CN112716989A - 一种芹菜籽提取物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种芹菜籽提取物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及天然药物化学及食品医药技术领域，具体涉及一种芹菜籽提取物及其制备方法与应用，所述芹菜籽提取物的组成为芹菜苷和芹菜素，所述制备方法包括将芹菜籽粉碎成芹菜籽粉末，用有机溶剂提取并除去其中的挥发油类化合物，然后将芹菜籽使用乙醇–水溶液进行提取、浓缩，柱层析得到芹菜籽提取物。得到芹菜籽中的降血尿酸的精确的有效成分，操作简单，提取物作用明确，制备工艺简单，得到的芹菜籽提取物成分清晰，能够用于保健食品或预防药物或营养品，预防和治疗人体多种疾病，如降低血尿酸，缓解和治疗通风，预防痛风等。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物化学及食品医药技术领域，具体涉及一种芹菜籽提取物的的制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
芹菜有水芹和旱芹之分，为伞形科植物ApiumgrauensL.var.dulcedc.的全称。既是我们餐桌上的日常佳肴，又可供药用。芹菜籽取自芹菜小小的花朵中，因而种子的体形也非常之小，呈卵形，颜色多为棕褐色或深棕色，含桉油醇、磷甲氧基酚、伞花内酯、芹菜素、亚麻酸、挥发性油脂、黄酮、硼，矿物质如：钙、镁、钠、锌。芹菜籽所含降压、降脂成分是芹菜的50倍，短期服用起到降血压，降血脂的作用，长期服用远远优于其他中西药品，无任何毒副作用。芹菜籽有降血压、降血脂的作用，对风温症、风湿关节炎、痛风、高尿酸症等都有舒解作用。维吾尔医生认为芹菜籽有散气、消肿、利尿、开通阻滞、降血压等功效，在维吾尔药中主要用于治疗高血压、关节炎、类风湿关节炎、气滞性子宫炎、腹水、肾脏等疾病。国内大多数研究人员主要对芹菜的根、茎、叶提取物进行相关的研究和报道，涉及到芹菜籽提取物的相关精细研究较少。
有研究表明，芹菜籽中含有香豆素类化合物为：伞形花内酯，花椒毒酚，佛手柑内脂，5，8-二甲氧基-6,7-呋喃香豆素，6-甲氧基-7-羟基香豆素，异茴芹内酯；黄酮类化合物为：柯伊利素，木犀草素-3C-O-β-D-葡萄糖苷，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，香叶木-7-O-β-D-葡萄糖苷，柯伊利素，豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷，芹菜素，芹菜苷。
现有技术中芹菜籽中有效成分的提取方法存在提取工艺复杂，得到的产物效果不明显等问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种芹菜籽提取物及其制备方法，将已用特定有机溶剂提取过的芹菜籽再次用乙醇溶液提取，得到芹菜籽乙醇提取粗品，将得到的芹菜籽粗提物使用柱层析方法进行精致，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集特定馏分，浓缩后得芹菜籽提取物。
本发明的提取方法能够克服现有技术中从芹菜籽中提取有效成分时有效成分不明确的技术问题。本发明针对芹菜籽提出的提取方法，得到的芹菜籽提取物有效成分清晰，且成分中以芹菜苷为主，芹菜苷含量高，在80％以上，杂质含量少，可以实现低剂量芹菜籽提取物显著的减低大鼠血清尿酸量的效果。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供一种芹菜籽提取物，所述芹菜籽提取物中成分以芹菜苷为主，所述芹菜苷的含量在80％以上；优选的，所述芹菜籽提取物中还存在芹菜素。
在本发明的第二方面，提供一种第一方面所述芹菜籽提取物的制备方法，包括如下步骤：
1)取芹菜干燥种子，粉碎成芹菜籽粉末；
2)用有机溶剂提取并除去芹菜籽中的挥发油类化合物；
3)将步骤2)有机溶剂提取后的芹菜籽浸泡在提取剂中，室温浸泡提取或回流提取；所述提取剂为乙醇或乙醇的水溶液；
4)将步骤3)得到的乙醇–水提取物浓缩，柱层析得到芹菜籽提取物。
