KR101957048B1

KR101957048B1 - Dna 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체 및 이를 이용한 유전자 발현 조절 방법

Info

Publication number: KR101957048B1
Application number: KR1020170129708A
Authority: KR
Inventors: 엄숭호; 신승원; 천상훈
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2017-10-11
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2019-03-11

Abstract

본원은 고분자-산화철 복합 나노입자; 상기 고분자-산화철 복합 나노입자 표면에 코팅된 실리카 코팅층; 및 상기 실리카 코팅층 상에 부착된 DNA를 포함하는 DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다.

Description

DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체 및 이를 이용한 유전자 발현 조절 방법{DNA-containing polymer-iron oxide nanocomplex and method for regulating gene expression using the same}

산화철 나노입자는 나노크기로 인해 발생하는 전자기적 특성, 생체적합성, 우수한 이미징 효과로 인해 생체 의학적 치료 및 진단 분야에서 주목받는 물질 중 하나이다. 이러한 산화철 나노입자의 다양한 활용은 대부분 나노크기 입자가 갖는 특별한 성질인 '초상자성 (superparamagnetism)'에서 기인한다. 이와 같이 초상자성을 띠는 산화철 나노입자는 약물전달, 광열치료, 미세입자의 분리, MRI 이미징 등 광범위한 생체의료분야에 사용되고 있다. 다만, 기존의 산화철 나노입자는 단일 입자로서, 자기장 내에서 약한 자기장 반응성 및 초상자성을 나타낸다는 문제가 있었다.

상기와 같은 한계를 극복하기 위하여 산화철 나노입자를 다중으로 포획하는 기술들이 개발되어 왔으나, 각 기술마다 포획할 수 있는 산화철 나노입자의 개수 및 자기장 반응성에 대한 한계가 여전히 존재하였다. 예를 들어, 메사추세츠 공과대학 화학과의 CHEN, Ou, et al. 연구진에서는 산화철 나노입자의 소수성 효과에 따른 응집 현상을 이용하여 산화철 나노입자들로 이루어진 산화철 나노입자 군집을 합성하였으나, 이 경우 규칙적이고 균일한 형태의 군집이 합성되지만 내부에 포획되는 산화철 나노입자의 개수나 비율을 조절하여 자기장에 대한 반응성을 조절하기에는 어려움이 있었다.

한편, 유전자의 발현은 DNA로부터 mRNA가 합성되는 전사과정과 mRNA로부터 단백질이 형성되는 번역과정으로 구성되며, 유전자 발현 조절은 전사 혹은 번역과정을 저해함으로써 가능해진다. 일반적으로 유전자 발현 조절은 전사나 번역과정에 사용되는 효소 혹은 유전체에 결합하는 물질을 사용하여 효소와 유전체가 서로 결합하기 못하도록 함으로서 이루어지므로, 이러한 경우 원하는 유전자의 발현을 선별적으로 조절하지 못하고 다른 유전자 발현 조절 네트워크를 침해할 가능성이 있다. 즉, 세포 내에서 특정 유전자의 발현을 조절하기 위한 방법은 예상할 수 없는 세포 내의 교란을 유도할 가능성이 있다는 문제가 있었다.

본원은 다수의 산화철 나노입자체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 포집되는 산화철 나노입자의 양을 넓은 범위에서 조절할 수 있는 고분자 기반 플랫폼을 개발하고, 이에 의해 제조되는 산화철 나노입자의 새로운 활용으로서 물리적 차폐 현상을 이용한 유전자 발현 조절자를 제시하고자 하였다.

더욱 구체적으로는, 고분자 기반의 산화철 나노구조체를 이용하여 단일 산화철 나노입자가 갖는 약한 자기장 반응성을 극복하고, 이를 통해 자기장 내에서 고분자-산화철 복합체가 서로 응집하는 현상을 이용하여 복합체 표면에 부착된 DNA의 전사과정을 물리적으로 억제함으로써, 최종적으로 세포 내의 다른 유전자 발현 메커니즘을 교란하지 않고, 특정 유전자의 발현을 선별적으로 조절하고자 하였다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 고분자-산화철 복합 나노입자; 상기 고분자-산화철 복합 나노입자 표면에 코팅된 실리카 코팅층; 및 상기 실리카 코팅층 상에 부착된 DNA를 포함하는, DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체를 제공할 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 유기용매 내에서 고분자 및 산화철 나노입자를 혼합하고, PVA (poly vinyl alcohol) 수용액을 첨가하고 교반한 후, 상기 유기용매를 증발시켜 고분자-산화철 복합 나노구조체를 수득하는 단계; 상기 고분자-산화철 복합 나노구조체의 표면을 실리카로 코팅하는 단계; 상기 실리카 코팅 표면을 아민기로 치환시키는 단계; 및 말단에 글루타알데히드를 가지는 DNA를 상기 아민기와 반응시켜 상기 DNA를 상기 실리카 상에 부착시키는 단계를 포함하는, DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체의 제조방법을 제공할 수 있다.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체에 자기장을 가함으로써 상기 DNA에 의해 암호화되는 유전자의 발현을 감소시키는 것을 포함하는, 유전자 발현 감소 방법을 제공할 수 있다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.

