CN112745833B - 一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：1、制备磁核Fe3O4；2、制备磁核Fe3O4@MPTS；3、制备磁性微球；4、制备稀土配合物；5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球。本发明所提供的一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，是以Fe3O4为磁核，在磁核的表面包覆聚合物，聚合物内部螯合通过硅层与磁核隔开的稀土配合物，从而共同结合而组成核壳式结构的纳米微球。本发明一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，具有工艺稳定性好、制备效率高和生产成本低等优势，且显著提高了纳米微球的磁响应性、荧光强度和产品稳定性，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料合成技术领域，具体涉及的是一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法。
背景技术
时间分辨荧光微球是荧光微球的一种，由于其具有宽stokes位移特性，因而广泛应用于免疫快速检测中，具有更高的灵敏度，在生物诊断中具有极高的应用价值。磁性纳米粒子作为一种十分重要的纳米材料，以其特有的磁响应特性，亦在MRI、生物诊断、基因工程、细胞分离、热疗和药物靶向等领域展现出突出的应用效果。因此，将时间分辨荧光微球与磁性纳米粒子结合，形成双功能的时间分辨荧光磁性纳米微球，无疑可以拓展纳米微球在生物领域的应用。
由于磁性荧光纳米微球具有潜在的广泛应用，一些研究者提出了共价连接法、物理吸附法和共聚法等制备磁性荧光纳米微球，这些磁性荧光纳米微球在1～4微米以上，具有时间分辨荧光特性的磁性纳米微球研究较少。Wang等人(Nanoscale 2014,6(19),11473-11478.)通过共价连接方式将磁球和稀土配合整合，制备出高荧光强度的时间分辨磁球，但是由于其稀土荧光复合物暴露在外表面，因此很容易受到外界环境的影响，难以应用于实际免疫检测中。于龙波等人申请了专利“一种磁性稀土荧光微球的制备方法和用途”(公开号 CN109030439A)，采用稀土离子和Fe离子共沉淀法制备磁性荧光复合物，再通过溶胀的方式将小磁核和稀土配合物渗透至制成的微球中，但是该方法采用的磁核小，磁响应性较弱，且在渗透后残余的小磁核难以处理，因而难以制备均一的高磁响应的荧光纳米微球。Handa 等人(J.Magn.Magn.Mater.2009,321(10),1364-1367.)采用乳液法包覆40nm的铁磁性纳米粒子作为磁核，磁饱和度达24.1emu/g，提高了其磁响应特性，但稀土配合物与磁核共掺杂在球内，磁核对荧光的吸收造成荧光强度显著降低。
以上这些研究取得了一定的研究结果，但存在制备工艺复杂、产品稳定性差、磁响应弱、荧光强度不够等问题，因而难以规模化生产，且难以达到应用的需求，所以市面上几乎难以见到成熟的时间分辨荧光磁性纳米微球产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，具有工艺稳定性好、制备效率高和生产成本低等优势，且显著提高了纳米微球的磁响应性、荧光强度和产品稳定性，因此具有广阔的应用前景。
为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，是先采用溶剂热法制备磁核Fe3O4，然后将所述磁核Fe3O4与硅烷偶联剂反应得到在所述磁核Fe3O4的表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@硅层，然后采用沉淀聚合法在所述磁核Fe3O4@硅层的表面包覆聚合物，形成具有核壳结构的磁性微球，最后利用溶胀剂将稀土配合物溶胀于所述磁性微球内，得到所述时间分辨荧光磁性纳米微球；所述溶胀剂为氯仿、二氯甲烷、甲苯、丙酮或四氢呋喃。
一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将4.32～6.49g六水合三氯化铁溶解于100～140mL乙二醇中，依次加入2.4～3.6g柠檬酸和9.84～17.72g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在180～220℃下反应6～12h，经过冷却、磁分离、洗净，得到粒径在175～250nm的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.5～0.7g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至50～100mL乙醇/水混合溶剂中，加入0.6～0.8g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 (MPTS)，在60～80℃下搅拌12～24h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.48～0.72g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至100～140 mL乙腈中，然后加入2.81～4.36g聚合物单体和0.0500～0.0872g引发剂，在60～80℃下反应12～24h，反应结束后，经过磁分离、洗净，得到聚合物包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.26～0.36g稀土盐溶解于5～10mL去离子水中，得到稀土盐水溶液，将1.2～1.6g的配合物分散至30mL无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，将稀土盐水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在 50～70℃下搅拌3～6h，洗净，得到稀土配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取0.5～2g步骤3制备的聚合物包覆的磁性微球分散至50～150 mL作为溶胀剂的有机溶剂中，加入100～150mg步骤4制备的稀土配合物，在室温下震荡1～5h，加入50～150mL去离子水，在20～80℃、真空条件下减压蒸馏去除有机溶剂，用0.1％NP-40清洗至上清液无荧光，即得到粒径在200～500nm的所述时间分辨荧光磁性纳米微球；
