CN112739325A - 油包凝胶型乳剂和透皮吸收剂 - Google Patents

油包凝胶型乳剂和透皮吸收剂 Download PDF

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Abstract

一种油包凝胶型乳剂，其含有已凝胶化的水溶性高分子、油和表面活性剂，以及一种透皮吸收剂，其含有该油包凝胶型乳剂。

Description

油包凝胶型乳剂和透皮吸收剂
技术领域
本发明涉及油包凝胶型乳剂和透皮吸收剂。
背景技术
透皮吸收剂以使药剂等有效成分经由皮肤吸收而导入体内为目的。在此，为了透皮吸收有效成分，需要使有效成分通过作为皮肤表层的疏水性的角质层而到达亲水性的皮肤内部。因此，对于透皮吸收剂而言，要求亲水-疏水的控制。
针对这一点，例如，专利文献1报道了规定的油包水型微乳作为透皮吸收剂(药物递送系统)有用。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平11-29464号公报
发明内容
发明所要解决的问题
另外，出于使有效成分的血药浓度长期维持稳定的目的，优选透皮吸收剂具有缓释性。但是，专利文献1等的现有的油包水(W/O)型微乳存在有效成分从透皮吸收剂的释放快、效果不持续的问题。
因此，本发明的目的在于，提供缓释性优良的透皮吸收剂以及该透皮吸收剂中使用的油包凝胶型乳剂。
用于解决问题的方法
鉴于上述情况，本发明人反复进行了深入研究，结果完成了以下的[1]～[6]所示的发明。
[1]一种油包凝胶型乳剂，其含有已凝胶化的水溶性高分子、油和表面活性剂。
[2]根据[1]所述的油包凝胶型乳剂，其中，已凝胶化的水溶性高分子中含有水溶性有效成分。
[3]根据[2]所述的油包凝胶型乳剂，其中，水溶性有效成分为生长因子。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的油包凝胶型乳剂，其中，已凝胶化的水溶性高分子为已凝胶化的生物来源高分子。
[5]根据[4]所述的油包凝胶型乳剂，其中，生物来源高分子为胶原蛋白或明胶。
[6]一种透皮吸收剂，其含有[1]～[5]中任一项所述的油包凝胶型乳剂。
发明效果
根据本发明，可以提供缓释性优良的透皮吸收剂以及该透皮吸收剂中使用的油包凝胶型乳剂。
附图说明
图1是实施例的皮肤透过性评价中使用的装置的示意性截面图。
图2是示出实施例1和比较例1的进行皮肤透过试验后的相位差观察和荧光观察的结果的图。
图3是实施例6和比较例5的HE染色观察的照片。
图4是示出实施例6和比较例5的吸光度的测定结果的图。
具体实施方式
以下详细地说明本发明的一个实施方式，但是本发明不受该实施方式限定。
本实施方式的油包凝胶型乳剂(以下也称为“G/O型乳剂”)含有已凝胶化的水溶性高分子、油和表面活性剂。本实施方式的G/O型乳剂还可以根据需要在已凝胶化的水溶性高分子中含有水溶性有效成分等。需要说明的是，G/O型乳剂是指来自已凝胶化的水溶性高分子的凝胶粒子分散在油中而成的乳剂。
乳剂中的凝胶粒子的平均粒径优选为1μm以下，更优选为800nm以下，进一步优选为600nm以下，进一步优选为400nm以下，特别优选为200nm以下。通过将凝胶粒子的平均粒径设为上述范围，一方面可抑制向正常血管组织的渗透，另一方面可维持向炎性血管组织的渗透性，因此有效成分的更有效的递送成为可能，从安全性的观点出发也更优选。凝胶粒子的平均粒径的下限值没有特别限定，例如，可以设为30nm以上或50nm以上。需要说明的是，凝胶粒子的平均粒径为利用动态光散射法测定的粒径。
以下对本实施方式的G/O型乳剂中的各成分详细地进行说明。
(已凝胶化的水溶性高分子)
水溶性高分子是指在常温的离子交换水中至少一部分发生溶解的高分子，更具体而言，例如是指100mL的离子交换水中溶解1g以上的样品的高分子。作为水溶性高分子的具体例，可列举：水溶性胶原蛋白、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、几丁质、壳聚糖、白蛋白、酪蛋白、丝心蛋白、纤维蛋白、玻连蛋白、透明质酸、透明质酸、透明质酸酯、葡聚糖、普鲁兰多糖、琼脂、藻酸、淀粉、菊糖、岩藻多糖、壳聚糖、纤维素等生物来源高分子；聚乙烯醇、聚丙烯酸系聚合物、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚
Figure BDA0002860439180000031
唑啉、聚缩水甘油以及它们的共聚物等合成高分子。其中，优选生物来源高分子，更优选胶原蛋白或明胶。作为水溶性高分子，可以单独使用一种或将两种以上组合使用。
需要说明的是，水溶性高分子例如可以通过将水溶性高分子的水溶液在低温或高温下保持而凝胶化。明胶等生物来源的水溶性高分子在加热溶液中成为无规线圈状的分子结构，但冷却时，明胶分子的一部分变成螺旋结构而形成网、从而凝胶化。水溶性胶原蛋白等水溶性高分子在生理环境(接近中性的pH、37℃)中发生自缔合而凝胶化。凝胶化的温度根据水溶性高分子的种类而不同，使在接近体温的温度下解除凝胶化的水溶性高分子、或者不能由于温度而凝胶化的水溶性高分子通过利用化学交联将水溶性高分子的分子间交联而凝胶化的方式也为优选方式之一。
作为化学交联的方法，可列举例如使用交联剂的方法、以及照射紫外线或电子束的方法。
使用交联剂的方法可优选应用于具有氨基和/或羧基的水溶性高分子、更优选应用于具有氨基和羧基的水溶性高分子、进一步优选应用于具有来自氨基酸的结构的生物来源的水溶性高分子。
交联剂只要是不产生对生物体的毒性的物质就没有特别限定。作为交联剂的具体例，可列举：戊二醛、甲醛等醛；二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺对甲苯磺酸盐(1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)等碳二亚胺；铬、铝、铁等多价离子等。其中，优选戊二醛或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。
化学交联可以在水溶性高分子之间进行，也可以导入能够与水溶性高分子反应的具有氨基、羧基等的其它化合物(例如肝素)而使用其进行交联。
以G/O型乳剂总量为基准，水溶性高分子的含量例如优选为0.001～50质量％，更优选为0.1～20质量％。
需要说明的是，已凝胶化的水溶性高分子除了水溶性高分子以外还包含来自水溶液的水。以水溶性高分子和水的总量为基准，水的含量优选为30～99质量％，更优选为50～98质量％。
(油)
作为油，可列举例如：大豆油、棉籽油、菜籽油(菜種油)、芝麻油、玉米油、花生油、红花籽油、葵花籽油、橄榄油、菜籽油(ナタネ油)、紫苏籽油、茴香油、可可油、肉桂油、薄荷油、佛手柑油等植物油；牛油、猪油、鱼油等动物油；乙基己酸甘油三酯、作为C8、C10脂肪酸混合甘油三酯的中链甘油三酯等脂肪酸甘油三酯；液体石蜡、角鲨烯、角鲨烷、姥鲛烷等非挥发性的烃类；肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、肉豆蔻酸十六烷基酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、亚油酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯等低级醇与高级脂肪酸的酯化合物等。其中，优选低级醇与高级脂肪酸的酯化合物，更优选肉豆蔻酸异丙酯或棕榈酸异丙酯。作为油，可以单独使用一种或将两种以上组合使用。
以G/O型乳剂总量为基准，油的含量例如优选为50～99.9质量％，更优选为75～99.7质量％。
(表面活性剂)
表面活性剂包括阴离子型、阳离子型、两性、非离子型的表面活性剂。各表面活性剂的分子中具有亲水基团和疏水基团，根据亲水基团与疏水基团的平衡(HLB值)而分类为亲水性或疏水性。具体而言，将HLB值大于10的分类为亲水性，将HLB值为10以下的分类为疏水性。这些表面活性剂可以没有特别限制地使用，但优选疏水性的表面活性剂，更优选疏水性的非离子型表面活性剂。表面活性剂可以单独使用一种或将两种以上组合使用。