본원은 고분자 기반의 산화철 복합체를 이용하여 유전자 발현을 조절하는 방법 및 그 응용 방법을 제시하고자 하는 것으로서, 자기장 내에서 고분자-산화철 복합 나노구조체가 초상자성을 띠고, 상기 나노구조체가 응집되었을 때 물리적 차폐 (physical blocking) 효과를 나타내는 원리를 활용하였다.

구체적으로는, 고분자-산화철 복합 나노구조체를 합성하고, 합성된 복합체의 표면에 DNA를 부착하였으며, 자기장 내에서 복합체가 응집되는 효과를 이용하여 부착된 DNA의 전사과정을 물리적으로 저해하고 최종적으로 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 이는 세포 내에 이미 존재하는 DNA 전사 및 번역에 관여하는 효소를 손상시키지 않는 조절방법으로서, 자기장 내에서 단백질 발현을 억제하고, 자기장을 제거한 뒤에는 다시 정상적인 단백질 발현이 가능하도록 한다. 즉, 본원의 방법에 따르면 가역적으로 단백질 발현을 억제 및 복구할 수 있으며, 이는 세포 본래의 단백질 발현 메커니즘을 교란시키지 않는 단백질 발현 조절방법이 될 것으로 기대된다.

도 1은 본원의 일 실시예에서 제조된 GFP DNA의 전기영동 확인 결과 (도 1a), 본원의 일 실시예에 따른 고분자-산화철 복합 나노구조체의 투과전자현미경 관찰 결과 (도 1b), 본원의 일 구현예에 따른 유전자 발현 감소 방법의 개략도 (도 1c), 및 자기장 적용에 따른 유전자 발현 조절 실험 결과 (도 1d)를 나타낸다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 고분자-산화철 복합체 표면에 GFP DNA를 부착시킨 후 이를 확인한 전기영동 결과 (도 2a) 및 이를 수치화한 그래프 (도 2b)를 나타낸다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체의 물리적 차폐에 따른 DNA 발현 조절 여부를 관찰하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체에 자기장을 적용하지 않은 경우 (도 4a) 및 적용한 경우 (도 4b) 유전자 발현 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.

이하, 본원의 DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 유전자 발현 감소 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

일반적으로 DNA의 발현은 DNA로부터 mRNA가 생성되는 전사과정 및 mRNA로부터 단백질이 생성되는 번역과정의 두 단계를 거쳐 이루어지는데, 이 두 단계는 각각 RNA 중합효소 및 리보솜이라고 하는 단백질이 DNA와 mRNA에 접합하여 이루어진다. 본원에서 제시되는 시스템은 RNA 중합효소가 DNA에 접합하는 것을 억제하여 전사과정을 저해하며, 이에 따라 최종산물인 단백질의 생성이 감소된다. 구체적으로는, RNA 중합효소가 DNA에 접합하는 것을 억제하기 위해, DNA를 고분자-산화철 복합 나노구조체에 부착하고, 여기에 자기장을 가하여 상기 나노구조체의 응집을 유도할 수 있다 (도 1c). 이 경우, RNA 중합효소를 포함하는 외부 환경에 대한 DNA의 노출이 감소되고 그 결과 mRNA의 생성이 감소되며, 따라서 최종 산물인 단백질의 생성이 감소될 수 있다.