步骤5中，所述有机溶剂采用氯仿、二氯甲烷、甲苯、丙酮或四氢呋喃。
步骤1中，所述洗净是将产物依次用无水乙醇和去离子水洗涤多次。
步骤2中，所述乙醇/水混合溶剂的V乙醇/V水＝4：1。
步骤3中，所述聚合物单体为苯乙烯、二乙烯苯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸和丙烯酸中的两种或两种以上的混合，所述引发剂为偶氮二异丁腈，所述洗净是将产物用无水乙醇洗涤多次。
步骤4中，所述稀土盐为EuCl3，所述配合物为1,10-菲罗啉、2- 噻吩甲酰三氟丙酮、三正辛基氧膦、1,3-二苯基丙二酮和三苯基氧膦中的两种或两种以上的混合。
步骤4中，所述洗净是将产物用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次。
采用上述结构后，本发明一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，采用175～250nm的超顺磁性的Fe3O4作为中间磁核，在磁核外包覆聚合物作为壳层，大大提高磁饱和强度，但是由于磁核的强吸光性，倘若荧光物质与磁核直接接触很容易造成猝灭，降低荧光强度，因此采用溶胀法将稀土配合物溶胀于磁性微球外层，为了使稀土配合物不被磁核影响，进而导致荧光猝灭并且微球溶解，因此溶胀剂的选择尤为关键。根据不同有机试剂对磁性微球大小的影响，我们选择合适的有机溶剂作为溶胀剂，让稀土配合物溶胀在磁性微球的外层，且通过Fe3O4磁核外包覆的带有烯烃键的硅层作为隔离层，让荧光配合物无法直接接触Fe3O4磁核，从而大大增强荧光强度。因此，通过本发明的制备方法能够成功制备出一种同时具有时间分辨荧光特性和磁性的纳米微球。
本发明一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，具有以下优点：
1、制备方法简单：本发明的制备方法不同于传统繁琐的纳米微球的制备，原料成本低，操作简单，降低了批间差，适用于企业规模化制备；
2、通过硅烷偶联剂形成的硅层在Fe3O4磁核的表面修饰烯烃键，为下一步骤的聚合包覆做准备；
3、改善了磁核对荧光配合物荧光强度的影响：本发明制备得到的时间分辨荧光磁性纳米微球采取核壳结构，Fe3O4磁核位于最里层，并通过硅烷偶联剂形成的硅层与聚合物壳层隔开，聚合物壳层的内部溶胀有稀土配合物，可最大限度降低磁核对稀土配合物荧光强度的干扰，提高了其荧光强度，制备得到的纳米微球的磁饱和度在22～48 emu/g，荧光强度在1200～9200a.u；
4、提高了荧光稳定性：本发明稀土配合物完全地被包覆在聚合物壳层内，可避免在实际应用中缓冲液的磷酸根、EDTA、柠檬酸根等螯合基团产生的荧光淬灭效应；
5、工艺可控性提高：本发明采用沉淀法在磁核表面包覆聚合物壳层，无需添加表面活性剂等其它稳定剂，且能任意引入羧基、环氧基和氨基等功能基团，为后续生物分子的偶联提供方便。
因此，本发明提供一种时间分辨荧光磁性纳米微球制备方法，具有工艺稳定性好、制备效率高和生产成本低等优势，且显著提高了纳米微球的磁响应性、荧光强度和产品稳定性，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明中实施例九制备的时间分辨荧光磁性纳米微球的 SEM图。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
一、时间分辨荧光磁性纳米微球的制备
实施例1
一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将4.32g六水合三氯化铁溶解于100mL乙二醇中，依次加入 2.4g柠檬酸和11.81g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在200℃下反应6h，经过冷却、磁分离、无水乙醇和去离子水多次洗涤，得到粒径为180nm的超顺磁性的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.5g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至50mL乙醇/水混合溶剂 (V乙醇/V水＝4：1)中，加入0.6g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 (MPTS)，在60℃下搅拌24h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.48g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至110mL乙腈中，然后加入1.54g苯乙烯、0.64g二乙烯苯、0.63g甲基丙烯酸缩水甘油酯和0.05g偶氮二异丁腈，在80℃下反应12h，反应结束后，经过磁分离、无水乙醇多次洗涤，得到聚苯乙烯包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.26g氯化铕溶解于10mL去离子水中，得到氯化铕水溶液，将0.6g的2-噻吩甲酰三氟丙酮和0.9g的三正辛基氧膦分散至30mL 无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，然后将氯化铕水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在50℃下搅拌3h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次，得到稀土铕配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取2g步骤3制备的聚苯乙烯包覆的磁性微球分散至150mL氯仿中，加入150mg步骤4制备的稀土铕配合物，在室温下震荡2h，加入50mL去离子水，在40℃、真空条件下减压蒸馏去除氯仿，用0.1％NP-40清洗至上清液无荧光，即得该时间分辨荧光磁性纳米微球。
