CN112646913B - 一对与玉米穗粗QTL ZmED3紧密连锁的分子标记引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一对与玉米穗粗QTL ZmED3紧密连锁的分子标记引物及其应用。本发明提供了一对与玉米穗粗QTL ZmED3紧密连锁的分子标记引物，所述分子标记引物的上游引物如SEQ ID NO:1所示，所述分子标记引物的下游引物如SEQ ID NO:2所示。本发明提供的分子标记引物与控制玉米穗粗性状的基因有紧密连锁的关系，能够准确扩增获得如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，因此具有扩增特异性高的特点。本发明提供的分子标记引物能够有效起到鉴定玉米穗粗性状的技术效果，能够有效地运用在玉米穗粗性状的遗传改良中。

Description

一对与玉米穗粗QTL ZmED3紧密连锁的分子标记引物及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一对与玉米穗粗QTL ZmED3紧密连锁的分子标记引物及其应用。

背景技术

玉米(Zea may L.)是当今世界最重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物，在保障世界粮食安全、经济发展及缓解能源危机等方面作用巨大。由于土地供给的刚性制约，为满足我国国民经济持续发展对玉米的需求，提高玉米单位面积产量是遗传育种学科的重大课题。

加强对玉米穗粗性状的选择是提高单株产量的可行办法，寻找与产量QTL紧密连锁的分子标记，克隆关键基因以及剖析其遗传调控途径长期以来一直是分子育种学家的研究热点。但是现有技术中有关控制玉米穗粗性状的QTL的相关研究较少，仍缺乏一种能够精准鉴定影响玉米穗粗性状的技术方案。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一对与玉米穗粗QTL ZmED3紧密连锁的分子标记及其应用。本发明提供的分子标记能够精准的鉴定玉米种的穗粗性状，并能够将之运用在玉米育种中。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一对与玉米穗粗QTL ZmED3紧密连锁的分子标记引物，所述分子标记引物的上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述分子标记引物的下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述分子标记引物在玉米分子育种中的应用。

本发明还提供了上述分子标记引物在筛选鉴定玉米穗粗中的应用。

优选的所述筛选鉴定的方法包括以下步骤：

(1)提取待检测玉米的基因组DNA；

(2)以待检测玉米的基因组DNA为模板，利用上述技术方案所述分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

(3)对PCR产物进行电泳，当扩增得到的PCR产物片段大小为1989bp时，则待检测玉米为携带ZmED3粗穗的品种；当扩增得到的PCR产物片段大小为1457bp时，则待检测玉米为没有携带ZmED3粗穗的品种。

优选的，所述PCR扩增的反应体系为：1μL玉米材料的基因组DNA，5μL 2×PCR Mix，浓度为10μM的上述技术方案所述分子标记引物各0.5μl，2μL ddH₂O。

优选的，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30～60s，28～35个循环；72℃延伸5～l0min。

本发明提供了一对与玉米穗粗QTL ZmED3紧密连锁的分子标记引物，所述分子标记引物的上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述分子标记引物的下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述玉米穗粗特指玉米的穗粗性状。本发明提供的分子标记引物与控制玉米穗粗性状的基因有紧密连锁的关系，能够准确扩增获得如SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，具有扩增特异性高的特点，其中SEQ ID NO:3为携带粗穗性状的核苷酸序列，SEQ ID NO:4为未携带粗穗性状的核苷酸序列。由实施例可知，本发明提供的分子标记引物能够有效起到鉴定玉米穗粗性状的技术效果，能够有效地运用在玉米穗粗性状的遗传改良中。

附图说明

图1为Ye478及近等基因系Ye478^ed3表型示意图，其中A为近等基因系的成熟果穗，Ye478(左)、Ye478^ed3(右)，白色竖线bar＝1cm，B为近等基因系穗粗性状统计比较，p值表示显著水平；