作为疏水性的非离子型表面活性剂，可列举例如：蔗糖硬脂酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖油酸酯、蔗糖月桂酸酯、蔗糖山嵛酸酯、蔗糖芥酸酯等蔗糖脂肪酸酯类；失水山梨糖醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇三硬脂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、失水山梨糖醇三油酸酯、失水山梨糖醇倍半油酸酯、失水山梨糖醇单异硬脂酸酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、二甘油失水山梨糖醇五(2-乙基己基酸)酯和二甘油失水山梨糖醇四(2-乙基己基酸)酯等失水山梨糖醇脂肪酸酯类；甘油单硬脂酸酯、甘油单油酸酯、甘油单硬脂酸酯苹果酸酯(モノステアリン酸グリセリンリンゴ酸)等甘油脂肪酸酯类；二甘油四异硬脂酸酯、二甘油二异硬脂酸酯、二甘油单异硬脂酸酯、聚甘油单硬脂酸酯、聚甘油单异硬脂酸酯、聚甘油二异硬脂酸酯、聚甘油单月桂酸酯、聚甘油单油酸酯、聚甘油单肉豆蔻酸酯等聚甘油脂肪酸酯类等。
以G/O型乳剂中的凝胶粒子总量(包括凝胶中的水分和水溶性有效成分)为基准，表面活性剂的含量例如优选为0.05～20质量％，更优选为0.05～15质量％，进一步优选为0.1～15质量％。
(水溶性有效成分)
水溶性有效成分是指在常温的离子交换水中至少一部分发生溶解的成分，更具体而言，只要为在体内溶解至能够发挥水溶性有效成分的效果的程度的成分即可。只要为具有这样的性质的物质，则可以不限于化妆品、药品、准药品(医薬部外品)、食品等领域地根据用途适当选择。另外，水溶性有效成分可以为合成物质，也可以为天然物质。这些可以单独使用一种或将两种以上组合使用。作为水溶性有效成分的具体例，可列举：肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、转化生长因子(TGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、角质细胞生长因子(KGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)、T细胞生长因子、淋巴因子、细胞因子等生长因子等；胰岛素等水溶性激素；纺锤蛋白(netrin)等轴突导向分子；各种低分子治疗药、蛋白质制剂、酶药物、DNA等高分子治疗药等水溶性药物；保湿成分、消炎剂、收敛成分、维生素类、肽、氨基酸、抗菌成分、角质软化成分、细胞激活成分、抗衰老成分、血液循环促进成分、美白成分、生发/育发剂等。
需要说明的是，在已凝胶化的水溶性高分子中含有例如生长因子的情况下，优选使肝素共存。使肝素共存于已凝胶化的水溶性高分子中时，水溶性高分子中的生长因子形成肝素-生长因子复合物，生长因子被固定。由此，水溶性高分子中的生长因子进一步稳定化，可以更有效地表现出功能。进一步地，水溶性高分子优选为具有氨基的水溶性高分子。在二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)等碳二亚胺等缩合剂存在下利用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠(Sulfo-NHS)、1-羟基苯并三唑(HOBT)等使肝素中的羧基活化，使其与水溶性高分子中的氨基缩合，由此，可以将肝素固定于水溶性高分子。由此，可以使生长因子在水溶性高分子中更稳定。
水溶性有效成分的含量优选为提供作为透皮吸收剂有效的效果的浓度。以G/O型乳剂总量为基准，水溶性有效成分的含量例如优选为50质量％以下，更优选为10质量％以下。需要说明的是，水溶性有效成分的含量的下限没有特别限定，例如可以设为1质量ppm以上。
(G/O型乳剂的制造方法)
G/O型乳剂的制造方法没有特别限定，例如可以通过以下所示的方法来制备。