实施例2
一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将4.89g六水合三氯化铁溶解于100mL乙二醇中，依次加入 2.4g柠檬酸和11.81g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在200℃下反应6h，经过冷却、磁分离、无水乙醇和去离子水多次洗涤，得到粒径为200nm的超顺磁性的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.5g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至50mL乙醇/水混合溶剂 (V乙醇/V水＝4：1)中，加入0.6g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 (MPTS)，在60℃下搅拌24h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.5g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至110mL乙腈中，然后加入1.72g苯乙烯、0.55g二乙烯苯、0.55g甲基丙烯酸缩水甘油酯和0.053g偶氮二异丁腈，在80℃下反应12h，反应结束后，经过磁分离、无水乙醇多次洗涤，得到聚苯乙烯包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.26g氯化铕溶解于10mL去离子水中，得到氯化铕水溶液，将0.6g的2-噻吩甲酰三氟丙酮和1.0g的三苯基氧膦分散至30mL 无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，然后将氯化铕水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在60℃下搅拌3h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次，得到稀土铕配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取2g步骤3制备的聚苯乙烯包覆的磁性微球分散至100mL氯仿中，加入150mg步骤4制备的稀土铕配合物，在室温下震荡1h，加入150mL去离子水，在40℃、真空条件下减压蒸馏去除氯仿，用 0.1％NP-40清洗至上清液无荧光，即得该时间分辨荧光磁性纳米微球。
实施例3
一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将4.32g六水合三氯化铁溶解于110mL乙二醇中，依次加入2.6g柠檬酸和13.62g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在200℃下反应7h，经过冷却、磁分离、无水乙醇和去离子水多次洗涤，得到粒径为175nm的超顺磁性的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.7g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至80mL乙醇/水混合溶剂 (V乙醇/V水＝4：1)中，加入0.8g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 (MPTS)，在80℃下搅拌12h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.6g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至130mL乙腈中，然后加入2.86g苯乙烯、0.75g二乙烯苯、0.75g甲基丙烯酸缩水甘油酯和0.0872g偶氮二异丁腈，在80℃下反应12h，反应结束后，经过磁分离、无水乙醇多次洗涤，得到聚苯乙烯包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.36g氯化铕溶解于10mL去离子水中，得到氯化铕水溶液，将0.8g的2-噻吩甲酰三氟丙酮和0.4g的1,10-邻菲罗啉分散至30mL 无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，然后将氯化铕水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在50℃下搅拌4h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次，得到稀土铕配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取0.5g步骤3制备的聚苯乙烯包覆的磁性微球分散至50mL二氯甲烷中，加入100mg步骤4制备的稀土铕配合物，在室温下震荡 4h，加入50mL去离子水，在20℃、真空条件下减压蒸馏去除二氯甲烷，用0.1％NP-40清洗至上清液无荧光，即得该时间分辨荧光磁性纳米微球。
实施例4