在本发明的第三方面，提供一种第一方面所述芹菜籽提取物或者第二方面所述制备方法制得的芹菜籽提取物在制备降低尿酸的预防药物、营养品和食品中的应用。
本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
本发明的实施方式可以通过特定的提取条件，得到芹菜苷含量高于80％的的芹菜籽提取物；
制备工艺简单，得到的芹菜籽提取物成分清晰，可以实现低剂量显著的减低大鼠血清尿酸量的效果。
本发明的实施方式得到的芹菜籽提取物用于保健食品或预防药物或营养品能够预防和治疗人体多种疾病，如降低血尿酸，缓解和治疗通风，预防痛风。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1得到的芹菜籽提取物01的色谱图；
图2为实施例8得到的芹菜籽提取物08的色谱图；
图3为实施例6得到的芹菜籽提取物06的色谱图；
图4为实施案例1芹菜籽提取物01进一步纯化后得到的芹菜苷核磁氢谱图；
图5为实施案例6芹菜籽提取物06进一步纯化后得到的芹菜素核磁氢谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一种实施方式中，提供一种芹菜籽提取物，所述芹菜籽提取物中成分以芹菜苷为主，所述芹菜苷的含量在80％以上；优选的，所述芹菜籽提取物中还存在芹菜素。
本发明的一种实施方式中，提供一种芹菜籽提取物的制备方法，包括如下步骤：
1)取芹菜干燥种子，粉碎成芹菜籽粉末；
2)用有机溶剂提取并除去芹菜籽中的挥发油类化合物；
3)将步骤2)有机溶剂提取后的芹菜籽浸泡在提取剂中，室温浸泡提取或回流提取；所述提取剂为乙醇或乙醇的水溶液；
4)将步骤3)得到的乙醇–水提取物浓缩，柱层析得到芹菜籽提取物。
在一种具体的实施方式中，步骤2)的具体操作步骤为：取芹菜干燥种子，粉碎，细磨成细粉，加入5–10倍体积量于干燥芹菜籽的有机溶剂，室温浸泡提取1次或者回流提取3次；每次室温浸泡时间为16小时或回流时间为1.5小时，抽滤后得到的芹菜籽滤饼晾干备用；
优选的，所述有机溶剂为：乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙醚和乙腈中一种或多种的组合；进一步优选为乙酸乙酯。
优选的，室温浸泡提取和回流提取的步骤均设有磁力搅拌辅助。
在一种具体的实施方式中，步骤3)的具体操作步骤为：取步骤2)中晾干后的芹菜籽滤饼，向滤饼中加入提取剂室温浸泡提取3–5次或者回流提取3–5次，每次加入提取剂的量为芹菜干燥种子5–10倍体积量；每次室温浸泡时间为5–12小时或回流时间为1–3小时；合并得到的提取剂，减压浓缩得芹菜籽浸膏；
加热回流与冷浸的不同会影响芹菜籽粉中芹菜苷和芹菜素的溶出，使提取出的芹菜苷和芹菜素含量不同，发明人通过实验证明芹菜籽提取物的芹菜苷与芹菜素相对含量与使用的乙醇浓度有正相关性，与温度有负相关性；因此本发明实施例中优选的提取剂可以最大限度地将芹菜籽中的芹菜苷提取出来，而其他成分如芹菜素的含量较少。
加热会加快芹菜籽粉中芹菜素和芹菜苷的溶出速度，故加热会使芹菜籽精制物含量高于冷浸。芹菜苷苷键在热水中会水解，得到芹菜素，而芹菜苷苷键在冷浸过程中不会断裂，因此冷浸条件下得到的芹菜籽提取物中芹菜素含量少，几乎检测不到；而加热回流条件下得到的芹菜籽提取物中同时含有芹菜素和芹菜苷。
优选的，所述提取剂为乙醇或乙醇的水溶液，其中，所述乙醇的水溶液为95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、60％乙醇、40％乙醇和水中的任意一种；进一步优选的，所述乙醇的水溶液为95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、60％乙醇中的任意一种。
优选的，室温浸泡提取和回流提取的步骤均设有磁力搅拌辅助。
在一种具体的实施方式中，步骤4)中的柱层析为硅胶柱层析、酸性三氧化二铝柱层析、聚酰胺柱层析或大孔吸附树脂柱层析中的任意一种；
在一种更为具体的实施方式中，步骤4)的具体操作步骤为：步骤3)中得到的芹菜籽浸膏以重量比1-3倍量的硅胶拌样，35-50倍量的硅胶装柱；