首先，向含有油和表面活性剂的第一液中加入含有水溶性高分子的水溶液的第二液，得到混合液。使该混合液在油中分散，进而对该液进行例如冷却，由此利用溶胶-凝胶转换等使其凝胶化，得到在油中分散有含有已凝胶化的水溶性高分子的乳剂粒子的G/O型乳剂。另外，在使水溶性高分子在油中分散时利用化学交联使其凝胶化的方式也为优选的方式之一。作为进行分散的方法，可列举例如：间歇振荡法；利用螺旋桨型搅拌机或涡轮型搅拌机、分散机等混合机的方法；胶体磨法；均化器法；超声波照射法等。另外，也可以根据需要应用倾析、离心分离或过滤等将乳剂粒子与油分离，并使乳剂粒子再分散到另行准备的油中，从而制成G/O型乳剂。更优选的分离方法为利用离心分离的分离。进行这样的处理时，可以除去溶解在原料所含的油中的杂质。需要说明的是，第一液中所含的油与再分散时使用的油可以为同一种油，也可以为不同种类的油。
也可以通过向第二液中加入水溶性有效成分而使已凝胶化的水溶性高分子中含有水溶性有效成分。
进一步地，还可以通过将上述的G/O型乳剂混合到用于二次乳化的表面活性剂和水中并利用外水相成分进行分散、乳化来制备将有效成分保持在内水相中的G/O/W型多相乳剂。通过制成G/O/W型多相乳剂，可以使内包有水溶性有效成分的G/O型乳剂分散在水中，可以减少由油分导致的粘腻等并提高使用感。
(透皮吸收剂)
本实施方式的透皮吸收剂含有上述的G/O型乳剂。所述透皮吸收剂可以以上述的G/O/W型多相乳剂的形式含有G/O型乳剂。所述透皮吸收剂由于含有G/O型乳剂，因此缓释性优良。透皮吸收剂的剂型只要为能够维持作为G/O型乳剂的形状的剂型即可，可列举例如液剂(包括洗剂、喷雾剂)、软膏剂、霜剂、凝胶剂、乳液剂、棒剂等各种外用的制剂形态。进一步地，通过将本实施方式的G/O型乳剂的分散液添加到粘合剂、热塑性弹性体中而制备涂敷液并涂布于支撑体和/或剥离衬垫、从而以贴剂的形式使用的方式也为优选方式之一。
在作为透皮吸收剂使用的情况下，可以根据需要添加透皮吸收促进剂、抗氧化剂、增香剂、着色剂等而使用。另外，在作为贴剂使用的情况下，可以进一步添加增粘剂、赋形剂等而使用。贴剂中，G/O型乳剂相对于G/O型乳剂和增粘剂的合计量的含量优选为10质量％以上，更优选为25质量％以上，进一步优选为40质量％以上。
贴剂例如可以通过具有下述的步骤(1)～(3)的方法来制造。
(1)制备G/O型乳剂的步骤；
(2)通过对G/O型乳剂进行浓缩、除去上清液等操作而使G/O型乳剂浓度提高的步骤；
(3)向G/O型乳剂中添加贴合性赋予剂、添加剂而制备涂敷液并将涂敷液涂布在支撑体或剥离衬垫上的步骤。
本实施方式的透皮吸收剂的使用量根据疾病种类、症状程度、患部大小而不同，不能一概地进行规定。通常，通过1天一次至数次地在患部涂抹适量的透皮吸收剂来使用。
实施例
以下列举实施例更详细地说明本发明，但是本发明并非仅限于这些实施例。
(制备例1)
[EGFP(高灵敏度绿色荧光蛋白)的制备]
培养导入了EGFP的大肠杆菌(BL21)，添加异丙基-β-吡喃半乳糖苷(Sigma-Aldrich公司制)，进行4小时的诱导表达。回收大肠杆菌，置换成将pH调节为8.0的超声缓冲液(sonication buffer)(50mM Tris aminomethane(三羟甲基氨基甲烷)(Sigma公司制)、50mM NaCl(和光纯药公司制)、1mM EDTA(和光纯药公司制)和1mM Dithiotheitol(二硫苏糖醇)(Sigma公司制)的混合物)，进行超声波破碎，将上清用于以下的实验。
(实施例1)
[含有EGFP的G/O型乳剂的制备]
将使制备例1中制备的EGFP 700μl和10％明胶溶液300μl(Gelatin from porcineskin(来自猪皮的明胶)，Sigma-Aldrich公司制)混合而成的液体作为A液，将使疏水性表面活性剂ER-290(三菱化学食品株式会社制(商品名)；蔗糖芥酸酯)125mg溶解于肉豆蔻酸异丙酯(IPM和光纯药公司制)2.5ml中而成的液体作为B液。将A液1ml和B液2.5ml混合，用超声波均化器处理10分钟。将得到的混合液在4℃下冷却30分钟，得到乳剂。将得到的乳剂以5000rpm离心分离1分钟后，抽吸除去上清液。加入500μl的IPM使其再分散，制备含有EGFP的G/O型乳剂。
[使用小鼠皮肤的皮肤透过性评价]