一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将4.32g六水合三氯化铁溶解于110mL乙二醇中，依次加入 2.6g柠檬酸和13.62g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在200℃下反应8h，经过冷却、磁分离、无水乙醇和去离子水多次洗涤，得到粒径为180nm的超顺磁性的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.5g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至100mL乙醇/水混合溶剂(V乙醇/V水＝4：1)中，加入0.6g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)，在60℃下搅拌12h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.72g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至140mL乙腈中，然后加入1.54g苯乙烯、0.64g二乙烯苯、0.63g甲基丙烯酸和0.05g 偶氮二异丁腈，在70℃下反应24h，反应结束后，经过磁分离、无水乙醇多次洗涤，得到聚苯乙烯包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.26g氯化铕溶解于5mL去离子水中，得到氯化铕水溶液，将0.8g的1,3-二苯基丙二酮和0.4g的1,10-邻菲罗啉分散至30mL 无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，然后将氯化铕水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在70℃下搅拌6h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次，得到稀土铕配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取1g步骤3制备的聚苯乙烯包覆的磁性微球分散至100mL二氯甲烷中，加入100mg步骤4制备的稀土铕配合物，在室温下震荡 5h，加入100mL去离子水，在20℃、真空条件下减压蒸馏去除二氯甲烷，用0.1％NP-40清洗至上清液无荧光，即得该时间分辨荧光磁性纳米微球。
实施例5
一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将4.87g六水合三氯化铁溶解于130mL乙二醇中，依次加入 3.2g柠檬酸和14.77g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在180℃下反应10h，经过冷却、磁分离、无水乙醇和去离子水多次洗涤，得到粒径为220nm的超顺磁性的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.5g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至50mL乙醇/水混合溶剂 (V乙醇/V水＝4：1)中，加入0.6g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 (MPTS)，在60℃下搅拌24h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.55g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至110mL乙腈中，然后加入1.72g苯乙烯、0.55g二乙烯苯、0.55g甲基丙烯酸和0.053g 偶氮二异丁腈，在80℃下反应12h，反应结束后，经过磁分离、无水乙醇多次洗涤，得到聚苯乙烯包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.26g氯化铕溶解于10mL去离子水中，得到氯化铕水溶液，将0.8g的1,3-二苯基丙二酮和0.4g的1,10-邻菲罗啉分散至30mL 无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，然后将氯化铕水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在60℃下搅拌5h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次，得到稀土铕配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取0.5g步骤3制备的聚苯乙烯包覆的磁性微球分散至50mL甲苯中，加入100mg步骤4制备的稀土铕配合物，在室温下震荡1h，加入50mL去离子水，在80℃、真空条件下减压蒸馏去除甲苯，用 0.1％NP-40清洗至上清液无荧光，即得该时间分辨荧光磁性纳米微球。
实施例6
一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将4.87g六水合三氯化铁溶解于130mL乙二醇中，依次加入 3.2g柠檬酸和16.49g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在200℃下反应10h，经过冷却、磁分离、无水乙醇和去离子水多次洗涤，得到粒径为210nm的超顺磁性的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.5g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至50mL乙醇/水混合溶剂 (V乙醇/V水＝4：1)中，加入0.6g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 (MPTS)，在60℃下搅拌24h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.5g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至130mL乙腈中，然后加入2.86g苯乙烯、0.75g二乙烯苯、0.75g甲基丙烯酸和0.0872g 偶氮二异丁腈，在80℃下反应12h，反应结束后，经过磁分离、无水乙醇多次洗涤，得到聚苯乙烯包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.26g氯化铕溶解于10mL去离子水中，得到氯化铕水溶液，将0.7g的1,3-二苯基丙二酮和0.9g的三正辛基氧膦分散至30mL无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，然后将氯化铕水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在50℃下搅拌3h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次，得到稀土铕配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取1g步骤3制备的聚苯乙烯包覆的磁性微球分散至100mL甲苯中，加入150mg步骤4制备的稀土铕配合物，在室温下震荡3h，加入100mL去离子水，在80℃、真空条件下减压蒸馏去除甲苯，用 0.1％NP-40清洗至上清液无荧光，即得该时间分辨荧光磁性纳米微球。