梯度洗脱：先用石油醚洗脱5–10个柱体积，除去流分，再用体积比1:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂洗脱8–15个柱体积，收集流分，再用乙酸乙酯洗脱8–15个柱体积，收集流分，再用体积比为5％的甲醇和乙酸乙酯混合溶剂洗脱5–10个柱体积，收集流分，最后用体积比为10％的甲醇和乙酸乙酯混合溶剂洗脱5–10个柱体积，收集流分并检测，将收集的相同组分流分合并，减压浓缩，得到最终产物。
本发明的一种实施方式中，提供了一种上述制备方法制备的芹菜籽提取物。
本发明的制备方法制备的芹菜籽提取物可用于制备通过降血尿酸以达到预防、缓解和/或防治痛风症状的相关疾病的保健食品、营养品或预防药物。
本发明的一种实施方式中，提供了一种上述芹菜籽提取物在制备降低尿酸的预防药物、营养品和食品中的应用。
在一种具体的实施方式中，降低尿酸的预防药物包含本发明实施例所述芹菜籽提取物及药学上可接受的辅料；
在一种具体的实施方式中，降低尿酸的营养品中包含本发明实施例所述芹菜籽提取物及其他可用于营养品的辅料；
在一种具体的实施方式中，降低尿酸的食品中包含本发明实施例所述芹菜籽提取物及其他食品成分。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。
实施例1
将20克芹菜籽粉碎，细磨，加入3倍芹菜籽粉末体积的有机溶剂乙酸乙酯，室温搅拌5.0h，过滤得到芹菜籽渣，重复3次，合并芹菜籽渣，晾干备用。
取上述晾干后的芹菜籽渣，加入质量分数为100％的乙醇80℃回流1.5个小时，过滤，得到乙醇提取溶液，重复加入该乙醇回流提取3次，将得到的提取液合并，减压浓缩，得到芹菜籽乙醇粗提取物。
按重量比1倍量的硅胶拌样，35倍量的硅胶装柱，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集各流分，分析合并含有芹菜素/芹菜苷的组分，减压浓缩后即可得到芹菜籽提取精制物1.3克，即芹菜籽提取物01。
经检测芹菜籽提取物中芹菜苷的含量在83％，芹菜素含量可以忽略不计。
取0.5g芹菜籽精制提取物01按重量比1倍量的硅胶拌样，50倍量的硅胶装柱，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，TLC检测流分，回收相同流分，减压浓缩后得到芹菜苷标准品化合物。
实施例2
将40克芹菜籽粉碎，细磨，加入3倍芹菜籽粉末体积的有机溶剂乙酸乙酯，室温搅拌5.0h，过滤得到芹菜籽渣，重复3次，合并芹菜籽渣，晾干备用。
取上述晾干后的芹菜籽渣，加入质量分数为95％的乙醇80℃回流1.5个小时，过滤，得到乙醇提取溶液，重复加入该乙醇回流提取3次，将得到的提取液合并，减压浓缩，得到芹菜籽乙醇粗提取物。
按重量比1倍量的硅胶拌样，35倍量的硅胶装柱，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集各流分，分析合并含有芹菜素/芹菜苷的组分，减压浓缩后即可得到芹菜籽提取精制物2.0克，即芹菜籽提取物02。
经检测芹菜籽提取物中芹菜苷的含量在87％，芹菜素含量小于2％。
实施例3
将20克芹菜籽粉碎，细磨，加入3倍芹菜籽粉末体积的有机溶剂乙酸乙酯，室温搅拌5.0h，过滤得到芹菜籽渣，重复3次，合并芹菜籽渣，晾干备用。
取上述晾干后的芹菜籽渣，加入质量分数为90％的乙醇80℃回流1.5个小时，过滤，得到乙醇提取溶液，重复加入该乙醇回流提取3次，将得到的提取液合并，减压浓缩，得到芹菜籽乙醇粗提取物。
按重量比1倍量的硅胶拌样，35倍量的硅胶装柱，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集各流分，分析合并含有芹菜素/芹菜苷的组分，减压浓缩后即可得到芹菜籽提取精制物0.96克，即芹菜籽提取物03。
经检测芹菜籽提取物中芹菜苷的含量在55％，芹菜素的含量为27％。
实施例4
将10克芹菜籽粉碎，细磨，加入3倍芹菜籽粉末体积的有机溶剂乙酸乙酯，室温搅拌5.0h，过滤得到芹菜籽渣，重复3次，合并芹菜籽渣，晾干备用。
取上述晾干后的芹菜籽渣，加入质量分数为80％的乙醇溶液80℃回流1.5个小时，过滤，得到乙醇提取溶液，重复加入该乙醇溶液回流提取3次，将得到的提取液合并，减压浓缩，得到芹菜籽乙醇粗提取物。