또한, 본원의 고분자-산화철 복합 나노구조체 자체는 다수의 산화철 나노입자체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 포집되는 산화철 나노입자의 양을 넓은 범위에서 조절할 수 있고, 이입된 산화철 나노입자의 양에 따라 자기장 반응성 및 자성을 정밀하고 용이하게 조절 가능하며, 또한, 산화철 나노입자가 외부 자기장내에서 보이는 특별한 성질인 '물리적 차폐 (physical blocking)'를 이용하여 고분자-산화철 복합체 표면에 처리된 단백질의 활성을 조절할 수 있고, 다양한 자성을 갖는 고분자-산화철 복합 나노입자체를 동시에 사용함으로써 특이적 적층 구조 형성 및 표면 처리된 단백질의 활성 조절이 가능한바, 기존에 사용되던 산화철 기반의 생체 의학적 치료 및 진단에 널리 응용될 수 있다.

예를 들어, 본원의 나노구조체는 형광체는 플루오레신(fluorescein), 텍사스레드(TexasRed), 로다민(rhodamine), 알렉사(alexa), 시아닌(cyanine),보디피(BODIPY), 쿠마린(coumarin) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 형광체를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, DNA 말단의 글루타알데히드와 실리카 코팅층 상의 아민기 간의 결합에 의해 상기 DNA가 상기 실리카 코팅층 상에 부착된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 본원이 속하는 기술분야에 알려진, 표면 상에 DNA를 부착시킬 수 있는 방법이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 고분자는 PLGA (Poly lactic-L-glycolic acid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 생체에 사용하기 적합한 나노크기의 고분자라면 제한 없이 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 DNA는 형광 유전자를 암호화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체의 직경이 약 200 nm 내지 약 300 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 그 목적에 따라 나노구조체의 제조 공정을 조절하여 상기 직경을 조절하는 것이 가능하다.

더욱 구체적으로는, 본원의 방법은 에멀젼을 이루는 유기용매 내에 나노구조체의 지지체로 사용되는 고분자 및 산화철 나노입자를 혼합하고, PVA 수용액을 첨가하고 교반시키며, 상기 유기용매를 증발시켜 반응시키는 단계; 및 고분자-산화철 복합 나노구조체의 표면 개질을 용이하게 하기 위하여 계면활성제로 사용된 PVA 고분자를 기반으로 실리카를 코팅하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이때, 상기 제조방법은 본 발명에 따른 고분자-산화철 복합 나노구조체를 제조할 수 있다면, 적절하게 단계의 순서 및/또는 구성을 변경할 수 있으며 상기 단계들에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 고분자-산화철 복합 나노구조체의 표면을 실리카로 코팅하는 단계는 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS)를 이용하여 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 본원이 속하는 기술분야에서 통상적으로 실리카층 또는 실리카 코팅을 형성하기 위해 사용되는 기술이라면 제한 없이 선택되어 사용될 수 있다.

예를 들어, 상기 실리카 코팅 표면을 아민기로 치환시키는 단계는 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES)을 이용하여 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 본원이 속하는 기술분야에서 통상적으로 표면 상에 아민기를 형성하기 위해 사용되는 기술이라면 제한 없이 선택되어 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 유기용매는 클로로포름 (chloroform)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 통상의 기술자가 본원이 속하는 기술분야에서 사용되는 유기용매 중에서 목적에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체에 자기장을 가함으로써 상기 DNA에 의해 암호화되는 유전자의 발현을 감소시키는 것을 포함하는 유전자 발현 감소 방법을 제공할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 유전자의 발현 감소는 세포 내에서 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 세포는 동물 세포, 식물 세포 및 미생물 세포를 포함할 수 있고 또한 생체 내(in vivo) 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원발명에 따른, DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체는 자기장 내에서 강하게 응집되어 물리적 차폐 효과를 통해 외부에 노출되는 DNA의 수를 줄일 수 있고, 이에 따라 RNA 중합효소의 접근이 저해되어 대조군과 비교하여 약 80%의 유전자 발현 저해 효과를 나타낼 수 있다. 이는 약물 전달 및 이미징 등 다양한 생체의학적 분야에서 활용되고 있는 초상자성 물질의 새로운 활용을 제시함과 동시에 유전자 발현 조절의 새로운 방법을 제시하는 것이다. 한편, 세포 내 유전자 발현 조절 네트워크에 이상이 생겨 특정 유전자가 조절되지 않는 경우 해당 세포가 암세포로 발전하기도 하는데, 본원에서 제시된 고분자-산화철 복합체 기반의 유전자 발현 조절자는 해당 세포 내 유전자 발현 조절 네트워크를 대체함으로써 암세포의 발생을 억제하거나 치료하는 목적으로 응용될 수도 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