实施例7
一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将5.41g六水合三氯化铁溶解于120mL乙二醇中，依次加入 3g柠檬酸和17.23g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在200℃下反应10h，经过冷却、磁分离、无水乙醇和去离子水多次洗涤，得到粒径为250nm的超顺磁性的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.5g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至50mL乙醇/水混合溶剂 (V乙醇/V水＝4：1)中，加入0.7g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 (MPTS)，在60℃下搅拌24h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.5g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至110mL乙腈中，然后加入1.54g苯乙烯、0.64g二乙烯苯、0.63g丙烯酸和0.05g偶氮二异丁腈，在80℃下反应12h，反应结束后，经过磁分离、无水乙醇多次洗涤，得到聚苯乙烯包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.26g氯化铕溶解于10mL去离子水中，得到氯化铕水溶液，将0.7g的1,3-二苯基丙二酮和0.9g的三苯基氧膦分散至30mL无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，然后将氯化铕水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在50℃下搅拌3h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次，得到稀土铕配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取2g步骤3制备的聚苯乙烯包覆的磁性微球分散至50mL四氢呋喃中，加入100mg步骤4制备的稀土铕配合物，在室温下震荡2h，加入150mL去离子水，在40℃、真空条件下减压蒸馏去除四氢呋喃，用0.1％NP-40清洗至上清液无荧光，即得该时间分辨荧光磁性纳米微球。
实施例8
一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将6.49g六水合三氯化铁溶解于140mL乙二醇中，依次加入 3.6g柠檬酸和17.72g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在200℃下反应10h，经过冷却、磁分离、无水乙醇和去离子水多次洗涤，得到粒径为230nm的超顺磁性的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.6g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至50mL乙醇/水混合溶剂 (V乙醇/V水＝4：1)中，加入0.7g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 (MPTS)，在60℃下搅拌12h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.6g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至140mL乙腈中，然后加入2.86g苯乙烯、0.75g二乙烯苯、0.75g丙烯酸和0.00872g偶氮二异丁腈，在80℃下反应12h，反应结束后，经过磁分离、无水乙醇多次洗涤，得到聚苯乙烯包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.26g氯化铕溶解于10mL去离子水中，得到氯化铕水溶液，将0.7g的1,3-二苯基丙二酮和0.9g的三苯基氧膦分散至30mL无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，然后将氯化铕水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在50℃下搅拌3h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次，得到稀土铕配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取2g步骤3制备的聚苯乙烯包覆的磁性微球分散至50mL丙酮中，加入100mg步骤4制备的稀土铕配合物，在室温下震荡2h，加入150mL去离子水，在40℃、真空条件下减压蒸馏去除丙酮，用0.1％ NP-40清洗至上清液无荧光，即得该时间分辨荧光磁性纳米微球。
实施例9