按重量比1.5倍量的硅胶拌样，35倍量的硅胶装柱，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集各流分，分析合并含有芹菜素/芹菜苷的组分，减压浓缩后即可得到芹菜籽乙醇提取精制物0.45克，即芹菜籽提取物04。
经检测芹菜籽提取物中芹菜苷的含量为45％，芹菜素含量为32％。
实施例5
将10克芹菜籽粉碎，细磨，加入3倍芹菜籽粉末体积的有机溶剂乙酸乙酯，室温搅拌5.0h，过滤得到芹菜籽渣，重复3次，合并芹菜籽渣，晾干备用。
取上述晾干后的芹菜籽渣，加入质量分数为60％的乙醇80℃回流1.5个小时，过滤，得到乙醇提取溶液，重复加入该乙醇回流提取3次，将得到的提取液合并，减压浓缩，得到芹菜籽乙醇粗提取物。
按重量比1.5倍量的硅胶拌样，35倍量的硅胶装柱，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集各流分，分析合并含有芹菜素/芹菜苷的组分，减压浓缩后即可得到芹菜籽乙醇提取精制物0.3克，即芹菜籽提取物05。
经检测芹菜籽提取物中芹菜苷的含量在10％，芹菜素含量为73％。
实施例6
将20克芹菜籽粉碎，细磨，加入3倍芹菜籽粉末体积的有机溶剂乙酸乙酯，室温搅拌5.0h，过滤得到芹菜籽渣，重复3次，合并芹菜籽渣，晾干备用。
取上述晾干后的芹菜籽渣，加入质量分数为40％的乙醇80℃回流1.5个小时，过滤，得到乙醇提取溶液，重复加入该乙醇回流提取3次，将得到的提取液合并，减压浓缩，得到芹菜籽乙醇粗提取物。
按重量比1.5倍量的硅胶拌样，35倍量的硅胶装柱，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集各流分，分析合并含有芹菜素/芹菜苷的组分，减压浓缩后即可得到芹菜籽乙醇提取精致物0.24克，即芹菜籽提取物06。
经检测芹菜籽提取物中芹菜素含量为85％，芹菜苷的含量可以忽略不计。
取0.2g芹菜籽精制提取物06按重量比1倍量的硅胶拌样，50倍量的硅胶装柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC检测流分，回收相同流分，减压浓缩后得到芹菜素标准品化合物。实施例7
将20克芹菜籽粉碎，细磨，加入3倍芹菜籽粉末体积的有机溶剂乙酸乙酯，室温搅拌5.0h，过滤得到芹菜籽渣，重复3次，合并芹菜籽渣，晾干备用。
取上述晾干后的芹菜籽渣，加入质量分数为100％的乙醇冷浸18个小时，过滤，得到乙醇提取溶液，将得到的提取液合并，减压浓缩，得到芹菜籽乙醇粗提取物。
按重量比1倍量的硅胶拌样，35倍量的硅胶装柱，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集各流分，分析合并含有芹菜素/芹菜苷的组分，减压浓缩后即可得到芹菜籽提取精制物0.22克，即芹菜籽提取物07。
经检测芹菜籽提取物中芹菜苷的含量在85％，芹菜素的含量可以忽略不计。
实施例8
将20克芹菜籽粉碎，细磨，加入3倍芹菜籽粉末体积的有机溶剂乙酸乙酯，室温搅拌5.0h，过滤得到芹菜籽渣，重复3次，合并芹菜籽渣，晾干备用。
取上述晾干后的芹菜籽渣，加入质量分数为80％的乙醇冷浸18个小时，过滤，得到乙醇提取溶液，将得到的提取液合并，减压浓缩，得到芹菜籽乙醇粗提取物。
按重量比1倍量的硅胶拌样，35倍量的硅胶装柱，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集各流分，分析合并含有芹菜素/芹菜苷的组分，减压浓缩后即可得到芹菜籽提取精制物0.70克，即芹菜籽提取物08。
经检测芹菜籽提取物中芹菜苷的含量在80％，芹菜素的含量可以忽略不计。
实施例9
将20克芹菜籽粉碎，细磨，加入3倍芹菜籽粉末体积的有机溶剂乙酸乙酯，室温搅拌5.0h，过滤得到芹菜籽渣，重复3次，合并芹菜籽渣，晾干备用。
取上述晾干后的芹菜籽渣，加入质量分数为60％的乙醇冷浸18个小时，过滤，得到乙醇提取溶液，将得到的提取液合并，减压浓缩，得到芹菜籽乙醇粗提取物。
按重量比1倍量的硅胶拌样，35倍量的硅胶装柱，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集各流分，分析合并含有芹菜素/芹菜苷的组分，减压浓缩后即可得到芹菜籽提取精制物0.45克，即芹菜籽提取物09。