图2为玉米穗粗QTL ZmED3精细定位图；其中t-test用于显著性检验，*、**分别代表0.05、0.01水平上显著，ns代表不显著；

图3为玉米穗粗QTL ZmED3关联分析曼哈顿图；其中x轴为玉米第三染色体3.08binZmED3位点SNP的物理位置，y轴为利用混合线性模型且用群体结构控制下计算得到的穗粗关联分析阈值(-LOG₁₀(0.05/513))；

图4为ZmED3的育种效应评价示意图；ED代表穗粗，穗粗在3个自交系分别与近等基因系(Ye478与Ye478^ed3)构建的杂交组合的成对比较；t-test用于显著性检验，*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著；

图5为ZmED3的育种效应评价示意图；KRN代表穗行数，穗行数在3个自交系分别与近等基因系(Ye478与Ye478^ed3)构建的杂交组合的成对比较；t-test用于显著性检验，*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著；

图6为ZmED3的育种效应评价示意图；KNR代表行粒数，行粒数在3个自交系分别与近等基因系(Ye478与Ye478^ed3)构建的杂交组合的成对比较；t-test用于显著性检验，*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著；

图7为ZmED3的育种效应评价示意图；EL代表穗长，穗长在3个自交系分别与近等基因系(Ye478与Ye478^ed3)构建的杂交组合的成对比较；t-test用于显著性检验，*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著；

图8为ZmED3的育种效应评价示意图；EW代表穗重，穗重在3个自交系分别与近等基因系(Ye478与Ye478^ed3)构建的杂交组合的成对比较；t-test用于显著性检验，*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著。

具体实施方式

本发明提供了一对与玉米穗粗QTL ZMED3紧密连锁的分子标记引物，所述分子标记引物的上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述分子标记引物的下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在本发明中，所述SEQ ID NO:1为：TCTTGTTGCTTGACCATGCC；所述SEQ ID NO:2为GATGGCAAAGGTGTGGGAAG。本发明提供的分子标记引物能够准确扩增获得如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列：