1. 산화철 나노입자의 합성

1-1. 올레산철(Iron oleate)의 합성

140 ml의 헥산, 80 ml의 에탄올 및 60 ml의 증류수를 500 ml 플라스크에 넣고 교반시켰다. 이어서 10.8 g의 FeCl₃·6H₂O와 36.5 g의 올레산나트륨을 플라스크에 넣고 녹였다. 이후 4 시간 동안 60℃를 유지시키고, 4 시간 동안 교반 후 분별깔때기를 이용해 하층에 분리되는 증류수와 에탄올을 제거하여 2 회 세척하였다. 이후 회전 증발 농축기를 이용해 헥산을 증발시켜 올레산철을 얻었다.

1-2. 산화철 나노입자의 합성

36 g의 올레산철을 5.7 g의 올레산 및 200 g의 1-옥타데신에 넣고, 빠르게 교반하여 녹였다. 온도를 1 분에 3.3℃씩 상승시켜 320℃까지 가열하고, 320℃에서 30 분간 온도를 유지한 뒤 서서히 식혀 산화철 나노입자를 합성하였다. 합성된 산화철 나노입자 용액을 비커에 옮기고 헥산으로 1/5 희석한 뒤, 아세톤과 에탄올을 차례로 넣어 침전시켰다. 자석을 대어 침전된 산화철 나노입자를 포집하고 상층액을 제거하였다. 이를 2 회 반복 후 포집된 산화철 나노입자를 클로로포름 용액에 분산시켰다.

2. 산화철-고분자 복합체의 합성

PLGA (Poly lactic-L-glycolic acid) 20 mg과 산화철 100 mg을 클로로포름 0.5 ml에 녹였다. 이어서 3%의 PVA(polyvinylalcohol) 수용액 4.5 ml를 넣고 2 분간 볼텍싱(vortexing) 후 초음파 분산방법으로 2 분간 분산시켰다. 분산된 용액을 다시 20 ml의 1% PVA 수용액에 넣고 12 시간동안 교반하면서 클로로포름을 증발시켰다. 이때 자석 교반기(magnetic stirrer)가 아닌 일반 교반기를 사용하였다. 12시간 동안 교반 후 4℃, 15000 g에서 30 분씩 3 회 원심분리하여 세척하고, 이후 4℃에서 보관하였다.

3. 산화철-고분자 복합체의 실리카 표면 처리 방법

20 ml의 에탄올에 5 ml (40 mg)의 산화철-고분자 복합체를 넣고 800 rpm으로 교반하면서 3 ml의 증류수를 넣었다. 이어서 1 ml의 30% 암모니아 수용액과 500 μl의 테트라에틸 오르토실리케이트(Tetraethyl orthosilicate, TEOS)를 순서대로 천천히 첨가하였다. 이후 20 분간 교반하고 20℃, 15000 g에서 15 분씩 3 회 원심분리하여 세척하였다. 이후 12 시간 동안 자석 세척(magnetic washing)한 후 4℃에 보관하였다. 실리카 코팅된 산화철-고분자 복합체의 투과전자현미경 이미지는 도 1b에 나타나 있다.

4. 실리카 코팅된 산화철-고분자 복합체 표면의 아민기 처리 방법

45 ml의 에탄올에 2 ml의 증류수와 0.25 ml의 아세트산을 첨가하고, 이어서 2 ml의 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES)과 3 ml (25 mg)의 실리카 코팅된 산화철-고분자 복합체를 천천히 넣고 4 시간 동안 800 rpm으로 교반하였다. 이를 에탄올과 물로 각각 20℃, 15000 g에서 15 분씩 2 회 원심분리하여 세척하였으며, 최종적으로 물에 분산시켜 보관하였다.

5. 고분자-산화철 복합체 표면에 GFP DNA를 부착시키는 방법

아민기가 치환된 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 플라스미드로부터 GFP 발현에 관여하는 부분을 잘라내어 증폭시켰다. 사용된 플라스미드의 구조 및 증폭된 1600 bp 크기의 GFP DNA의 전기영동 확인 결과가 도 1a에 나타나 있다. 이 때 얻어진 GFP DNA는 말단에 아민기를 갖게 된다. GFP DNA를 정량 후 개수 비로 1000 배 이상의 8%의 글루타알데히드와 함께 24 시간 동안 상온에서 교반하고, 필터링을 통해 글루타알데히드로 치환된 GFP DNA를 수득하였다. 다시 정량 후 1.67 pmol의 GFP DNA와 1.5 mg의 아민기 처리된 산화철-고분자 복합체를 총 부피 0.3 ml의 수용액에서 24 시간 동안 상온에서 교반하였다. 이를 증류수로 20℃, 10000 g에서 10 분씩 3 회 원심분리하여 세척한 뒤, 증류수에 분산시켜 4℃에 보관하였다.