使用图1所示的装置进行皮肤透过性评价。图1所示的装置具备扩散池10，所述扩散池10具有：用于保持小鼠皮肤9的保持部1a和1b；设置在保持部1a侧的样品添加口3；设置在保持部1b侧的支撑部5；连接保持部1a和1b的连接部7。将该扩散池10以与支撑部5接触的方式设置在6孔板的1个孔20的底部，将磷酸缓冲生理盐水11加入1个孔20中直至接触到小鼠皮肤9的下表面的程度为止，用于评价。以下对具体的操作方法进行说明。
用剃刀轻轻剃除小鼠后背的毛后，用除毛剂彻底地除去残留的毛，用超纯水清洗皮肤。将小鼠的皮肤整层摘出，用剪刀切成2cm见方左右。将皮肤夹在图1所示的扩散池的保持部中。将扩散池放入6孔板(Thermo Scientific公司制)的1个孔中，添加PBS(磷酸缓冲生理盐水)直至接触到皮肤下表面的程度为止。向样品添加口中添加上述含有EGFP的G/O型乳剂200μl。放入培养箱中，在37℃下静置1天，由此进行透过试验。回收皮肤，用pro-wipe轻轻擦拭表面。将皮肤剪成小块，包埋于OCT复合物(Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.制)中后，在-80℃下冷冻，用切片机制作20μm的组织片。使组织片吸附于载玻片，进行相位差观察和荧光观察。将其结果示于图2。
(比较例1)
除了向样品添加口中添加制备例1中制备的EGFP以外与实施例1同样地进行透过试验，并进行试验后的皮肤的相位差观察和荧光观察。将其结果示于图2。
由图2明确地确认了：与单独使用EGFP的情况(比较例1)相比，在使用含有EGFP的G/O型乳剂的情况下(实施例1)，EGFP渗透到皮肤的深部。
(合成例1)
[包埋有L929细胞的胶原蛋白凝胶的制作]
向猪皮制胶原蛋白(NH Foods株式会社制)中加入超纯水，在4℃下搅拌一晩，由此制备1％胶原蛋白溶液。将L929细胞悬浮液(将培养的L929细胞回收并使其悬浮于培养基中而成)(6×105个细胞)以1000rpm离心分离3分钟，抽吸除去上清液。向以2倍浓度制备的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(赛默飞世尔科技公司制)中添加20％胎牛血清(FetalBovine Serum：FBS bio sera公司制)，制备2倍浓缩DMEM培养基。使L929细胞在按照1：1混合1％胶原蛋白溶液和2倍浓缩DMEM培养基而成的溶液中悬浮。将该悬浮液以1ml/孔添加到12孔板中，在培养箱内静置1小时，由此使其凝胶化。
(实施例2)
[含有bFGF的G/O型乳剂的制备]
向50mM MES缓冲液(和光纯药公司制)中以各自按质量比计达到10：10：6的方式添加肝素(和光纯药公司制)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，株式会社肽研究所公司制)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，和光纯药公司制)，制备肝素浓度为10mg/ml的肝素/EDC/NHS溶液，然后，在室温下静置30分钟。将5％明胶溶液990μl和肝素/EDC/NHS溶液10μl混合。进一步加入10μg/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子；R&D Systems公司制)25μl，将所得液体作为C液。将使疏水性表面活性剂ER-290(三菱化学食品株式会社制(商品名)；蔗糖芥酸酯)50mg溶解于IPM 2.0ml中而成的液体作为D液。将C液1ml和D液2ml混合后，用超声波均化器处理3分钟。接着在4℃下冷却30分钟而得到乳剂。将得到的乳剂以5000rpm离心分离1分钟后，抽吸除去上清液。加入500μl的IPM使其再分散，制备含有bFGF的G/O型乳剂。
[使用培养真皮模型的效价评价]
在合成例1所制作的包埋有L929细胞的胶原蛋白凝胶(培养真皮模型)上放置聚碳酸酯制的环(外径：1.4cm，内径：1.2cm，高度：0.3cm)。向环内添加上述含有bFGF的G/O型乳剂200μl。在环的外侧添加DMEM培养基200μl，放入培养箱内。每天进行培养基更换，对1天后、3天后、5天后的包埋有L929细胞的胶原蛋白凝胶中的DNA量进行定量。DNA的定量如下进行。