TCTTGTTGCTTGACCATGCCCCACCTGAAAACGTCCCCACCTAAGGAATTGATCCTTGATGTTCATTAGGCCAGCCCAGAAATGAGAATCACCCGCTTTTCTGGAAACTTGGGTGAGGGATTTGCCTCCCAGGTATTTATTTCTTAGGAGTCGTGGCCACATACCACCTTCATTGAGTAATTTATAGAGCCAATTGCTGAGTAAACAAATGTTCTTTATGGCCAGAATGGTGACTCCCAGCCCACCTAACTCTTTAGGTTGGCAAATAATCTGCCATTTGGCTACTCTATATTTCTATTTATGATGTCCACCTTGCTGGAAGAATCTGGACCGAATAGCATCTAGCTTCGCTAAGAAGAAGATCATGAAAATAGGTAGTCTACTTAGAACATAATTAATCAAAACAAGCCTCCCCTTGGAGACAGGAATTTGGATTTCCAATTACTGAGTCTCTTCTCAAACCGGTTGATAAAACAACACCACTCGATGTTTCTCAATCTTCGATGGGTCATAGGAATCCCAAGGTACTTGAAAGACATTTTGCTTATTCCGCAACCAAAGAGCCATGAGTACTAAGTCTCACATGCCTTAGCTGGCCCATAATAGGAAATTCCTCAATCTTCGATGCTATGATCTAGGAACACCACCGTGTCATCTACATATTGAAGGATAGACAAATCTCCTTTAATCAAGTGTGGTACGATCCCAGGAAATTGATTCTCCTCTATTGCTCTAGCAAAGAGCACTACCAACATATCAGCAACAATGTTGAAGAGTATCGGTGAGAGAGGCCCCCCCTTGTCAAAGGCCCTTGTGTGTCGAGAAAAAGGGTCCTATACCATCATTAACTCTAACCCCCACGTGACCTCCCGAGACGATATTTTGGATCCAAGCGCACCACTTTGGTGAGAAACCCTTCATGCGCATAGCTTGCAGGAGAAAATTCCACTTTAGCTTATTATAAGCTTTCTCGAAGTCCAACTTAAGAATAATTCCATCTCATTTTTAACCTATGTAGCTCATGTACAGACTCATGTAATACAATTACCCCTTCAAGAATATTACGATCGGGCATAAACACAGTCTAAGAGGGTTTAATAATTCGATGGACAACCACACCTATTCTGTTTGTGAGCACTTTAATAATAATGTTAAAAGTAACACTAAGCAAACAAATAGATCTATATTTCTGGATTTTCAGATTAATCTCTATCTTAGGAATTAACATAATGGCTCCGAAGTTTAGTCTATACACCGAGAGCGAGTTATTATGGAAGTCCGCGAACAAAGGCATTAAATCATTTTTGTTAGGATAGTGGAATGAAGTTCTAGCATTGTCCTTGTGATGTTACATGACACATGGCAAAAAAAAAACTAGCAGATGGTTCGCATACTCGTTACTACTAAAGCTAAATCATCAATGCAATCAAGAATCAAACCGTTCCCAATGTGCTGTAACCTCAGTCAAAGGAAGAAGAAAACCACCATCATATATGTCTCCAACAGTGTGGCTCTAATAATTTCCCTGCAGACAAAGTACATTACACCTGCTGGCAGGACTACTAGTACCACGCCACAGTGTTTCCAGCATTATTATTATTATTATTATTATTTTTACCTATGGGTACTGCCACACTGTATCCATCTTTCTCTGCCCGGCGCTTATATAACGCCTCCCCATGCTTCTACTCCTTTCCAATCTGTGTTTGTCTTTGCTTGCCCCCCTTCTCCCCCCTCATCTCCCCCCTTTTCTTGTTCCTGTGCCTGTGCATTGGCTGGCGATGGGGTCCACTTCTCCTTCAGGCCTGGAGCTCACCATGGCTGTCCCGGGCCTCAGCTCCTCCTCTGGCTCAGGTAAGCTCAGGAGACCCCGACCTGCTAGCAGAGATGGTATTCTATCGGTCATACAGATACAAGTATATATATGTACTCCTATGCAAGAATGAGACCATATATCGTTGCTGAGGTTCTTCCCACACCTTTGCCATC，SEQ ID NO:3；或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：

TCTTGTTGCTTGACCATGCCCCACCTGAAAACGTCCCCACCTAAGGAATTGATCCTTGACGTTCATTAGGCCAGCCTAGAAATGAGATTCACCCGGTTTTCTGGAAACTTGGGTGAGGGATGTGCCTCCTAGGTATTTGTTTTTTAGGAGTCATTGCCACATACCATCTTCATTGAGTAATTTATAAAGCCATTTGATGAGTAAACAAATGTTCTTTATGGCCAGATTAGCGACTCCCAGCCCACCTAACTCTTTAGGTTGGCAAATAATCTGCCATTTGGCTACTCCATATTTCTTTTTATGATGTCCACCTTGCTGGAAAAATCTAGACCGAATAGCATCTAGCTTCGCTAACACGCCTGTCGGGGTTTCAAAGAAGGACATCATGAAAATAGGTAGGCTACTTTAAACATAATGAACAAGCCTCCCCCTAAAGACAGGAATTTGGCTTTCCAATTGCTGAGTCTCTTCTCAAACCGGTCGATAAAACAACACCACTCACTATTTCTCAATCTTCGGTGGGTCATAGGAATCCCAAGGTACTTGAAAGGCATTTTGCTTATTCCATAGCCAAAGAGCCAATAGTACTAAGTCTCACATGCCTTAGCCGACCCATAATAGGAAATTTCGCTTTTGTTAAAATTTATCTTAAGCCCGAACATTTTCAGATCAATCTCTTTCTTAGGAATTAACATAATGGATCCGAAGTTTAGGCTATACACCAGGAGGGAGTTATTATGGAAGTCCGCGAACGGAGCCATTAAATCATTTTTGTTAGGATAGTGGAATGAAGTTCTAGCATTGTCATTGTGATGTTACATGACACACGGCAAAAAAAACTAGCAGATGGTTCGCATACTCGTTACTACTAAAGCTAAATCATCAATGCAATCAAGAATCAAACCGTTCCCAATGTGCTGTAACCTCAGTCAAAGGAAGAAGAAAACCACCATCATATATGTCCCCAACAGTGTGGCTCTAATAATTTCCCCGCAGACAAAGTACATTACACCTGCTGGCAGGACTACTAGTACCACGCCACAGTGTTTCCAGCATTATTATTATTATTATTATTATTATTTTTACCTATGGGTACTGCCACACTGTATCCATCTTTCTCTGCCCGGCGCTTATATAACGCCTCCCCATGCTTCTACTCCTTTCCAATCTGTGTTTGTCTTTGCTTGCCCCCCTTCTCCCCCCTCATCTCCCCCCTTTTCTTGTTCCTGTGCCTGTGCATTGGCTGGCGATGGGGTCCACTTCTCCTTCAGGCCTGGAGCTCACCATGGCTGTCCCGGGCCTCAGCTCCTCCTCTGGCTCAGGTAAGCTCAGGAGACCCCGACCTGCTAGCAGAGATGGTATTCTATCGGTCATACAGATACAAGTATATATATGTACTCCTATGCAAGAATGAGACCATATATCGTTGCTGAGGTTCTTCCCACACCTTTGCCATC，SEQ ID NO:4；具有精准和扩增特异性高的特点。