6. 고분자-산화철 복합체 표면에 GFP DNA 부착 확인

상기 실시예 5에 기술된 방법에 따라 GFP DNA와 고분자-산화철 복합체를 부착시키고, 첫 번째 원심분리 후 0.1 ml의 상층액을 추출하여 전기영동을 통해 반응하지 않은 GFP DNA의 양을 확인하였다. 전기영동은 1%의 아가로즈 겔을 사용하여 TAE 버퍼 상에서 100 V, 40 분간 진행하였다. 이후 15 분간 에티듐 브로마이드 염색 후 자외선을 조사하여 결과를 확인하였다. 아가로즈 겔을 이용한 전기영동 결과가 도 2a에 나타나 있다. 기준이 되는 DNA 농도가 Lane 2-5에, 상층액에서 추출한 미반응 DNA가 Lane 6에서 확인되었다. 도 2b는 전기영동 결과를 이미지-J 프로그램을 이용해 수치화한 그래프이다.

7. 고분자-산화철 복합체 표면에 부착된 GFP DNA의 정상발현 확인

상기 실시예 5에 기술된 방법에 따라 제조된, GFP DNA가 부착된 고분자-산화철 복합체 12 μl (0.1 pmol GFP DNA)를 총 부피 45 μl의 DNA 발현 키트에 넣고, 30℃에서 8 시간 동안 배양하면서 생성된 GFP의 형광 값을 분광분석 장비를 이용하여 측정하였다.

8. 자기장 내에서 고분자-산화철 복합체 표면에 부착된 GFP DNA의 발현 억제 확인

상기 실시예 5에 기술된 방법에 따라 제조된, GFP DNA가 부착된 고분자-산화철 복합체 12 μl (0.1 pmol GFP DNA)를 총 부피 45 μl의 DNA 발현 키트에 넣고 30℃의 인큐베이터 내에서 8 시간 동안 배양하였다. 이 때 대조군은 아무런 조작을 가하지 않고 배양하였으며, 실험군은 튜브의 하단에 네오디뮴 자석을 위치시켜 배양하였다. 8 시간 후, 대조군과 실험군을 4℃, 10000 g에서 10 분간 원심분리하였다. 상층액 10 μl를 추출하여 10 배 희석하고, 분광분석 장비를 이용하여 각각의 GFP의 형광값을 측정하여 비교하였다. 비교 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 실험군 (magnetic(+))이 하단에 네오디뮴 자석을 위치하여 단백질 발현을 억제한 결과를 나타낸 것으로서, 약 80% 정도의 단백질 발현 억제 효과를 확인할 수 있었다.

9. 배양 시간에 따른 GFP DNA 발현양의 변화 비교

상기 실시예 5에 기술된 방법에 따라 제조된, GFP DNA가 부착된 고분자-산화철 복합체 12 μl (0.1 pmol GFP DNA)를 총 부피 45 μl의 DNA 발현 키트에 넣고 30℃의 인큐베이터 내에서 배양하였다. 형광단백질의 발현정도를 비교하기 위해 실험군의 아래쪽에 네오디뮴 자석을 설치하였다. 배양시작 후 20분 간격으로 분광분석 장비를 통해 발현된 GFP의 형광값을 측정하였다. 해당 실시예는 같은 방식으로 3번 진행하고 평균값을 측정하였다. 본 실시예는 상기 실시예 8 이후에 진행되었다. 최종적으로 발현되는 형광단백질의 양의 차이를 도 3에서 확인하고 이러한 차이가 시간에 따라 어떻게 발생하게 되었는지를 확인할 수 있었다.

도 1d의 대조군 그래프("magnet off", 검은 색 그래프)는 통상적인 단백질 발현의 형태를 따르고 있었다. 이와 비교하여 본 발명에서 제시되는 발현 억제 메커니즘을 거친 실험군 그래프("magnet on", 붉은 색 그래프)는 배양 시간 전체에 걸쳐 낮은 수치의 발현을 보임을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 발현 억제 메커니즘이 발현의 초기부터 작동하여 최종적으로는 도 3에서 확인한 것과 같은 정도의 발현의 차이를 유도함을 확인할 수 있었다.