经检测芹菜籽提取物中芹菜苷的含量在85％，芹菜素的含量可以忽略不计。
实施例10
将10克芹菜籽粉碎，细磨，加入1倍芹菜籽粉末体积的有机溶剂乙酸乙酯，室温搅拌5.0h。过滤得到芹菜籽渣，重复3次，合并芹菜籽渣，晾干备用。
取上述晾干后的芹菜籽渣，加入60％乙醇加热回流1.5个小时，过滤，得到乙醇提取溶液，重复加入该乙醇回流提取3次，将得到的提取液合并，减压浓缩，得到芹菜籽乙醇粗提取物2.0克，即芹菜籽粗提取物10。
高尿酸血症的造模：
对氧嗪酸钾盐制小鼠高尿酸血症模型：连续给药7天，小鼠采用腹腔注射对氧嗪酸钾盐造成小鼠高尿酸血症，小鼠血清UA升高。前述提取物01，05，10以5g/kg或10.0g/kg剂量喂食给药5或10天，小鼠对照阳性参照，01和05都可以使UA显著下降。10没有明显下降。
对腺嘌呤和乙胺丁醇制大鼠高尿酸血症模型：大鼠采取连续灌胃腺嘌呤和乙胺丁醇7天，造模的大鼠血清UA显著升高，选用前述提取物01，05，10以5g/kg或10.0k/kg喂食给药5天或10天，01和05可以显著降低大鼠血清尿素氮BUN水平，血清的肌酸CRE水品和血清的UA值。对照言行参照10效果不够明显。
实验例11芹菜籽提取精制物对氧嗪酸钾盐所致小鼠高尿酸血症的研究
高尿酸血症的给药：
芹菜籽提取物对氧嗪酸钾盐所致小鼠高尿酸症模型的影响：ICR小鼠45只，SPF雄性，体重24.1-27.9g，按体重随机分为9组，分别为A：正常对照组；B：模型对照组；C：别嘌醇组；D：芹菜素；E：芹菜苷；F：香豆素；G:芹菜籽提取精制物01组；H：芹菜籽提取精制物05组；I：芹菜籽提取浸膏10组。芹菜素组、芹菜苷组、芹菜籽提取物组(5g/kg)，每组5只动物。C组给予别嘌醇2.4mg/100g；D、E、F组分别给予芹菜素、芹菜苷和香豆素5g/kg，G、H、I组分别给予芹菜籽提取精制物01组、05组和芹菜籽提取浸膏10组5g/kg。各组小鼠按20mL/kg灌胃给予相应剂量的药液，正常对照组灌胃给予等体积的蒸馏水，模型对照组灌胃给予等体积的花生油，1次/日，连续7天。末次给药前禁食不禁水12h，给药前1h，除正常对照组外，其余各组小鼠腹腔注射液氧嗪酸钾盐300mg/kg，各组小鼠分别于造模前及末次给药1h后，眼眶静脉丛采血，检测血清尿酸水平，结果见表1。
表1芹菜籽提取物对氧嗪酸钾盐所致小鼠高尿酸血症模型的影响
注：与阳性对照组相比Pa<0.05，Pb<0.01，与别嘌醇片组相比Pc<0.05.
实验中所用芹菜素标准品(CAS：520-36-5)，芹菜苷标准品(CAS：26544-34-3)，香豆素标准品(CAS：92-61-5)购自Aldrich。
芹菜籽提取物对氧嗪酸钾盐所致高尿酸血症模型的影响：连续给药7天，小鼠采用腹腔注射氧嗪酸钾复制高尿酸血症模型，造模后小鼠血清UA显著升高；芹菜素、芹菜苷、芹菜籽提取精制物01、05均能显著降低小鼠造模后血清UA水平，且造模后芹菜素、芹菜苷、芹菜籽提取精制物01、05均能显著减小造模后小鼠血清UA升高程度。
实验例12芹菜籽提取精制物高剂量对氧嗪酸钾盐所致小鼠高尿酸血症的研究
高尿酸血症的给药：
芹菜籽提取物对氧嗪酸钾盐所致小鼠高尿酸症模型的影响：ICR小鼠45只，SPF雄性，体重24.1-27.9g，按体重随机分为9组，分别为A：正常对照组；B：模型对照组；C：别嘌醇组；D：芹菜素；E：芹菜苷；F：香豆素；G:芹菜籽提取精制物01组；H：芹菜籽提取精制物05组；I：芹菜籽提取浸膏10组。芹菜素组、芹菜苷组、芹菜籽提取物组(10g/kg)，每组5只动物。C组给予别嘌醇39mg/kg；D、E、F组分别给予芹菜素、芹菜苷和香豆素10g/kg，G、H、I组分别给予芹菜籽提取精制物01组、03组和芹菜籽提取浸膏05组10g/kg。各组小鼠按20mL/kg灌胃给予相应剂量的药液，正常对照组灌胃给予等体积的蒸馏水，模型对照组灌胃给予等体积的花生油，1次/日，连续7天。末次给药前禁食不禁水12h，给药前1h，除正常对照组外，其余各组小鼠腹腔注射液氧嗪酸钾盐300mg/kg，各组小鼠分别于造模前及末次给药1h后，眼眶静脉丛采血，检测血清尿酸水平，结果见表2。
表2芹菜籽提取物对氧嗪酸钾盐所致小鼠高尿酸血症模型的影响
注：与阳性对照组相比Pa<0.05，Pb<0.01，与别嘌醇片组相比Pc<0.05.
