CN113444143B - 一种驼骨抗氧化多肽及其制备方法和应用 - Google Patents
一种驼骨抗氧化多肽及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种驼骨抗氧化多肽，所述驼骨抗氧化多肽的重均分子量为500‑6000g/mol，疏水性氨基酸含量为40‑70％。本发明提供的驼骨抗氧化多肽的分子量低，疏水性氨基酸含量高，具有良好的抗氧化活性，其DPPH自由基清除活性≥30％、Fe2+螯合活性≥90％。同时，本发明提供的上述驼骨抗氧化多肽的制备方法以新鲜驼骨为原料，通过温和的酶解工艺，可得到多肽纯度高、透明度好的多肽，其蛋白质含量≥85％，脂肪含量≤0.4％，灰分含量≤2％。且该方法简单可行，有利于实现大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及功能性蛋白质多肽技术领域。更具体地，涉及一种驼骨抗氧化多肽及其制备方法和应用。
背景技术
骆驼是我国西北和华北荒漠、半荒漠地区的重要畜种资源之一，据2016年中国畜牧业协会骆驼普查不完全统计，全国约有骆驼36.87万峰，主要分布在新疆、内蒙古、甘肃和青海。我国是世界上双峰驼的主要分布区域之一。
驼骨富含Ⅰ型胶原，单头成年骆驼的骨重在50kg以上，是十分优质的胶原来源。目前，国内外对于骆驼骨的研究利用很少，一则是由于驼骨资源主要分布在相对偏远和不发达地区，二来是相对牛骨和猪骨，驼骨的数量相对少些。但特殊的生存环境，赋予了驼乳和驼血具有丰富的生物活性，抗氧化、抗菌、调节免疫等。利用驼骨为原料制备驼骨胶原多肽不但能够有效的解决废弃驼骨产生的环境污染，而且有效的利用了驼骨优异的生物学特性，为国民经济服务。
酶水解是从胶原获取多肽最为高效及温和的方法。研究表明，酶水解动物胶原产生的肽具有抗疲劳、调节免疫、促骨生长、抑制癌细胞增殖、抗菌、抗氧化等生物活性。CN201110317299公开了一种以牲畜骨为原料制备低分子量胶原蛋白的方法，采用胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，中性蛋白酶降解猪、牛、羊骨胶原制备低分子量胶原蛋白肽。CN 201610149640.8公开了一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法，以牛骨、猪骨或者鱼原料，采用胰酶和木瓜蛋白酶降解并经过纯化，制备得到了对卵巢癌细胞和前列腺癌细胞具有抑制增殖活性的胶原蛋白肽。
氧化是引起人体疾病、衰老的主要原因之一。炎症诱导的氧化应激和脂质过氧化可引起各种疾病，如癌症、多发性硬化症和心血管疾病等。食品中脂质和蛋白的氧化不仅导致营养的丧失和风味的改变，而且可能产生有毒物质。天然的具有抗氧化活性的多肽在医药、食品、化妆品领域具有十分广泛的应用前景。
现有技术中公开了由多种原料制备得到抗氧化多肽的方法，如CN201910148851.3公开了一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，以鱼鳞为原料，对鱼鳞进行脱钙，再采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶对鱼鳞进行二步酶解，获得鱼鳞明胶高抗氧化性肽；制得的抗氧化肽的·OH清除能力高于二丁基羟基甲苯(BHT)，有良好的抗氧化性。CN201510140167.2公开了一种猪骨抗氧化肽的制备方法，包括制备猪骨浆、酶解(Alcalase蛋白酶)、灭酶冷却，分离纯化等步骤；CN201810162657.6公开了一种具有缓解疲劳和抗氧化功能的牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法；CN201811405330.3公开了一种酶解猪皮制备抗氧化肽的方法；CN201510399286.X公开了一种脱脂蟹壳抗氧化肽的用途。