在本发明中，所述与玉米穗粗QTL紧密连锁的分子标记的获得方式优选为下述步骤：

1)首先通过初定位，在第三条染色体3.08bin的位置检测到控制穗粗的主效QTL位点，并将其命名为ZmED3；

2)通过连续几代回交，并利用分子标记进行前景和背景选择，构建了ZmED3的近等基因系；

3)利用穗粗QTLZmED3的近等基因系和来源于玉米不同杂种优势群的3个不同的优良玉米自交系进行杂交，考察F₁穗粗等产量相关的配合力，评价ZmED3位点的育种效应；

4)利用拥有广泛遗传变异的513份优良玉米自交系材料，结合高质量的SNP标记及多年多点的穗粗表型数据对3号染色体3.08bin进行了候选区段的关联分析，鉴定到了一个与穗粗显著关联的SNP位点。

本发明还提供了上述分子标记引物在玉米分子育种中的应用；所述玉米分子育种包括对玉米穗粗的筛选。本发明提供了一对与玉米穗粗紧密连锁的分子标记引物，并利用该分子标记引物通过杂交、回交及分子标记辅助选择方法，获得穗粗差异显著的近等基因系；将两个近等基因系分别与多个优良玉米自交系杂交配制F₁组合，经过F₁组合鉴定，可知该位点能够显著地增加穗粗，对加快玉米穗粗性状的遗传改良具有重要意义；证明开发的与穗粗性状紧密连锁的分子标记可用于穗粗性状的分子标记辅助选择育种。

本发明不仅通过QTL定位结合候选区段关联分析快速鉴定并开发了与玉米穗粗性状紧密连锁的分子标记，并证实了利用该分子标记可有效的用于玉米穗粗性状的遗传改良；玉米的穗粗性状与产量呈正相关，即明确了其育种价值及在玉米产量育种中的应用潜力。

在本发明中，所述筛选鉴定的方法优选包括以下步骤：

(1)提取待检测玉米的基因组DNA；

(2)以待检测玉米的基因组DNA为模板，利用上述分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

(3)对PCR产物进行电泳，当扩增得到的PCR产物片段大小为1989bp时，则待检测玉米为携带ZmED3粗穗的品种；当扩增得到的PCR产物片段大小为1457bp时，则待检测玉米为没有携带ZmED3粗穗的品种。

本发明提取待检测玉米的基因组DNA；本发明对基因组DNA提取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规基因组DNA提取方法即可。