10. 자기장 적용시간에 따른 GFP DNA 발현 조절 정도 비교

상기 실시예 8에 기술된 것과 동일한 방법으로 고분자-산화철 복합체에 부착된 GFP DNA를 30℃의 인큐베이터 내에서 배양하였다. 배양 후 각각 0, 0.5, 2 및 6시간이 지났을 때 네오디뮴 자석을 튜브의 하단에 위치시켰다. 8 시간 배양 후 4, 10000 g에서 10 분간 원심분리하였다. 상층액 10 μl를 추출하여 10 배 희석하고, 분광분석 장비를 이용하여 각각의 GFP의 형광값을 측정하여 비교하였다. 비교 결과는 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.

도 4a는 자석이 없을 때, 7 시간의 배양을 통해 얻은 GFP 발현에 따른 형광 값 변화를 나타낸다. 그래프에 역삼각형으로 표시된 시점에서 자석을 위치시켰다. 도 4b는 각각의 시점에서 자석을 위치시켰을 때, 최종적으로 얻어진 GFP의 형광 값을 상대적으로 나타낸 그래프이다.

도 4b에서 확인되는 바와 같이 발현 시작 후 30 분 이후에 발현 억제 메커니즘을 작동하는 것은 최종적으로 발현된 GFP의 양에 영향을 미치지 못했다. 즉, 이는 초기에 전사과정을 억제하지 못하면 30 분 이후에 메커니즘을 작동시키더라도 이미 전사된 mRNA에 의해 단백질 번역과정이 진행되어 결국에는 대조군과 같은 정도의 발현양을 보이게 됨을 의미한다. 따라서 발현 시작과 동시에 발현 억제 메커니즘을 작동시켰을 때 최종적인 발현양의 차이가 발생하는 것은 본 발명에서 제시한 바와 같이 해당 메커니즘이 mRNA의 전사를 억제하기 때문인 것으로 볼 수 있다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

고분자-산화철 복합 나노입자;
상기 고분자-산화철 복합 나노입자 표면에 코팅된 실리카 코팅층; 및
상기 실리카 코팅층 상에 부착된 DNA를 포함하는, DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체로서,
상기 고분자는 PLGA (Poly lactic-L-glycolic acid)이고,
상기 DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체에 자기장을 가함으로써 상기 DNA에 의해 암호화되는 유전자의 발현을 감소시키는, DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체.
제 1 항에 있어서,
상기 DNA의 말단의 글루타알데히드와 상기 실리카 코팅층 상의 아민기 간의 결합에 의해 DNA가 실리카 코팅층 상에 부착된 것인, DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 DNA는 형광 유전자를 암호화하는 것인, DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체.
제 1 항에 있어서,
상기 나노 구조체는 직경이 200 nm 내지 300 nm인, DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체.
유기용매 내에서 고분자 및 산화철 나노입자를 혼합하고, PVA (poly vinyl alcohol) 수용액을 첨가하고 교반한 후, 상기 유기용매를 증발시켜 고분자-산화철 복합 나노입자를 수득하는 단계;
상기 고분자-산화철 복합 나노입자의 표면을 실리카로 코팅하는 단계;
상기 실리카 코팅 표면을 아민기로 치환시키는 단계; 및
말단에 글루타알데히드를 가지는 DNA를 상기 아민기와 반응시켜 상기 DNA를 상기 실리카 상에 부착시키는 단계를 포함하는, DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체의 제조방법으로서,
상기 고분자는 PLGA (Poly lactic-L-glycolic acid)이고,
상기 DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체에 자기장을 가함으로써 상기 DNA에 의해 암호화되는 유전자의 발현을 감소시키는, DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체의 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 유기용매는 클로로포름 (chloroform)인 것인, DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체의 제조방법.
삭제
제 1 항 제 2 항, 제 4 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 함유 고분자-산화철 복합 나노구조체에 자기장을 가함으로써 상기 DNA에 의해 암호화되는 유전자의 발현을 감소시키는 것을 포함하는, 유전자 발현 감소 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 유전자의 발현 감소는 세포 내에서 이루어지는 것인, 유전자 발현 감소 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 세포는 동물 세포, 식물 세포 및 미생물 세포를 포함하는 것인, 유전자 발현 감소 방법.