骆驼特殊的生存环境赋予其驼骨多肽特殊的抗氧化能力，且对驼骨的有效利用可解决废弃驼骨带来的环境污染，但是现有技术却鲜有利用驼骨制备抗氧化多肽的报道，因此，有必要提供一种利用驼骨制备抗氧化多肽的方法。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种驼骨抗氧化多肽，该抗氧化多肽具有较强的清除DPPH自由基的能力以及Fe2+螯合活性，并且含有丰富的疏水性氨基酸。
本发明的第二个目的在于提供一种驼骨抗氧化多肽的制备方法，通过进行高温蒸煮脱脂、浸酸脱钙、酶水解、以及阴阳离子交换树脂过滤等步骤，可以短时间、高效率的制备出驼骨抗氧化多肽，并且在很大程度上提高了其纯度。
本发明第三个目的在于提供一种驼骨抗氧化多肽在制作保健品、化妆品、食品中的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供一种驼骨抗氧化多肽，所述驼骨抗氧化多肽的重均分子量为500-6000g/mol，疏水性氨基酸含量为40-70％。
可选地，所述驼骨抗氧化多肽中含有6.0-7.0％的天冬氨酸、3.0-4.0％的苏氨酸，4.0-5.0％的丝氨酸，11.0-12.0％的谷氨酸，21.0-22.0％的甘氨酸，8.0-9.0％的丙氨酸，1.0-2.0％的胱氨酸，3.0-4.0％的缬氨酸，2.0-3.0％的异亮氨酸，3.0-4.0％的亮氨酸，1.0-2.0％的酪氨酸，2.0-3.0％的苯丙氨酸，1.0-2.0％的组氨酸，4.0-5.0％的赖氨酸，7.0-8.0％的精氨酸，14.0-15.0％的脯氨酸。
本发明提供的驼骨抗氧化多肽中的疏水性氨基酸如甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸等的含量较高，有利于提高其抗氧化活性，该驼骨抗氧化多肽的DPPH自由基清除活性≥30％，Fe2+螯合活性≥90％。
第二方面，本发明提供一种驼骨抗氧化多肽的制备方法，包括以下步骤：
1)将新鲜驼骨在高温下进行蒸煮、除油脂、破碎，再进行若干次蒸煮，烘干得尺寸小于20mm的骨粒；然后将骨粒粉碎为粒度为0.5-1000μm的骨粉；
2)将骨粉浸入pH为0.5-4的稀酸溶液中，保持1-12h；离心分离，酸洗至pH为5.0-7.0，得骨素；加水蒸煮10-20min，沉降，除去上层清液及表层油脂，得脱脂骨素；
3)将脱脂骨素分散在水中，然后用稀酸或稀碱溶液调节pH至5.0-8.0，加热至45-70℃，加入蛋白酶，得酶解浆料，酶解30min-8h；将酶解浆料加热至90-95℃，保持5-15min，灭活蛋白酶，得多肽粗产物；
4)将多肽粗产物经真空抽滤，得粗滤液；然后经阴、阳离子交换树脂进行离子交换，得精滤液；然后在精滤液中加入食品级活性炭，搅拌后在45-70℃下保持5min-2h，再次过滤，得多肽原液；干燥，得驼骨抗氧化多肽。
本发明提供的驼骨抗氧化多肽的制备过程如图1所示。
步骤1)是将新鲜驼骨蒸煮脱脂、破碎、烘干和粉碎的过程。可选地，具体操作可以为将新鲜驼骨剔除筋、肉、骨髓等非骨骼组分，置于反应釜中，加入2-5倍重量水，加热至80-100℃，蒸煮时间10-60min，除去油脂；剔除驼骨表面的肉、筋及骨髓等非骨残留物，然后用破碎机将大块驼骨破碎成小于20mm骨粒；将骨粒加入80-100℃水中，保持5-60min，用筛网分离得到一次蒸煮后骨粒；将一次蒸煮骨粒加入80-100℃水中，保持5-60min，用筛网分离得到二次蒸煮后骨粒；将二次蒸煮后骨粒在烘箱中80-150℃加热烘干，得干燥的驼骨骨粒，水分为4-10％，残油率4-6％。然后将骨粒粉碎为粒度为0.5-1000μm的骨粉。
步骤2)是骨粉浸酸脱钙以及蒸煮进一步脱脂过程。酸中浸泡过程可以有效脱出驼骨中的钙等无机盐。可选地，将骨粉浸入的稀酸溶液选自稀盐酸、稀硫酸或稀磷酸。进一步加水蒸煮除去油脂，可选地，加水蒸煮的水量是骨素重量的2-5倍，蒸煮温度为90-100℃。
步骤3)包括调至设定pH及温度、酶解以及杀酶过程。适宜的pH及温度可以使蛋白酶保持高活性，可选地，蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶中的一种或几种组合；进一步地，蛋白酶的添加量为400U/g～8000U/g。酶解完成后，高温灭活蛋白酶。