芹菜籽提取物对氧嗪酸钾盐所致高尿酸血症模型的影响：连续给药7天，小鼠采用腹腔注射氧嗪酸钾复制高尿酸血症模型，造模后小鼠血清UA显著升高；芹菜素、芹菜苷、芹菜籽提取精制物01、05均能显著降低小鼠造模后血清UA水平，且造模后芹菜素、芹菜苷、芹菜籽提取精制物01、05均能显著减小造模后小鼠血清UA升高程度，低剂量组与阳性对照组相比具有差异性，高剂量组与阳性对照组相比具有显著差异性，高剂量组与现有别嘌醇片组相比效果更优。
实验例13芹菜籽提取精制物对腺嘌呤和乙胺丁醇所致大鼠高尿酸血症的研究
高尿酸血症的给药：
芹菜籽提取物对腺嘌呤和乙胺丁醇所致大鼠高尿酸症模型的影响：ICR大鼠40只，SPF雄性，体重198.0-210.0g，按体重随机分为8组，分别为A：正常对照组；B：模型对照组；C：别嘌醇组；D：芹菜素；E：芹菜苷；F：香豆素组；G:芹菜籽提取精制物01组；H：芹菜籽提取精制物05组。芹菜素组、芹菜苷组芹菜籽提取物组(5g/kg)，每组5只动物。C组给予别嘌醇27mg/1kg；D、E、F组分别给予芹菜素、芹菜苷和香豆素5g/1kg，G、H组分别给予芹菜籽提取精制物01和05各5g/kg。各组大鼠按10mL/kg灌胃给予相应剂量的药液，正常对照组灌胃给予等体积的蒸馏水，模型对照组灌胃给予等体积的花生油，1次/日，连续17天。除正常对照组外，其余各组大鼠均与给药第10天上午开始灌胃腺嘌呤300mg/kg和乙醇丁胺(250mg/kg)，复制大鼠高尿素血症模型，下午按10ml/kg灌胃给予相应药液。末次给药前禁食不禁水12h，末次给药1h后，眼眶静脉丛采血，检测血清尿酸水平，结果见表3。
表3芹菜籽提取精制物对腺嘌呤和乙胺丁醇所致大鼠高尿酸血症的影响
注：与阳性对照组相比Pa<0.05，Pb<0.01，与别嘌醇片组相比Pc<0.05.
芹菜籽提取物对腺嘌呤和乙胺丁醇所致高尿酸血症模型的影响：大鼠采用连续7天灌胃给予腺嘌呤加乙醇丁胺复制高尿素血症模型，造模后大鼠血清UA显著升高，芹菜素、芹菜苷、香豆素和芹菜籽提取精制物01和05均能显著降低模型大鼠血清尿素氮BUN水平、血清肌酸CRE水平和血清UA水平。
从实验结果可以看出实施例1得到的芹菜籽提取精制物01组对腺嘌呤和乙胺丁醇所致大鼠高尿酸血症的治疗效果比实施例5得到的芹菜籽提取精制物05组效果好。
实验例14芹菜籽提取精制物对腺嘌呤和乙胺丁醇所致大鼠高尿酸血症的研究
高尿酸血症的给药：
芹菜籽提取物对腺嘌呤和乙胺丁醇所致大鼠高尿酸症模型的影响：ICR大鼠40只，SPF雄性，体重198.0-210.0g，按体重随机分为8组，分别为A：正常对照组；B：模型对照组；C：别嘌醇组；D：芹菜素；E：芹菜苷；F：香豆素；G:芹菜籽提取精制物01组；H：芹菜籽提取精制物05组。芹菜素组、芹菜苷组、香豆素组芹菜籽提取物组(10g/kg)，每组5只动物。C组给予别嘌醇27mg/1kg；D、E、F组分别给予芹菜素、芹菜苷和香豆素10g/1kg，G、H组分别给予芹菜籽提取精制物01和05各10g/kg。各组大鼠按10mL/kg灌胃给予相应剂量的药液，正常对照组灌胃给予等体积的蒸馏水，模型对照组灌胃给予等体积的花生油，1次/日，连续17天。除正常对照组外，其余各组大鼠均与给药第10天上午开始灌胃腺嘌呤300mg/kg和乙醇丁胺(250mg/kg)，复制大鼠高尿素血症模型，下午按10ml/kg灌胃给予相应药液。末次给药前禁食不禁水12h，末次给药1h后，眼眶静脉丛采血，检测血清尿酸水平，结果见表4。
表4芹菜籽提取精制物对腺嘌呤和乙胺丁醇所致大鼠高尿酸血症的影响
注：与阳性对照组相比Pa<0.05，Pb<0.01，与别嘌醇片组相比Pc<0.05.
