH为7的氢氧化钠水溶液中，加热至85℃，恒温30min，并同时用微波辅助加热过程，所述微波的功率为300W，过滤，加去离子水混合后喷雾干燥，得到预处理后的羽毛粉；
S2:分段酶解：
1)将预处理后的羽毛粉置于去离子水中，去离子水的量为羽毛粉质量的6倍，得到羽毛粉的混悬液，加入混合酶Ⅰ进行酶解，得到一次酶解液，酶解的具体条件为：酶解时的pH为7，酶解时间为8h,酶解温度为45℃，所述混合酶Ⅰ为角蛋白酶和风味蛋白酶，其质量比为3:1，加入混合酶Ⅰ的量为羽毛粉质量的0.3％；
2)在一次酶解液中再加入混合酶Ⅱ进行酶解，得到二次酶解液，酶解的具体条件为：酶解的pH为8，酶解时间为4h，酶解温度为55℃，所述混合酶Ⅱ为氨基肽酶和中性蛋白酶，其质量比为2:1，加入混合酶Ⅱ的量为羽毛粉质量的0.2％；
3)将二次酶解液煮沸灭酶、离心、过滤残渣，将酶解液烘干，得到羽毛粉的酶解产物；
S3：金属螯合：
将所得羽毛粉的酶解产物加入到去离子水中，去离子水的质量为羽毛粉酶解产物的3倍，再加入硫酸铜，加入的硫酸铜与羽毛粉的酶解产物的质量比为1:3，在pH为8,温度为65℃的条件下搅拌20min，离心、浓缩、干燥，制得金属螯合肽。
实施例2、一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法
一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法，包括以下步骤：
S1:羽毛的预处理：将鸭毛粉碎，置于pH为9的氢氧化钠水溶液中，加热至100℃，恒温50min，并同时用微波辅助加热过程，所述微波的功率为400W，过滤，加去离子水混合后喷雾干燥，得到预处理后的羽毛粉；
S2:分段酶解：
1)将预处理后的羽毛粉置于去离子水中，去离子水的量为羽毛粉质量的6倍，得到羽毛粉的混悬液，加入混合酶Ⅰ进行酶解，得到一次酶解液，酶解的具体条件为：酶解的pH为8，酶解时间为10h,酶解温度为60℃，所述混合酶Ⅰ为角蛋白酶和风味蛋白酶，其质量比为5:1，加入混合酶Ⅰ的量为羽毛粉质量的0.7％；
2)在一次酶解液中再加入混合酶Ⅱ进行酶解，得到二次酶解液，酶解的具体条件为：酶解的pH为10，酶解时间为6h，酶解温度为60℃，所述混合酶Ⅱ为氨基肽酶和中性蛋白酶，其质量比为5:1，加入混合酶Ⅱ的量为羽毛粉质量的0.5％；
3)将二次酶解液煮沸灭酶、离心、过滤残渣，将酶解液烘干，得到羽毛粉的酶解产物；
S3：金属螯合：
将所得羽毛粉的酶解产物加入到去离子水中，去离子水的质量为羽毛粉酶解产物的3倍，再加入硫酸亚铁，加入的硫酸亚铁与羽毛粉的酶解产物的质量比为1:3，在pH为8,温度为65℃的条件下搅拌20min，离心、浓缩、干燥，制得金属螯合肽。
实施例3、一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法
一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法，包括以下步骤：
S1:羽毛的预处理：将鸭毛粉碎，置于pH为8的氢氧化钠水溶液中，加热至90℃，恒温40min，并同时用微波辅助加热过程，所述微波的功率为300W，过滤，加去离子水混合后喷雾干燥，得到预处理后的羽毛粉；
S2:分段酶解：
1)将预处理后的羽毛粉置于去离子水中，去离子水的量为羽毛粉质量的6倍，得到羽毛粉的混悬液，加入混合酶Ⅰ进行酶解，得到一次酶解液，酶解的具体条件为：酶解的pH为7，酶解时间为10h,酶解温度为55℃，所述混合酶Ⅰ为角蛋白酶和风味蛋白酶，其质量比为4:1，加入混合酶Ⅰ的量为羽毛粉质量的0.6％；