将向包埋有L929细胞的胶原蛋白凝胶中加入0.25％胶原酶溶液(和光纯药公司制)1ml而成的液体作为E液。将通过在37℃下振荡1小时左右使凝胶溶解而成的液体作为F液。将各样品以1000rpm离心分离3分钟，抽吸除去上清液。向上述PBS中添加Triton X-100(sigma公司制)而制备添加有0.1％Triton X-100的PBS，用1ml使样品悬浮。在-80℃下冷冻后，在室温下解冻。将该操作重复3次。将赫斯特(Hoechst(注册商标)，赛默飞世尔科技公司制)180μl和样品20μl混合并添加到96孔黑色板中。使用荧光DNA定量试剂盒Cat.#170-2480(BIO-RAD)，在激发滤光器为355nm、吸收滤光器为460nm的条件下通过荧光亮度测定进行DNA的定量。关于荧光测定亮度，进行3次测定，将其平均值作为DNA量。关于DNA的定量，在试验开始前(0天)以及1天后、3天后、5天后、7天后进行测定。将其结果示于表1。
(比较例2)
使用水代替5％明胶溶液，除此以外与实施例2同样地制备含有bFGF的W/O型乳剂。除了使用所得到的含有bFGF的W/O型乳剂以外，与实施例2同样地使用培养真皮模型进行DNA量的定量。将其结果示于表1。
(比较例3)
除了直接使用bFGF以外，与实施例2同样地使用培养真皮模型进行DNA量的定量。将其结果示于表1。
(比较例4)
将10μg/ml的bFGF用DMEM稀释1000倍，制备添加有10ng/ml的bFGF的培养基。除了使用所得到的添加有bFGF的培养基200μl以外，与实施例2同样地使用培养真皮模型进行DNA量的定量。将其结果示于表1。
由表1可明确得知：在使用含有bFGF的W/O型乳剂的情况下(比较例2)，3天后的DNA量多，但是5天以后DNA的增加量减少。认为其原因是：在培养初期，从W/O型乳剂中一次性释放出大量的bFGF，培养基中的浓度变高，增殖得到促进，但是，bFGF的稳定性非常差，随着时间的经过，bFGF耗尽，导致在5天以后细胞的增加量减少。若在生物体内一次性释放大量的有效成分，则有效成分随着体内的水分、血液迅速地扩散，希望发挥效果的部位的有效性浓度实质上降低，发生效果不持续的情况。另一方面，在使用含有bFGF的G/O型乳剂的情况下(实施例2)，3天后的DNA量少于比较例2、3和4，但是7天后的DNA量则多于比较例2、3和4中的任一者。由此可知，含有bFGF的G/O型乳剂的bFGF的缓释性优良、并且bFGF被稳定化。因此在体内也可期待有效成分被稳定化且被缓慢释放、有效成分浓度恒定化、效果持续。
[表1]
Figure BDA0002860439180000141
(实施例3)
向环己烷2ml中加入150mg疏水性表面活性剂ER-290，进一步混合5％明胶溶胶1ml，用超声波均化器处理10分钟。处理后在4℃下冷却3天，得到乳剂。将得到的乳剂以5000rpm离心分离1分钟后，抽吸除去上清液。以使所得到的粒子达到1mg/ml的浓度的方式添加IPM使其再分散，制备G/O型乳剂。对于所得到的G/O型乳剂，通过动态光散射法(Zetasizer Nano-ZS，马尔文帕纳科公司制)测定凝胶粒子的平均粒径。使用IPM(折射率1.434)使G/O型乳剂分散并导入玻璃池中，在温度20℃下测定5次，将峰值的平均值作为平均粒径。将其结果示于表2。
(实施例4)
使用L-195(三菱化学食品公司制)作为表面活性剂，除此以外与实施例3同样地制备G/O型乳剂。对于所得到的G/O型乳剂，测定凝胶粒子的平均粒径，将结果示于表2。
(实施例5)
使用O-170(三菱化学食品公司制)作为表面活性剂，除此以外与实施例3同样地制备G/O型乳剂。对于所得到的G/O型乳剂，测定凝胶粒子的平均粒径，将结果示于表2。
[表2]
平均粒径
实施例3 161nm
实施例4 353nm
实施例5 253nm
由表2可明确得知：任一G/O型乳剂中凝胶粒子的平均粒径均为600nm以下。
(实施例6)
[含有bFGF的G/O型乳剂的制备-2]