从实验结果可以看出实施例1得到的芹菜籽提取精制物01组对腺嘌呤和乙胺丁醇所致大鼠高尿酸血症的治疗效果比实施例5得到的芹菜籽提取精制物05组效果好。
实验例15芹菜籽提取物抗急性痛风的研究
实验动物模型建立及分组给药
将70只大鼠随机分为7组(n＝10)，包括正常对照组大鼠(CTRL)和模型组大鼠(MC组)，用5mL/kg生理盐水进行灌胃。阳性对照组为秋水仙碱(COL)。将COL溶于生理盐水中，给药剂量为0.4mg/kg，给药体积为5mL/kg。给药组分别用0.04g/kg和0.16g/kg(约相当于0.5g和2g芹菜籽)芹菜籽提取精制物01组。进行灌胃，方法为用40mg和160mg芹菜籽提取精制物01组溶于5m L生理盐水/PEG 300/TWIN 20等体积比的混合液中，所有给药组每天均灌胃给药一次，给药时间为8天。
给药的第6天，在下午4:00向大鼠右侧踝关节滑膜间隙注射0.1mL 30mg/mL尿酸钠晶体(MSU)，持续3天。正常对照大鼠注射同等体积的生理盐水处理。
踝关节肿胀度的测量
利用游标卡尺测定注射尿酸钠晶体后0h，24h和48h时所有大鼠右侧的踝关节周长肿胀率(％)。肿胀率计算如下：
Ct表示不同时间大鼠踝关节的周长，C0表示0h时大鼠踝关节的周长。
组织样品的收集
在最后一次给药后1h且在安乐死之前，从大鼠的尾静脉采集血样。将采集的血样静置30min后，进行离心。离心的速度是3000r/min，共离心两次，第一次为10分钟，第二次为5分钟，离心后取上清。将离心后的上清放置于-80℃环境保存。
炎症相关的生化指标检测
利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠血清中与炎症相关的生化因子：IL-1β、IL-6、IL-10、MCP-1、TNF-α。
踝关节病理切片的制作
在大鼠安乐死后，收集每只大鼠的右脚踝并在4％多聚甲醛中进行固定。固定后，用10％EDTA脱钙，随后用不同浓度的酒精进行脱水处理。经过脱钙，脱水处理后，将样品包埋在石蜡中，切成厚度为5μm的切片。切片完成后用二甲苯除去切片中含有的石蜡，并用苏木精和伊红(H&E)染色。
数据处理及统计
所有数据均表示为平均值±标准偏差(Mean±S.D)，并且通过单因素方差分析(ANOVA)计算，然后使用SPSS16.0软件进行处理，并进行post-hoc Dunn's多重比较分析。实验结果中显著性定义为P<0.05。
实验结果：
在注射尿酸钠晶体后的24h，48h。相较于正常对照组，模型组急性痛风性关节炎大鼠右踝关节的肿胀度均显著增加，分别为：275％，120％(P<0.01)，这个结果表明在大鼠右踝关节注射尿酸钠晶体成功建立了大鼠急性痛风性关节炎模型。我们还观察到，0.4mg/kg的COL不能够抑制尿酸钠晶体导致的踝关节肿胀(P>0.05)。在24h时，给药组未能抑制尿酸钠晶体引起的肿胀(P>0.05)。在注射尿酸钠晶体后的第48h时，160mg/kg剂量的给药组能够显著抑制尿酸钠晶体引起的踝关节肿胀，相较于模型组肿胀度减少了63.6％(P<0.05)。
依据ELISA试剂盒检测方法，测定正常对照组、模型组、COL组和给药组大鼠血清中IL-1β的含量。相较于正常对照组，在注射尿酸钠晶体后模型组大鼠血清中IL-1β的含量显著上升(P<0.05)。给药组与模型组相比，大鼠血清中IL-1β的含量明显的下降(P<0.05)。结果表明，给药组能够降低急性痛风性关节炎大鼠血清中的IL-1β含量。
依据ELISA试剂盒检测方法，测定正常对照组、模型组、COL组、给药组大鼠血清中IL-6的含量。相较于正常对照组，在注射尿酸钠晶体后模型组大鼠血清中IL-6的含量显著上升(P<0.05)。160mg/kg剂量的给药组大鼠与模型组相比，IL-6的含量下降(P<0.05)。虽然40mg/kg剂量组的大鼠相对于模型组而言IL-6含量有所下降但是效果并不显著。结果表明，给药组能够降低急性痛风性关节炎大鼠血清中的IL-6含量。
依据ELISA试剂盒检测方法，测定正常对照组、模型组、COL组和给药组大鼠血清中IL-10的含量。在注射尿酸钠晶体后模型组与正常对照组相比，大鼠血清中IL-10的含量有所下降(P<0.05)。相较于模型组，40mg/kg剂量组的给药组能够提高血清中IL-10的含量(P<0.05)，而160mg/kg的给药组对血清中IL-10的含量没有影响。结果表明，给药组能够升高急性痛风性关节炎大鼠血清中IL-10的含量，且可能呈非剂量依赖性。
给药组对急性痛风性关节炎大鼠血清MCP-1的影响。据ELISA试剂盒检测方法，测定正常对照组、模型组、COL组和给药组大鼠血清中MCP-1的含量。与正常对照组相比，在注射尿酸钠晶体后模型组大鼠血清中MCP-1的含量几乎没有变化。COL组大鼠血清中MCP-1的含量显著下降(P<0.01)。相较于模型组，给药组能够降低大鼠血清中MCP-1的水平，但是并不具有显著性(P>0.05)。