2)在一次酶解液中再加入混合酶Ⅱ进行酶解，得到二次酶解液，酶解的具体条件为：酶解的pH为9，酶解时间为5h，酶解温度为60℃，所述混合酶Ⅱ为氨基肽酶和中性蛋白酶，其质量比为4:1，加入混合酶Ⅱ的量为羽毛粉质量的0.4％；
3)将二次酶解液煮沸灭酶、离心、过滤残渣，将酶解液烘干，得到羽毛粉的酶解产物；
S3：金属螯合：
将所得羽毛粉的酶解产物加入到去离子水中，去离子水的质量为羽毛粉酶解产物的3倍，再加入硫酸锌，加入的硫酸锌与羽毛粉的酶解产物的质量比为1:3，在pH为8,温度为65℃的条件下搅拌20min，离心、浓缩、干燥，制得金属螯合肽。
对比例1、一种酶解羽毛粉的方法
一种酶解羽毛粉的方法，包括以下步骤：
S1:羽毛的预处理：将鸭毛粉碎，得到预处理后的羽毛粉；
S2:分段酶解：
1)将预处理后的羽毛粉置于去离子水中，去离子水的量为羽毛粉质量的6倍，得到羽毛粉的混悬液，加入混合酶Ⅰ进行酶解，得到一次酶解液，酶解的具体条件为：酶解的pH为7，酶解时间为10h,酶解温度为55℃，所述混合酶Ⅰ为角蛋白酶和风味蛋白酶，其质量比为4:1，加入混合酶Ⅰ的量为羽毛粉质量的0.6％；
2)在一次酶解液中再加入混合酶Ⅱ进行酶解，得到二次酶解液，酶解的具体条件为：酶解的pH为9，酶解时间为5h，酶解温度为60℃，所述混合酶Ⅱ为氨基肽酶和中性蛋白酶，其质量比为4:1，加入混合酶Ⅱ的量为羽毛粉质量的0.4％；
3)将二次酶解液煮沸灭酶、离心、过滤残渣，将酶解液烘干，得到羽毛粉的酶解产物。
本对比例与实施例3类似，不同之处在于，本对比例仅对羽毛进行了粉碎处理，没有将羽毛碱性条件下加热及微波处理。
对比例2、一种酶解羽毛粉的方法
一种酶解羽毛粉的方法，包括以下步骤：
S1:羽毛的预处理：将鸭毛粉碎，置于pH为8的氢氧化钠水溶液中，加热至90℃，恒温40min，并同时用微波辅助加热过程，所述微波的功率为300W，过滤，加去离子水混合后喷雾干燥，得到预处理后的羽毛粉；
S2:酶解：
1)将预处理后的羽毛粉置于去离子水中，去离子水的量为羽毛粉质量的6倍，得到羽毛粉的混悬液，加入混合酶Ⅰ进行酶解，得到一次酶解液，酶解的具体条件为：酶解的pH为7，酶解时间为15h,酶解温度为55℃，所述混合酶Ⅰ为角蛋白酶和风味蛋白酶，其质量比为4:1，加入混合酶Ⅰ的量为羽毛粉质量的0.6％；
2)将一次酶解液煮沸灭酶、离心、过滤残渣，将酶解液烘干，得到羽毛粉的酶解产物。
本对比例与实施例3类似，不同之处在于，本对比例仅对预处理后的羽毛粉用混合酶Ⅰ进行酶解。
实验1、小肽的含量测定
实验对象：实施例1-3和对比例1-2得到的羽毛粉的酶解产物。
实验方法：取酶解产物0.5g，加入10mL质量分数为10％的三氯乙酸，震荡30min，转速为160r/min，震荡后离心，离心的转速为4000r/min，取上清液，随后用lorry法测定蛋白质总量。
实验结果：如表1所示。
表1：小肽的含量测定
测试项目 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
小肽的含量(质量比) 21.6％ 24.2％ 25.7％ 14.2％ 17.8％
由表1可知，本发明提供的方法得到的羽毛粉的酶解产物，小肽和含量均在21％以上，相较于对比例1-2效果明显，而对比例1没有经过预处理，对比例2仅用混合酶Ⅰ进行酶解，都没能取得较好的效果，说明了本发明中发明方案的必要性。
实验2、金属螯合肽的螯合率测试
实验对象：实施例1-3制得的金属螯合肽。