一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将5.41g六水合三氯化铁溶解于120mL乙二醇中，依次加入3 g柠檬酸和9.84g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在220℃下反应10h，经过冷却、磁分离、无水乙醇和去离子水多次洗涤，得到粒径为230nm的超顺磁性的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.5g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至50mL乙醇/水混合溶剂 (V乙醇/V水＝4：1)中，加入0.6g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 (MPTS)，在60℃下搅拌24h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.72g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至140mL乙腈中，然后加入2.86g苯乙烯、0.75g二乙烯苯、0.75g丙烯酸和0.00872g偶氮二异丁腈，在80℃下反应12h，反应结束后，经过磁分离、无水乙醇多次洗涤，得到聚苯乙烯包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.26g氯化铕溶解于10mL去离子水中，得到氯化铕水溶液，将0.6g的2-噻吩甲酰三氟丙酮和0.9g的三正辛基氧膦分散至30mL 无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，然后将氯化铕水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在50℃下搅拌3h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次，得到稀土铕配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取2g步骤3制备的聚苯乙烯包覆的磁性微球分散至150mL丙酮中，加入150mg步骤4制备的稀土铕配合物，在室温下震荡2h，加入50mL去离子水，在40℃、真空条件下减压蒸馏去除丙酮，用0.1％ NP-40清洗至上清液无荧光，即得该时间分辨荧光磁性纳米微球，如图1所示。
对比例1
一种不同于本发明的时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将6.49g六水合三氯化铁溶解于140mL乙二醇中，依次加入 3.6g柠檬酸和17.72g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在 200℃下反应10h，经过冷却、磁分离、无水乙醇和去离子水多次洗涤，得到粒径为230nm的超顺磁性的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁性微球：
取0.6g步骤1制备的Fe3O4磁核分散至140mL乙腈中，然后加入2.86g苯乙烯、0.75g二乙烯苯、0.75g丙烯酸和0.00872g偶氮二异丁腈，在80℃下反应12h，反应结束后，经过磁分离、无水乙醇多次洗涤，得到聚苯乙烯包覆的磁性微球；
步骤3、制备稀土配合物：
取0.26g氯化铕溶解于10mL去离子水中，得到氯化铕水溶液，将0.7g的1,3-二苯基丙二酮和0.9g的三苯基氧膦分散至30mL无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，然后将氯化铕水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在50℃下搅拌3h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次，得到稀土铕配合物；
步骤4、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取2g步骤2制备的聚苯乙烯包覆的磁性微球分散至50mL丙酮中，加入100mg步骤3制备的稀土铕配合物，在室温下震荡2h，加入150mL去离子水，在40℃、真空条件下减压蒸馏去除丙酮，用0.1％NP-40清洗至上清液无荧光，即得该时间分辨荧光磁性纳米微球。
对比例2
一种不同于本发明的时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将6.49g六水合三氯化铁溶解于140mL乙二醇中，依次加入 3.6g柠檬酸和17.72g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在 200℃下反应10h，经过冷却、磁分离、无水乙醇和去离子水多次洗涤，得到粒径为230nm的超顺磁性的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.6g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至50mL乙醇/水混合溶剂 (V乙醇/V水＝4：1)中，加入0.7g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)，在60℃下搅拌12h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.6g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至140mL乙腈中，然后加入2.86g苯乙烯、0.75g二乙烯苯、0.75g丙烯酸和0.00872g 偶氮二异丁腈，在80℃下反应12h，反应结束后，经过磁分离、无水乙醇多次洗涤，得到聚苯乙烯包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.26g氯化铕溶解于10mL去离子水中，得到氯化铕水溶液，将0.7g的1,3-二苯基丙二酮和0.9g的三苯基氧膦分散至30mL无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，然后将氯化铕水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在50℃下搅拌3h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次，得到稀土铕配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取2g步骤3制备的聚苯乙烯包覆的磁性微球分散至50mL乙醇中，加入100mg步骤4制备的稀土铕配合物，在室温下震荡2h，加入150mL去离子水，在50℃、真空条件下减压蒸馏去除乙醇，用0.1％ NP-40清洗至上清液无荧光，即得该时间分辨荧光磁性纳米微球。