给药组对急性痛风性关节炎大鼠血清TNF-α的影响。据ELISA试剂盒检测方法，测定各个实验组大鼠血清中TNF-α的含量。与正常对照组相比，在注射尿酸钠晶体后模型组大鼠血清中TNF-α的含量有所上升但是并不明显(P>0.05)。COL组大鼠血清中TNF-α的含量显著的下降(P<0.01)。与模型组相比，给药组也能够明显的降低TNF-α的水平(P<0.05)。结果表明，给药组能够降低血清中TNF-α的含量。
踝关节病理切片的分析。利用荧光显微镜观察并拍摄病理切片，数据表明，相较于正常实验组大鼠，模型组大鼠踝关节腔中有异物存在且关节腔间隙变窄，关节腔周围的炎性细胞数量增加。40mg/kg剂量的给药组能够有效缓解急性痛风性关节炎大鼠踝关节的这些病理改变。然而，160mg/kg的给药组未能显示出缓解关节炎症的积极作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种芹菜籽提取物，其特征在于，所述芹菜籽提取物中成分以芹菜苷为主；优选的，所述芹菜苷的含量在80％以上；优选的，所述芹菜籽提取物中还存在芹菜素。
2.一种芹菜籽提取物的制备方法，包括如下步骤：
1)取芹菜干燥种子，粉碎成芹菜籽粉末；
2)用有机溶剂提取并除去芹菜籽中的挥发油类化合物；
3)将步骤2)有机溶剂提取后的芹菜籽浸泡在提取剂中，室温浸泡提取或回流提取；所述提取剂为乙醇或乙醇的水溶液；
4)将步骤3)得到的乙醇–水提取物浓缩，柱层析得到芹菜籽提取物；
所述提取剂为乙醇或乙醇水溶液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)的具体操作步骤为：取芹菜干燥种子，粉碎，细磨成细粉，加入5–10倍体积量于干燥芹菜籽的有机溶剂，室温浸泡提取3–5次或者回流提取3–5次；每次室温浸泡时间为5–12小时或回流时间为1–3小时，抽滤后得到的芹菜籽滤饼晾干备用。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3)的具体操作步骤为：取步骤2)中晾干后的芹菜籽滤饼，向滤饼中加入乙醇溶液室温浸泡提取3–5次或者回流提取3–5次，每次加入乙醇溶液为芹菜干燥种子5–10倍体积量；每次室温浸泡时间为5–12小时或回流时间为1–3小时；合并得到的乙醇溶剂，减压浓缩得芹菜籽浸膏。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)的具体操作步骤为：步骤3)中得到的芹菜籽浸膏装柱进行洗脱，柱层析的梯度洗脱步骤为：先用石油醚洗脱5–10个柱体积，除去流分，再用体积比1:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂洗脱8–15个柱体积，收集流分，再用乙酸乙酯洗脱8–15个柱体积，收集流分，再用体积比为5％的甲醇和乙酸乙酯混合溶剂洗脱5–10个柱体积，收集流分，最后用体积比为10％的甲醇和乙酸乙酯混合溶剂洗脱5–10个柱体积，收集流分并检测，将收集的相同组分流分合并，减压浓缩，得到最终产物。
6.如权利要求2所述的芹菜籽提取物的制备方法，其特征在于，步骤2)中的有机溶剂为：乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙醚和乙腈中一种或多种的组合，优选为乙酸乙酯。
7.如权利要求2所述的芹菜籽提取物的制备方法，其特征在于，步骤3)中的乙醇水溶液为95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、60％乙醇、40％乙醇中的任意一种；优选的，所述乙醇水溶液为95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、60％乙醇中的任意一种。
8.如权利要求2所述的芹菜籽提取物的制备方法，其特征在于，步骤4)中的柱层析为硅胶柱层析、酸性三氧化二铝柱层析或大孔吸附树脂柱层析中的任意一种；优选为硅胶柱层析。
9.如权利要求2所述的芹菜籽提取物的制备方法，其特征在于，室温浸泡提取和回流提取的步骤均设有磁力搅拌辅助。
10.权利要求1所述的芹菜籽提取物在制备降低尿酸的预防药物、营养品和食品中的应用；
优选的，降低尿酸的预防药物包含权利要求1所述芹菜籽提取物及药学上可接受的辅料；
优选的，降低尿酸的营养品中包含权利要求1所述芹菜籽提取物及可用于营养品的辅料；
优选的，降低尿酸的食品中包含含权利要求1所述芹菜籽提取物及其他食品成分。
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