可选地，步骤3)中用于调节pH的稀酸溶液选自稀盐酸、稀硫酸或稀磷酸中的一种；所述稀碱溶液选自氢氧化钠水溶液、氢氧化钙水溶液、碳酸钠水溶液、氢氧化铵水溶液等中的一种。
步骤4)是多肽粗产物的纯化过程，包括棉饼粗过滤、树脂脱盐、活性炭过滤以及干燥过程。其中，所述阴、阳离子交换树脂进行离子交换过程可以在阴阳离子交换树脂柱中进行，也可以直接将阴阳离子交换树脂加入粗滤液中进行；其中，加入阴阳离子交换树脂后的粗滤液的电导率不超过200μs。
优选地，所述阳离子交换树脂为001×7型强酸性阳离子交换树脂，阴离子交换树脂为201×7型强碱性阴离子交换树脂。
可选地，步骤4)中所述食品级活性炭的加入量为精滤液重量的0.5-5‰；所述干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
上述制备过程以新鲜驼骨为原料，经过高温蒸煮脱脂、浸酸脱钙的前处理工艺得到脱脂驼骨粉以及驼骨骨素；接着通过酶水解工艺以及离子交换树脂进一步的精滤，可以更温和、操作简易、高效的制备出纯度更高的驼骨胶原多肽，并提高其后续再进一步分离纯化工作的效率；该制备过程简单、高效，可实现大规模工业化生产。所制备的驼骨胶原多肽具有高蛋白、低脂肪、低灰分、分子量低，透明度好的优点，蛋白质含量≥85％，脂肪含量≤0.4％，灰分含量≤2％。
本发明第三个方面提供了上述驼骨抗氧化多肽的应用，其具有的良好抗氧化活性，使其在保健品、化妆品和食品领域具有广泛的应用潜力。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的驼骨抗氧化多肽的分子量低，疏水性氨基酸含量高，具有良好的抗氧化活性，其DPPH自由基清除活性≥30％、Fe2+螯合活性≥90％。同时，本发明提供的上述驼骨抗氧化多肽的制备方法以新鲜驼骨为原料，通过温和的酶解工艺，可得到多肽纯度高、透明度好的多肽，其蛋白质含量≥85％，脂肪含量≤0.4％，灰分含量≤2％。且该方法简单可行，有利于实现大规模工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出本发明以驼骨为原料由酶解法制被驼骨抗氧化多肽的方法工艺流程示意图。
图2示出实施例1中由中性蛋白酶水解得到的驼骨抗氧化多肽的分子量分布图。
图3示出实施例2中由碱性蛋白酶水解得到的驼骨抗氧化多肽的分子量分布图。
图4示出实施例3中由胰蛋白酶水解得到的驼骨抗氧化多肽的分子量分布图。
图5示出实施例4中由中性蛋白酶水解得到的驼骨抗氧化多肽的分子量分布图。
图6示出驼骨抗氧化多肽DPPH清除活性(其中NCCP代表实施例1中性蛋白酶水解的驼骨抗氧化多肽，TCCP代表实施例3中胰蛋白酶水解的驼骨抗氧化多肽，ACCP代表实施例2中碱性蛋白酶水解的驼骨抗氧化多肽，BCP代表市售的牛骨胶原肽，多肽浓度均为10mg/mL)。
图7示出实施例4中性酶水解得到的驼骨抗氧化多肽的氨基酸组成图
图8示出实施例4中性酶水解得到的驼骨抗氧化多肽在10.0mg/mL浓度下的Fe2+螯合活性与DPPH自由基清除活性。
具体实施方式
为使本发明的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
中性蛋白酶水解得到驼骨抗氧化多肽
(1)将10Kg新鲜驼骨剔除筋、肉、骨髓等非骨骼组分，置于反应釜中，加入5倍重量水，加热至100℃，蒸煮时间20min，撇掉上层油脂；将大块驼骨捞出，剔除肉、筋及骨髓等非骨残留物，用破碎机将整块驼骨破碎成小于20mm骨粒；将骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到一次蒸煮后骨粒；将一次蒸煮骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到二次蒸煮后骨粒；将二次蒸煮后骨粒在烘箱中150℃加热烘干60min，得干燥的驼骨骨粒，水分为4％，残油率3.2％；将得到的驼骨骨粒用粉碎机粉碎得到驼骨粉，粒度为0.5～1000μm；