向50mM MES缓冲液(和光纯药公司制)中以各自按质量比计达到10：10：6的方式添加肝素(和光纯药公司制)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，株式会社肽研究所公司制)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，和光纯药公司制)，制备肝素浓度为10mg/ml的肝素/EDC/NHS溶液，然后，在室温下静置30分钟。将5％明胶溶液495μl和肝素/EDC/NHS溶液5μl混合，进一步加入10μg/ml bFGF溶液(碱性成纤维细胞生长因子；R&D Systems公司制)25μl，将所得液体作为C-2液。将使疏水性表面活性剂ER-290(三菱化学食品株式会社制(商品名)；蔗糖芥酸酯)25mg溶解于IPM 1.0ml中而成的液体作为D-2液。将C-2液500μl和D-2液1ml混合后，用超声波均化器处理3分钟。接着在4℃下冷却30分钟而得到乳剂。将得到的乳剂以5000rpm离心分离2分钟后，抽吸除去上清液，由此得到肝素浓度为50μg/ml、bFGF浓度为250ng/ml的含有bFGF的G/O型乳剂。
[使用小鼠的诱导血管新生的效果的评价]
用异氟烷对无毛小鼠实施麻醉后，用70％乙醇对后背进行灭菌，接着用灭菌生理盐水清洗灭菌部。然后，在灭菌后的无毛小鼠的后背上涂布[含有bFGF的G/O型乳剂的制备-2]中制备的G/O型乳剂约1ml，从上部覆盖用IPM 250μl润湿后的1.5×3.0cm的灭菌纱布，用外科用绷带粘贴固定。休养2天后除去纱布，用灭菌生理盐水清洗无毛小鼠的后背。将涂布、休养2天的操作进一步重复3次后，摘出小鼠的受试部的皮肤作为试样，进行以下所示的HE染色观察和血红蛋白指标的测定。
[HE(苏木精-伊红)染色观察]
按照常规方法利用HE液对皮肤摘出试样进行染色，通过光学显微镜以倍率10倍进行观察。将其结果示于图3。
[血红蛋白指标的测定]
摘出受试小鼠的后背皮肤，将摘出的皮肤用大量的生理盐水清洗，洗掉附着在皮肤表面的血液。然后，将清洗后的皮肤用剪刀剪碎，将皮肤转移到1.5ml的样品管中，添加超纯水1ml，在4℃下静置1天。用40μm的过滤器进行过滤，测定滤液的吸光度。皮肤组织所包含的血管中的血红蛋白的吸光度在波长415nm附近具有峰，因此，将360nm至470nm的吸光度的基线进行线性近似，将波长415nm处的吸光度相对于基线的增量作为试样中的血红蛋白的吸光度(参照图4)。将这样求出的皮肤试样中血红蛋白的吸光度相对于皮肤试样重量进行换算，作为血红蛋白指标。将其结果示于表3。认为：血红蛋白指标越大，则越诱导血管新生。
(比较例5)
除了没有涂布G/O乳剂以外，进行与实施例6相同的操作，并进行HE染色观察和血红蛋白指标的测定。将其结果示于图3、图4和表3。
[表3]
实施例6 比较例5
血红蛋白指标 8.76 2.59
由表3可明确得知：相对于比较例5，实施例6的血红蛋白指标提高，表明通过涂布含有bFGF的G/O乳剂诱导了血管新生。
符号说明
1a，1b…保持部、3…样品添加口、5…支撑部、7…连接部、9…小鼠皮肤、10…扩散池、11…磷酸缓冲生理盐水、20…孔。

Claims (6)

1.一种油包凝胶型乳剂，其含有已凝胶化的水溶性高分子、油和表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的油包凝胶型乳剂，其中，已凝胶化的水溶性高分子中含有水溶性有效成分。
3.根据权利要求2所述的油包凝胶型乳剂，其中，水溶性有效成分为生长因子。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的油包凝胶型乳剂，其中，已凝胶化的水溶性高分子为已凝胶化的生物来源高分子。
5.根据权利要求4所述的油包凝胶型乳剂，其中，生物来源高分子为胶原蛋白或明胶。
6.一种透皮吸收剂，其含有权利要求1～5中任一项所述的油包凝胶型乳剂。
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