二、时间分辨荧光磁性纳米微球的粒径、荧光性能和磁性测试
1、粒径测试
将各实施例及对比例制备得到的时间分辨荧光磁性纳米微球样品(0.1mg/mL的)及对比例制备得到的经马尔文Zeta粒度仪测得其水力半径和PDI值，结果如表1所示，时间分辨荧光磁性纳米微球的粒径为200～500nm。
2、荧光强度测试
将各实施例及对比例制备得到的时间分辨荧光磁性纳米微球配制为浓度10μg/mL的样品，经荧光分光光度计在电压500V、狭缝 10nm的条件下测试荧光强度，结果如表1所示，结果表明，该时间分辨荧光磁性纳米微球的荧光强度在1200～9200a.u。
与实施例8相比较，对比例1中由于未形成硅层，荧光强度大大降低，对比例2中由于选择了乙醇作为溶胀剂，荧光强度也大大降低。
3、磁性测试
将各实施例制备得到的时间分辨荧光磁性纳米微球样品经振动样品磁强计仪器测得其磁饱和度，结果如表1所示，该时间分辨荧光磁性纳米微球的磁饱和度在22～48emu/g。
表1时间分辨荧光磁性纳米微球的测试结果
| 序号 | 水力直径(nm) | PDI值 | 荧光强度(a.u) | 磁饱和度(emu/g) |
| 实施例1 | 200 | 0.145 | 1200 | 40 |
| 实施例2 | 230 | 0.155 | 1600 | 32 |
| 实施例3 | 320 | 0.184 | 7900 | 26 |
| 实施例4 | 260 | 0.144 | 1600 | 36 |
| 实施例5 | 340 | 0.184 | 2800 | 31 |
| 实施例6 | 390 | 0.204 | 8100 | 22 |
| 实施例7 | 300 | 0.164 | 1400 | 48 |
| 实施例8 | 480 | 0.194 | 7300 | 30 |
| 实施例9 | 500 | 0.211 | 9200 | 27 |
| 对比例1 | 230 | 0.2988 | 1250 | 45 |
| 对比例2 | 500 | 0.316 | 1280 | 27 |
上述实施例和图式并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。
Claims (5)
1.一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、制备磁核Fe3O4：
先将4.32～6.49g六水合三氯化铁溶解于100～140mL乙二醇中，依次加入2.4～3.6g柠檬酸和9.84～17.72g乙酸钠，超声至澄清状后倒入反应釜中，在180～220℃下反应6～10h，经过冷却、磁分离、洗净，得到粒径在175～250nm的磁核Fe3O4备用；
步骤2、制备磁核Fe3O4@MPTS：
取0.5～0.7g步骤1制备的磁核Fe3O4分散至50～100mL乙醇/水混合溶剂中，加入0.6～0.8g甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，在60～80℃下搅拌12～24h，得到在磁核Fe3O4表面修饰有烯烃键的磁核Fe3O4@MPTS；
步骤3、制备磁性微球：
取0.48～0.72g步骤2制备的Fe3O4@MPTS磁核分散至100～140mL乙腈中，然后加入2.81～4.36g聚合物单体和0.0500～0.0872g引发剂，在60～80℃下反应12～24h，反应结束后，经过磁分离、洗净，得到聚合物包覆的磁性微球；
步骤4、制备稀土配合物：
取0.26～0.36g稀土盐溶解于5～10mL去离子水中，得到稀土盐水溶液，将1.2～1.6g的稀土配合物分散至30mL无水乙醇中，得到混合无水乙醇溶液，将稀土盐水溶液缓慢加入到混合无水乙醇溶液中，在50～70℃下搅拌3～6h，洗净，得到稀土配合物；
步骤5、制备时间分辨荧光磁性纳米微球：
取0.5～2g步骤3制备的聚合物包覆的磁性微球分散至50～150mL作为溶胀剂的有机溶剂中，加入100～150mg步骤4制备的稀土配合物，在室温下震荡1～5h，加入50～150mL去离子水，在20～80℃、真空条件下减压蒸馏去除有机溶剂，用0.1％NP-40清洗至上清液无荧光，即得到粒径在200～500nm的所述时间分辨荧光磁性纳米微球；
步骤3中，所述聚合物单体为苯乙烯、二乙烯苯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸和丙烯酸中的两种或两种以上的混合，所述引发剂为偶氮二异丁腈；
步骤4中，所述稀土盐为EuCl3，所述配合物为1,10-邻菲罗啉、三正辛基氧膦、1,3-二苯基丙二酮和三苯基氧膦中的两种或两种以上的混合；
步骤5中，所述有机溶剂采用氯仿、二氯甲烷、甲苯或四氢呋喃。
2.根据权利要求1所述的一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述洗净是将产物依次用无水乙醇和去离子水洗涤多次。
3.根据权利要求1所述的一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述乙醇/水混合溶剂的V乙醇/V水＝4：1。
4.根据权利要求1所述的一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，其特征在于：所述洗净是将产物用无水乙醇洗涤多次。
5.根据权利要求1所述的一种时间分辨荧光磁性纳米微球的制备方法，其特征在于：步骤4中，所述洗净是将产物用无水乙醇和去离子水交替洗涤多次。
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