(2)取步骤(1)得到的1kg驼骨粉用盐酸处理，以脱除骨中的无机盐，通过控制浆料的pH调节无机酸加入量，浆料的pH控制为3.0，浸酸时间保持为4h；用离心机分离浸酸浆料混合物，骨素水洗至pH5.35；取200g驼骨骨素，加入3倍重量的水，加热至90℃，保持20min，沉降后，除去上层清液及表层油脂，得到脱脂骨素；
(3)向步骤(2)得到的脱脂骨素中加入相当于干骨粉重量3.5倍的水，并进行搅拌，加入稀碱水溶液调节所得浆料的pH值为6.0，加热反应浆料pH至50℃，向浆料中加入中性蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量为1400U/g，酶解时间4h，得到酶解浆料；将酶解浆料加热至90～95℃，灭活蛋白酶，得到驼骨多肽粗产物；
(4)将步骤(3)得到的驼骨多肽粗产物采用棉饼作为过滤介质，真空抽滤得到粗滤液；将粗滤液通过阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，阳离子交换树脂为001×7型，阴离子交换树脂可为201×7型，得到精滤液；向精滤液中加入食品级活性炭，活性炭的加入量为精滤液重量的5‰，50℃，搅拌30min，然后用棉饼过滤，得到驼骨多肽原液；将驼骨多肽原液冷冻干燥，得到驼骨抗氧化多肽，其灰分0.68％，重均分子量为2199g/mol，10000g/mol以下组分占比98.3％(如图2所示)，DPPH自由基清除活性为47.47％(如图6所示)。
实施例2
碱性蛋白酶水解得到驼骨抗氧化多肽
(1)将10Kg新鲜驼骨剔除筋、肉、骨髓等非骨骼组分，置于反应釜中，加入5倍重量水，加热至100℃，蒸煮时间20min，撇掉上层油脂；将大块驼骨捞出，剔除肉、筋及骨髓等非骨残留物，用破碎机将整块驼骨破碎成小于20mm骨粒；将骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到一次蒸煮后骨粒；将一次蒸煮骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到二次蒸煮后骨粒；将二次蒸煮后骨粒在烘箱中150℃加热烘干60min，得干燥的驼骨骨粒，水分为4％，残油率3.2％；将得到的驼骨骨粒用粉碎机粉碎得到驼骨粉，粒度为0.5～1000μm；
(2)取步骤(1)得到的1kg驼骨粉用盐酸处理，以脱除骨中的无机盐，通过控制浆料的pH调节无机酸加入量，浆料的pH控制为3.0，浸酸时间保持为4h；用离心机分离浸酸浆料混合物，骨素水洗至pH6.02；取200g驼骨骨素，加入3倍重量的水，加热至90℃，保持20min，沉降后，除去上层清液及表层油脂，得到脱脂骨素；
(3)向步骤(2)得到的脱脂骨素中加入相当于干骨粉重量3.5倍的水，并进行搅拌，加入稀碱水溶液调节所得浆料的pH值为8.0，加热反应浆料pH至50℃，向浆料中加入碱性蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量为1400U/g，酶解时间4h，得到酶解浆料；将酶解浆料加热至90～95℃，灭活蛋白酶，得到驼骨多肽粗产物；
(4)将步骤(3)得到的驼骨多肽粗产物采用棉饼作为过滤介质，真空抽滤得到粗滤液；将粗滤液通过阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，阳离子交换树脂为001×7型，阴离子交换树脂可为201×7型，得到精滤液；向精滤液中加入食品级活性炭，活性炭的加入量为精滤液重量的5‰，50℃，搅拌30min，然后用棉饼过滤，得到驼骨多肽原液；将驼骨多肽原液冷冻干燥，得到驼骨抗氧化多肽，其灰分含量为1.02％，重均分子量为1010g/mol，10000g/mol以下组分占比为100％(如图3所示)，DPPH自由基清除活性为30.86％(如图6所示)。
实施例3
胰蛋白酶水解得到驼骨抗氧化多肽
(1)将10Kg新鲜驼骨剔除筋、肉、骨髓等非骨骼组分，置于反应釜中，加入5倍重量水，加热至100℃，蒸煮时间20min，撇掉上层油脂；将大块驼骨捞出，剔除肉、筋及骨髓等非骨残留物，用破碎机将整块驼骨破碎成小于20mm骨粒；将骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到一次蒸煮后骨粒；将一次蒸煮骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到二次蒸煮后骨粒；将二次蒸煮后骨粒在烘箱中150℃加热烘干60min，得干燥的驼骨骨粒，水分为4％，残油率3.2％；将得到的驼骨骨粒用粉碎机粉碎得到驼骨粉，粒度为0.5～1000μm；