实验方法：从制得的金属螯合肽中随机选取3份作为测试样品，通过原子吸收分光光度法测得相应金属总含量和螯合肽金属的含量，求得螯合率，并得到该实施例的平均螯合率。
实验结果：如表2所示。
表2：金属螯合肽的螯合率测试
测试项目 实施例1(铜) 实施例2(铁) 实施例3(锌)
平均螯合率 95％ 97％ 98％
由表2可知，本发明制得的金属螯合肽具有较高的螯合率，制得的小肽与铜元素、铁元素或锌元素螯合反应，均取得了较好的效果，螯合率均在95％以上。
本发明以禽类羽毛为原材料制备金属螯合肽，先通过预处理的方式，包括碱性条件下加热并进行微波辅助，有效改变了羽毛蛋白的分子结构，使之处于易于酶解的状态，再通过混合酶Ⅰ和混合酶Ⅱ逐步酶解，保证了羽毛的充分酶解，所得酶解产物中小肽含量最高可为25.7％，最后再与金属盐螯合，螯合率均在95％以上，最终能够获得高产量的金属螯合肽，整个流程操作简单，所用材料价格低廉且易于获得，实用性强，为制备金属螯合肽提供了新思路。

Claims (5)

1.一种用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:羽毛的预处理：将羽毛粉碎，置于pH为7-9的碱溶液中，加热，并同时用微波辅助加热过程，过滤，加去离子水混合后喷雾干燥，得到预处理后的羽毛粉；
S2:分段酶解：
1)将预处理后的羽毛粉置于去离子水中，得到羽毛粉的混悬液，加入混合酶Ⅰ进行酶解，加入混合酶Ⅰ的量为羽毛粉质量的0.3-0.7％，得到一次酶解液；
2)在一次酶解液中再加入混合酶Ⅱ进行酶解，加入混合酶Ⅱ的量为羽毛粉质量的0.2-0.5％，得到二次酶解液；
3)将二次酶解液煮沸灭酶、离心、过滤残渣，将酶解液烘干，得到羽毛粉的酶解产物；
S3：金属螯合：
将所得羽毛粉的酶解产物加入到去离子水中，再加入金属盐，在pH为8,温度为65℃的条件下搅拌，离心、浓缩、干燥，制得金属螯合肽；
所述步骤S1所述微波的功率为300-400W；
所述步骤S2所述混合酶Ⅰ为角蛋白酶和风味蛋白酶，其质量比为3-5:1；
所述步骤S2所述混合酶Ⅱ为氨基肽酶和中性蛋白酶，其质量比为2-5:1。
2.如权利要求1所述用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法，其特征在于，所述步骤S1所述加热的具体条件为：加热至85-100℃，恒温30-50min。
3.如权利要求1所述用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法，其特征在于，所述步骤S2加入混合酶Ⅰ进行酶解的具体条件为：酶解的pH为7-8，酶解时间为8-10h,酶解温度为45-60℃。
4.如权利要求1所述用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法，其特征在于，所述步骤S2加入混合酶Ⅱ进行酶解的具体条件为：酶解的pH为8-10，酶解时间为4-6h，酶解温度为55-60℃。
5.如权利要求1所述用禽类羽毛制备金属螯合肽的方法，其特征在于，所述步骤S3所述金属盐包括硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁中的一种或多种。
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GR01 Patent grant
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