得到待检测玉米的基因组DNA后，本发明以待检测玉米的基因组DNA为模板，利用上述分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR产物。在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选为：1μL玉米材料的基因组DNA，5μL 2×PCR Mix，浓度为10μM的上述分子标记引物各0.5μl，2μL ddH₂O；所述PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30～60s，28～35个循环；72℃延伸5～l0min。

得到PCR产物后，本发明对PCR产物进行电泳，当扩增得到的PCR产物片段大小为1989bp时，说明其为穗粗大的单株扩增的片段大小，则待检测玉米为携带粗穗的品种；当扩增得到的PCR产物片段大小为1457bp时，说明其为穗粗小的单株扩增的片段大小，则待检测玉米为没有携带粗穗的品种。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一对与玉米穗粗QTL ZmED3紧密连锁的分子标记引物及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例

与玉米穗粗性状紧密连锁的分子标记开发

1材料与方法

1.1试验材料

ZmED3近等基因系Ye478和Ye478^ed3及近等基因系构建的后代定位群体；

来源广泛、遗传变异丰富的513份玉米自交系构成的自然群体材料。

1.2试验方法

1.2.1田间试验及表型鉴定

用于子代测验的杂合重组单株，每个杂合单株发展成不少于200个子代家系。6种不同交换类型的纯合重组家系2017海南三亚(18°N，109°E)冬种植，采取随机区组，3次重复，行长3m，宽0.6m，每行种植12棵。成熟后，收获果穗，风干，剔除异常果穗，进行数据测量，t-test检验差异显著性。

关联群体材料田间试验于2011年至2012年分别在中国湖北、重庆、河南、云南和海南5个地点进行，采用完全随机区组设计，单行区，行长3m，行距0.6m，每行定苗12株。关联分析群体基因型数据为全基因组125万个SNP标记信息。

1.2.2基因型鉴定

基因型分析涉及到DNA的提取以及PCR扩增，PCR扩增反应体系如表1所示，PCR反应程序如表2所示。单株DNA的提取采用CTAB法，具体步骤如下：

1、在研钵中加入700μL CTAB(83.5mM Tris-HCl，pH8.0，16.7mM EDTA pH8.0，1.17M NaCl，1.67％CTAB)，取适量新鲜的玉米的幼嫩叶片于冰上研磨至匀浆，转移至2mL的离心管中；

2、将离心管65℃水浴40min，期间颠倒混匀几次；

3、待离心管冷却至室温后，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1，V/V)，轻摇混匀15min左右后，12000rpm离心10min；

4、取200μL的上清液移至另一新的1.5mL离心管中，加入上清液2倍体积的冰乙醇，轻摇混匀后静置30min；

5、12000rpm离心10min，弃上清，用75％的乙醇洗沉淀2次；

6、12000rpm离心5min，弃上清，室温放置干燥后，加入100μL双蒸水溶解，在-20℃保存备用。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应程序

单株基因型检测采用3％琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳相结合的方法。

1.2.3候选区段关联分析

依据全基因组SNP标记信息筛选出区段内1万个高质量的SNP标记，结合这些标记在513份关联分析群体中的基因型鉴定结果以及该群体在多年多点的穗粗性状表型鉴定数据，利用TASSEL V5的GLM模型进行区域性关联分析，显著水平为-LOG₁₀(0.05/513)。

1.2.4分子标记开发

根据B73基因组，下载候选区段显著位点位置序列，利用MaizeGDB网站进行特异性引物的设计，然后在近等基因系Ye478与Ye478^ed3中进行扩增，采用3％琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳相结合的方法进行多态性分析，选取有多态性、条带清晰的标记进行实验。

2结果与分析

2.1 ZmED3的精细定位

根据F_2:3家系定位结果，发现了以Ye478为轮回亲本，吉1037为供体的回交群体，再以Ye478为轮回亲本进行五轮回交，构建了ZmED3的近等基因系材料Ye478^ed3，Ye478及近等基因系Ye478^ed3表型示意图如图1所示。利用Ye478和Ye478^ed3构建的2800株分离群体中筛选得到ZmED3位点的78个重组单株，并将这些重组单株全部自交留种发展了纯和的重组家系。