(2)取步骤(1)得到的1kg驼骨粉用盐酸处理，以脱除骨中的无机盐，通过控制浆料的pH调节无机酸加入量，浆料的pH控制为3.0，浸酸时间保持为4h；用离心机分离浸酸浆料混合物，骨素水洗至pH5.59；取200g驼骨骨素，加入3倍重量的水，加热至90℃，保持20min，沉降后，除去上层清液及表层油脂，得到脱脂骨素；
(3)向步骤(2)得到的脱脂骨素中加入相当于干骨粉重量3.5倍的水，并进行搅拌，加入稀碱水溶液调节所得浆料的pH值为7.5，加热反应浆料pH至50℃，向浆料中加入胰蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量为1400U/g，酶解时间4h，得到酶解浆料；将酶解浆料加热至90～95℃，灭活蛋白酶，得到驼骨多肽粗产物；
(4)将步骤(3)得到的驼骨多肽粗产物采用棉饼作为过滤介质，真空抽滤得到粗滤液；将粗滤液通过阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，阳离子交换树脂为001×7型，阴离子交换树脂可为201×7型，得到精滤液；向精滤液中加入食品级活性炭，活性炭的加入量为精滤液重量的5‰，50℃，搅拌30min，然后用棉饼过滤，得到驼骨多肽原液；将驼骨多肽原液冷冻干燥，得到驼骨抗氧化多肽，其灰分0.84％，重均分子量为1634g/mol，10000g/mol以下组分占99.5％(如图4所示)，DPPH自由基清除活性为39.11％(如图6所示)。
实施例4
中性蛋白酶水解得到驼骨抗氧化多肽
(1)将10Kg新鲜驼骨剔除筋、肉、骨髓等非骨骼组分，置于反应釜中，加入5倍重量水，加热至100℃，蒸煮时间20min，撇掉上层油脂；将大块驼骨捞出，剔除肉、筋及骨髓等非骨残留物，用破碎机将整块驼骨破碎成小于20mm骨粒；将骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到一次蒸煮后骨粒；将一次蒸煮骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到二次蒸煮后骨粒；将二次蒸煮后骨粒在烘箱中150℃加热烘干60min，得干燥的驼骨骨粒，水分为4％，残油率3.2％；将得到的驼骨骨粒用粉碎机粉碎得到驼骨粉，粒度为0.5～1000μm；
(2)取步骤(1)得到的1kg驼骨粉用盐酸处理，以脱除骨中的无机盐，通过控制浆料的pH调节无机酸加入量，浆料的pH控制为3.0，浸酸时间保持为4h；用离心机分离浸酸浆料混合物，骨素水洗至pH6.15；取200g驼骨骨素，加入3倍重量的水，加热至90℃，保持20min，沉降后，除去上层清液及表层油脂，得到脱脂骨素；
(3)向步骤(2)得到的脱脂骨素中加入相当于干骨粉重量3.5倍的水，并进行搅拌，加入稀碱水溶液调节所得浆料的pH值为6.0，加热反应浆料pH至50℃，向浆料中加入中性蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量为1200U/g，酶解时间4h，得到酶解浆料；将酶解浆料加热至90～95℃，灭活蛋白酶，得到驼骨多肽粗产物；
(4)将步骤(3)得到的驼骨多肽粗产物采用棉饼作为过滤介质，真空抽滤得到粗滤液；将粗滤液通过阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，阳离子交换树脂为001×7型，阴离子交换树脂可为201×7型，得到精滤液；向精滤液中加入食品级活性炭，活性炭的加入量为精滤液重量的5‰，50℃，搅拌30min，然后用棉饼过滤，得到驼骨多肽原液；将驼骨多肽原液冷冻干燥，得到驼骨抗氧化多肽，灰分0.43％，重均分子量为1921g/mol，10000g/mol以下组分占比99.1％(如图5所示)，DPPH自由基清除活性为54.82％、Fe2+螯合活性为91.68％(如图8所示)。
实施例5
中性蛋白酶水解得到驼骨抗氧化多肽
(1)将10Kg新鲜驼骨剔除筋、肉、骨髓等非骨骼组分，置于反应釜中，加入5倍重量水，加热至100℃，蒸煮时间20min，撇掉上层油脂；将大块驼骨捞出，剔除肉、筋及骨髓等非骨残留物，用破碎机将整块驼骨破碎成小于20mm骨粒；将骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到一次蒸煮后骨粒；将一次蒸煮骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到二次蒸煮后骨粒；将二次蒸煮后骨粒在烘箱中150℃加热烘干60min，得干燥的驼骨骨粒，水分为4％，残油率3.2％；将得到的驼骨骨粒用粉碎机粉碎得到驼骨粉，粒度为0.5～1000μm；
(2)取步骤(1)得到的1kg驼骨粉用盐酸处理，以脱除骨中的无机盐，通过控制浆料的pH调节无机酸加入量，浆料的pH控制为3.0，浸酸时间保持为4h；用离心机分离浸酸浆料混合物，骨素水洗至pH5.46；取200g驼骨骨素，加入3倍重量的水，加热至90℃，保持20min，沉降后，除去上层清液及表层油脂，得到脱脂骨素；
(3)向步骤(2)得到的脱脂骨素中加入相当于干骨粉重量3.0倍的水，并进行搅拌，加入稀碱水溶液调节所得浆料的pH值为7.0，加热反应浆料pH至45℃，向浆料中加入中性蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量为600U/g，酶解时间4h，得到酶解浆料；将酶解浆料加热至90～95℃，灭活蛋白酶，得到驼骨多肽粗产物；
(4)将步骤(3)得到的驼骨多肽粗产物采用棉饼作为过滤介质，真空抽滤得到粗滤液；将粗滤液通过阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，阳离子交换树脂为001×7型，阴离子交换树脂可为201×7型，得到精滤液；向精滤液中加入食品级活性炭，活性炭的加入量为精滤液重量的5‰，50℃，搅拌30min，然后用棉饼过滤，得到驼骨多肽原液；将驼骨多肽原液冷冻干燥，得到驼骨抗氧化多肽，其DPPH自由基清除活性为43.76％。
实施例6
中性蛋白酶水解得到驼骨抗氧化多肽
(1)将10Kg新鲜驼骨剔除筋、肉、骨髓等非骨骼组分，置于反应釜中，加入5倍重量水，加热至100℃，蒸煮时间20min，撇掉上层油脂；将大块驼骨捞出，剔除肉、筋及骨髓等非骨残留物，用破碎机将整块驼骨破碎成小于20mm骨粒；将骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到一次蒸煮后骨粒；将一次蒸煮骨粒加入100℃水中，保持15min，用筛网分离得到二次蒸煮后骨粒；将二次蒸煮后骨粒在烘箱中150℃加热烘干60min，得干燥的驼骨骨粒，水分为4％，残油率3.2％；将得到的驼骨骨粒用粉碎机粉碎得到驼骨粉，粒度为0.5～1000μm；
(2)取步骤(1)得到的1kg驼骨粉用盐酸处理，以脱除骨中的无机盐，通过控制浆料的pH调节无机酸加入量，浆料的pH控制为3.0，浸酸时间保持为4h；用离心机分离浸酸浆料混合物，骨素水洗至pH5.23；取200g驼骨骨素，加入3倍重量的水，加热至90℃，保持20min，沉降后，除去上层清液及表层油脂，得到脱脂骨素；
(3)向步骤(2)得到的脱脂骨素中加入相当于干骨粉重量3.0倍的水，并进行搅拌，加入稀碱水溶液调节所得浆料的pH值为6.5，加热反应浆料pH至50℃，向浆料中加入中性蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量为1600U/g，酶解时间5h，得到酶解浆料；将酶解浆料加热至90～95℃，灭活蛋白酶，得到驼骨多肽粗产物；