同时，通过重组单株标记的加密，获得了6种重组类型，并构建了ZmED3的跨叠系。在2017年海南将上述6个重组家系进行子代测验。最终将ZmED3精细定位至40kb的区段内，定位图如图2所示，图2为玉米穗粗QTL ZmED3精细定位图。

2.2候选区段关联分析

在40kb区间内，利用125万个SNP标记信息并结合513份关联群体多年多点的籽粒百粒重性状进行了候选区段的关联分析。其中最显著的位点检测到与穗粗显著关联，利用BLUP综合两年10个环境数据分析结果，显著性P值为1.24×10^-4，(图3为玉米穗粗QTLZ mED3关联分析曼哈顿图)。这为后期分子标记的开发及近等基因系的构建提供了依据。

2.2标记开发

根据候选区段关联分析得到的显著性最高的SNP位置，选取了关联群体材料中大粒的优良玉米自交系材料V671及小粒自交系Mc，扩增了两个材料中在SNP位置上下游5kb的DNA序列信息，根据两个材料的DNA序列信息开发了与该SNP位点紧密连锁的分子标记。针对该分子标记设计引物，如下所示：

F1:TCTTGTTGCTTGACCATGCC，SEQ ID NO:1；

R1:GATGGCAAAGGTGTGGGAAG，SEQ ID NO:2。

在Ye478中扩增得到的基因片段(1989bp)，如SEQ ID NO:3所示，在Ye478^ed3中扩增得到的基因片段(1457bp)，如SEQ ID NO:4所示。

应用例

与玉米穗粗性状紧密连锁的分子标记在玉米育种中的应用：

1材料与方法

1.1试验材料

玉米自交系Ye478以及其近等基因系Ye478^ed3，3个优良玉米自交系：CHANG7-2、6WC和4CV。

1.2试验方法

1.2.1 Ye478和Ye478^ed3分别与3个优良自交系组配F₁组合

选择3个玉米优良自交系(CHANG7-2、4CV和6WC)，分别与含优良ZmED3基因型自交系Ye478(采用分子标记进行辅助选择，扩增条带大小为1989bp)以及含有不良位点的近等基因系Ye478^ed3(采用分子标记进行辅助选择，扩增条带大小为1457bp)杂交，得到6个杂交组合。

利用分子标记扩增条带大小为1989bp时表示携带ZmED3粗穗性状基因型；分子标记扩增条带大小为1457bp时表示，没有携带ZmE D3粗穗性状基因型。

1.2.2穗粗等重要穗部性状考察

获得的6个F₁组合种植于2019湖北黄冈(HG)和十堰(SY)两地，采取随机区组，三次重复，行长3m，宽0.6m，每行种植12株。待玉米完全成熟后，收获果穗风干并剔除异常果穗，测量并收集F₁的穗粗(ED)、穗行数(KRN)、行粒数(KNR)、穗长(EL)和穗重(EW)等性状数据，利用t-test检验差异显著性。

2结果与分析

检测结果如图4～图8，表3～表7所示。其中图4为ZmED3的育种效应(穗粗)评价示意图；图5为ZmED3的育种效应(穗行数)评价示意图；图6为ZmED3的育种效应(行粒数)评价示意图；图7为ZmED3的育种效应(穗长)评价示意图；图8为ZmED3的育种效应(穗重)评价示意图。

表3 ZmED3的育种效应评价示意图(穗粗)

附：*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著

表4 ZmED3的育种效应评价示意图(穗行数)

附：*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著

表5 ZmED3的育种效应评价示意图(行粒数)

附：*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著

表6 ZmED3的育种效应评价示意图(穗长)

附：*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著

表7 ZmED3的育种效应评价示意图(穗重)

附：*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著

由图4～图8，表3～表7可知，基于6个杂交组合一年两点的表型统计表明，含有ZmED3优势基因型的自交系Ye478与3个自交系(CHANG7-2，4CV，6WC)F1杂交组合，相对于含有Zmed3不利基因型的近等基因系Ye478^ed3所得F₁穗粗平均增加2.15mm，穗长平均增加0.03mm，行粒数平均增加1.14粒，穗行数平均增加1.04行，穗重平均增加16g，平均增产7％。根据此结果，来自于Ye478的ZmED3优良等位基因型能够有效的提高自交系杂交组合产量。可以指导该分子标记在育种过程中进行应用，以有效的提高玉米产量。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一对与玉米穗粗QTL ZmED3紧密连锁的分子标记引物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcttgttgct tgaccatgcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatggcaaag gtgtgggaag 20

<210> 3

<211> 1989

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcttgttgct tgaccatgcc ccacctgaaa acgtccccac ctaaggaatt gatccttgat 60

gttcattagg ccagcccaga aatgagaatc acccgctttt ctggaaactt gggtgaggga 120

tttgcctccc aggtatttat ttcttaggag tcgtggccac ataccacctt cattgagtaa 180

tttatagagc caattgctga gtaaacaaat gttctttatg gccagaatgg tgactcccag 240

cccacctaac tctttaggtt ggcaaataat ctgccatttg gctactctat atttctattt 300

atgatgtcca ccttgctgga agaatctgga ccgaatagca tctagcttcg ctaagaagaa 360

gatcatgaaa ataggtagtc tacttagaac ataattaatc aaaacaagcc tccccttgga 420

gacaggaatt tggatttcca attactgagt ctcttctcaa accggttgat aaaacaacac 480

cactcgatgt ttctcaatct tcgatgggtc ataggaatcc caaggtactt gaaagacatt 540

ttgcttattc cgcaaccaaa gagccatgag tactaagtct cacatgcctt agctggccca 600

taataggaaa ttcctcaatc ttcgatgcta tgatctagga acaccaccgt gtcatctaca 660

tattgaagga tagacaaatc tcctttaatc aagtgtggta cgatcccagg aaattgattc 720

tcctctattg ctctagcaaa gagcactacc aacatatcag caacaatgtt gaagagtatc 780

ggtgagagag gccccccctt gtcaaaggcc cttgtgtgtc gagaaaaagg gtcctatacc 840

atcattaact ctaaccccca cgtgacctcc cgagacgata ttttggatcc aagcgcacca 900

ctttggtgag aaacccttca tgcgcatagc ttgcaggaga aaattccact ttagcttatt 960

ataagctttc tcgaagtcca acttaagaat aattccatct catttttaac ctatgtagct 1020

catgtacaga ctcatgtaat acaattaccc cttcaagaat attacgatcg ggcataaaca 1080

cagtctaaga gggtttaata attcgatgga caaccacacc tattctgttt gtgagcactt 1140

taataataat gttaaaagta acactaagca aacaaataga tctatatttc tggattttca 1200

gattaatctc tatcttagga attaacataa tggctccgaa gtttagtcta tacaccgaga 1260

gcgagttatt atggaagtcc gcgaacaaag gcattaaatc atttttgtta ggatagtgga 1320

atgaagttct agcattgtcc ttgtgatgtt acatgacaca tggcaaaaaa aaaactagca 1380

gatggttcgc atactcgtta ctactaaagc taaatcatca atgcaatcaa gaatcaaacc 1440

gttcccaatg tgctgtaacc tcagtcaaag gaagaagaaa accaccatca tatatgtctc 1500

caacagtgtg gctctaataa tttccctgca gacaaagtac attacacctg ctggcaggac 1560

tactagtacc acgccacagt gtttccagca ttattattat tattattatt atttttacct 1620

atgggtactg ccacactgta tccatctttc tctgcccggc gcttatataa cgcctcccca 1680

tgcttctact cctttccaat ctgtgtttgt ctttgcttgc cccccttctc ccccctcatc 1740