(4)将步骤(3)得到的驼骨多肽粗产物采用棉饼作为过滤介质，真空抽滤得到粗滤液；将粗滤液通过阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，阳离子交换树脂为001×7型，阴离子交换树脂可为201×7型，得到精滤液；向精滤液中加入食品级活性炭，活性炭的加入量为精滤液重量的5‰，50℃，搅拌30min，然后用棉饼过滤，得到驼骨多肽原液；将驼骨多肽原液冷冻干燥，得到驼骨抗氧化多肽，其DPPH自由基清除活性为53.56％。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (9)
1.一种驼骨抗氧化多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将新鲜驼骨在高温下进行蒸煮、除油脂、破碎，再进行若干次蒸煮，烘干得尺寸小于20mm的骨粒；然后将骨粒粉碎为粒度为0.5-1000μm的骨粉；
所述的蒸煮是在80-100℃下进行的，每次蒸煮时间为5-60min；所述烘干是在80-150℃下进行的；
2)将骨粉浸入pH为0.5-4的稀酸溶液中，保持1-12h；离心分离，水洗至pH为5.0-7.0，得骨素；加水蒸煮10-20min，沉降，除去上层清液及表层油脂，得脱脂骨素；
3)将脱脂骨素分散在水中，然后用稀酸或稀碱溶液调节pH至5.0-8.0，加热至45-70℃，加入蛋白酶，得酶解浆料，酶解30min-8h；将酶解浆料加热至90-95℃，保持5-15min，灭活蛋白酶，得多肽粗产物；所述蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶中的一种或几种组合，所述蛋白酶的添加量为400U/g～8000U/g；
4)将多肽粗产物经真空抽滤，得粗滤液；然后经阴、阳离子交换树脂进行离子交换，得精滤液；然后在精滤液中加入食品级活性炭，搅拌后在45-70℃下保持5min-2h，再次过滤，得多肽原液；干燥，得驼骨抗氧化多肽；所述阳离子交换树脂为001×7型强酸性阳离子交换树脂，阴离子交换树脂为201×7型强碱性阴离子交换树脂；
所述驼骨抗氧化多肽的重均分子量为500-6000g/mol，疏水性氨基酸含量为40-70％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述驼骨抗氧化多肽中含有6.0-7.0％的天冬氨酸、3.0-4.0％的苏氨酸，4.0-5.0％的丝氨酸，11.0-12.0％的谷氨酸，21.0-22.0％的甘氨酸，8.0-9.0％的丙氨酸，1.0-2.0％的胱氨酸，3.0-4.0％的缬氨酸，2.0-3.0％的异亮氨酸，3.0-4.0％的亮氨酸，1.0-2.0％的酪氨酸，2.0-3.0％的苯丙氨酸，1.0-2.0％的组氨酸，4.0-5.0％的赖氨酸，7.0-8.0％的精氨酸，14.0-15.0％的脯氨酸。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述骨粒中的水分含量为4-10％，残油率为4-6％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中加水蒸煮的水量是骨素重量的2-5倍，蒸煮温度为90-100℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述阴、阳离子交换树脂进行离子交换过程在阴阳离子交换树脂柱中进行，或者直接将阴阳离子交换树脂加入粗滤液中进行；其中，加入阴阳离子交换树脂后的粗滤液的电导率不超过200μs。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中真空抽滤过程中所用的过滤介质为棉饼。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述食品级活性炭的加入量为精滤液重量的0.5-5‰；所述干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
8.一种如权利要求1-7任一所述制备方法制备的驼骨抗氧化多肽。
9.一种如权利要求8所述的驼骨抗氧化多肽在制作保健品、化妆品、食品中的应用。
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