tccccccttt tcttgttcct gtgcctgtgc attggctggc gatggggtcc acttctcctt 1800

caggcctgga gctcaccatg gctgtcccgg gcctcagctc ctcctctggc tcaggtaagc 1860

tcaggagacc ccgacctgct agcagagatg gtattctatc ggtcatacag atacaagtat 1920

atatatgtac tcctatgcaa gaatgagacc atatatcgtt gctgaggttc ttcccacacc 1980

tttgccatc 1989

<210> 4

<211> 1457

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcttgttgct tgaccatgcc ccacctgaaa acgtccccac ctaaggaatt gatccttgac 60

gttcattagg ccagcctaga aatgagattc acccggtttt ctggaaactt gggtgaggga 120

tgtgcctcct aggtatttgt tttttaggag tcattgccac ataccatctt cattgagtaa 180

tttataaagc catttgatga gtaaacaaat gttctttatg gccagattag cgactcccag 240

cccacctaac tctttaggtt ggcaaataat ctgccatttg gctactccat atttcttttt 300

atgatgtcca ccttgctgga aaaatctaga ccgaatagca tctagcttcg ctaacacgcc 360

tgtcggggtt tcaaagaagg acatcatgaa aataggtagg ctactttaaa cataatgaac 420

aagcctcccc ctaaagacag gaatttggct ttccaattgc tgagtctctt ctcaaaccgg 480

tcgataaaac aacaccactc actatttctc aatcttcggt gggtcatagg aatcccaagg 540

tacttgaaag gcattttgct tattccatag ccaaagagcc aatagtacta agtctcacat 600

gccttagccg acccataata ggaaatttcg cttttgttaa aatttatctt aagcccgaac 660

attttcagat caatctcttt cttaggaatt aacataatgg atccgaagtt taggctatac 720

accaggaggg agttattatg gaagtccgcg aacggagcca ttaaatcatt tttgttagga 780

tagtggaatg aagttctagc attgtcattg tgatgttaca tgacacacgg caaaaaaaac 840

tagcagatgg ttcgcatact cgttactact aaagctaaat catcaatgca atcaagaatc 900

aaaccgttcc caatgtgctg taacctcagt caaaggaaga agaaaaccac catcatatat 960

gtccccaaca gtgtggctct aataatttcc ccgcagacaa agtacattac acctgctggc 1020

aggactacta gtaccacgcc acagtgtttc cagcattatt attattatta ttattattat 1080

ttttacctat gggtactgcc acactgtatc catctttctc tgcccggcgc ttatataacg 1140

cctccccatg cttctactcc tttccaatct gtgtttgtct ttgcttgccc cccttctccc 1200

ccctcatctc cccccttttc ttgttcctgt gcctgtgcat tggctggcga tggggtccac 1260

ttctccttca ggcctggagc tcaccatggc tgtcccgggc ctcagctcct cctctggctc 1320

aggtaagctc aggagacccc gacctgctag cagagatggt attctatcgg tcatacagat 1380

acaagtatat atatgtactc ctatgcaaga atgagaccat atatcgttgc tgaggttctt 1440

cccacacctt tgccatc 1457

Claims (4)

1.与玉米穗粗QTLZmED3紧密连锁的分子标记引物在鉴定玉米穗粗中的应用，其特征在于，所述分子标记引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述分子标记引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述鉴定的方法包括以下步骤：

（1）提取待检测玉米的基因组DNA；

（2）以待检测玉米的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

（3）对PCR产物进行电泳，当扩增得到的PCR产物片段大小为1989bp时，则待检测玉米为携带ZmED3粗穗的品种；当扩增得到的PCR产物片段大小为1457bp时，则待检测玉米为没有携带ZmED3粗穗的品种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：1μL玉米材料的基因组DNA，5μL 2×PCRMix，浓度为10μM的权利要求1所述分子标记引物各0.5μl，2μLddH₂O。

4.根据权利要2所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30～60s，28～35个循环；72℃延伸5～l0min。

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