CN112641796B - 一种缺血性脑卒中的神经保护药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缺血性脑卒中的神经保护药物，属于生物技术药物领域。所述药物以DNA四面体为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。本发明的药物，可有效保护脑神经，大幅降低缺血性脑卒中导致的梗死面积，对于病情较轻的患者，可有改善其行为能力；对于病情较重的患者，亦可稳定病情，延长治疗窗口期。

Description

一种缺血性脑卒中的神经保护药物
技术领域
本发明属于生物技术药物领域。
背景技术
脑卒中，俗称中风，是由脑部血管受损导致的脑组织损伤。在发达国家，脑卒中是最常见的致残原因，也是常见的死亡原因。而在我国，脑卒中是成年人致死、致残的首位病因，具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点。脑卒中一般分为两类，即缺血性脑卒中和出血性脑卒中。其中，缺血性脑卒中在临床上最为常见，约占我国脑卒中的70％。
缺血性脑卒中发生后，梗死中心区的神经细胞在几分钟内即可发生坏死凋亡，而梗死中心区周围的缺血半暗带由于血流减少会导致神经功能沉默。其中，梗死中心区的神经元的损伤不可逆转，而半暗带的神经元虽然因为缺血导致功能障碍但是结构完好，因此其损伤是可以逆转的。但很多患者在发病后因交通不便或者其他原因不能及时诊治，期间又缺乏神经保护的措施，导致脑损伤进一步加重，影响后期恢复，甚至医治无效。因此，在治疗前能采取措施减少脑部梗死中心区面积，保护缺血半暗带神经元，对提高治疗效果、改善患者预后极为重要。
四面体框架核酸(tetrahedral framework nucleic acids，tFNAs)又称DNA四面体(tetrahedral DNA，TDN)、四面体DNA纳米结构，是一种由多条(通常为4条)单链DNA通过链间碱基互补配对形成的一种四面体结构，它合成效率高，合成步骤简单，具有良好的生物安全性和生物相容性，在抗炎、抗氧化、诱导分化、调节细胞增殖和凋亡方面有着广泛的应用。目前未见tFNAs在缺血性脑卒中相关研究的报道。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种新的缺血性脑卒中的神经保护药物。
本发明的技术方案如下：
一种缺血性脑卒中的神经保护药物，所述药物以DNA四面体为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。
进一步地，所述药物是降低缺血性脑卒中导致的大脑梗死的面积的药物；
和/或，所述药物是保护缺血半暗带神经元的药物。
进一步地，所述DNA四面体由4条DNA单链通过碱基互补配对合成；所述DNA单链的序列如SEQ ID NO.1～4所示。
进一步地，所述DNA四面体的制备方法为：
将四条DNA单链溶于缓冲液中，加热到95℃保持10min，再降温至4℃维持20min以上。
进一步地，所述缓冲液含有10mM Tris-HCl、50mM MgCl2，pH＝8.0。
DNA四面体在用于制备缺血性脑卒中的神经保护药物中的用途。
进一步地，所述药物是降低缺血性脑卒中导致的大脑梗死的面积的药物；
和/或，所述药物是保护缺血半暗带神经元的药物。
进一步地，所述DNA四面体由4条DNA单链通过碱基互补配对合成；所述DNA单链的序列如SEQ ID NO.1～4所示。
进一步地，所述DNA四面体的制备方法为：
将四条DNA单链溶于缓冲液中，加热到95℃保持10min，再降温至4℃维持20min以上。
进一步地，所述缓冲液含有10mM Tris-HCl、50mM MgCl2，pH＝8.0。
有益效果：
实验证明，DNA四面体可激活缺血性脑卒中的神经保护机制，减少缺血梗死面积，保护半暗带神经元，改善脑卒中动物的行为能力。将DNA四面体作为活性成分用于制备治疗缺血性脑卒中的神经保护药物，将有利于减轻或稳定患者病情，延长治疗窗口期，对于脑卒中的急救意义重大。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：TFNAS电泳图。
图2：透射电镜观察图。
图3：行为学结果。
图4：存活率结果。
图5：梗死面积观察。
图6：免疫组化结果。
图7：缺血半暗带的星形胶质细胞观察。
具体实施方式
实施例1 tFNAs的合成
1.合成方法
将四条DNA单链(S1、S2、S3、S4)溶解于TM Buffer(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH＝8.0)中，使得四条DNA单链的终浓度为1000nM，充分混匀后迅速加热至95℃保持10分钟，之后迅速降温至4℃并维持20分钟以上，即可得到四面体骨架核酸TFNAS。
四条单链的序列(5′→3′)如下：
S1：
Figure BDA0002866326060000031
S2：
Figure BDA0002866326060000032
S3：
Figure BDA0002866326060000033
S4：
Figure BDA0002866326060000034
2.鉴定
由PAGE胶结果可见TFNAS大小约为200bp(图1)；透射电镜可见散在的点状物体，并能观察到部分点状物体呈现四面体形态(图2)。
通过前述鉴定结果，可以认为TFNAS被成功合成。
以下将以实验例的形式对本发明进一步说明，实验例中所用的tFNAs由实施例1的方法制备得到。
实验例1 tFNAs的神经保护作用
1.方法
(1)动物分组处理
体重210-230g的SD雄性大鼠，分为3组。
a.假手术组(sham)：永久结扎大鼠右侧颈总动脉。
b.生理盐水组(saline，SA)：永久结扎大鼠右侧颈总动脉和颈外动脉，采用0.4mm直径的硅胶头线栓从颈总动脉分叉处插入颈内动脉，入颅后堵塞大脑中动脉1小时。堵塞大脑中动脉时同期尾静脉注射生理盐水200微升。1小时后拔除线栓。
c.实验组(tFNAs)：久结扎大鼠右侧颈总动脉和颈外动脉，采用0.4mm直径的硅胶头线栓从颈总动脉分叉处插入颈内动脉，入颅后堵塞大脑中动脉1小时。堵塞大脑中动脉时同期尾静脉注射1μM tFNAs溶液200微升。1小时后拔除线栓。
(2)行为学评估
造模22小时后，对各组大鼠分别进行行走试验(Longa试验)、平衡木试验和肢体对称试验，以评估行为功能的变化。
(3)存活率统计
造模1天、2天后对生理盐水组和实验组的存活率进行统计。
(4)大脑梗死面积评估及切片检测
造模24小时后处死大鼠(未使用存活率统计的那批大鼠)，收取新鲜大脑组织。
a.梗死面积评估
放入-20℃冰箱内冰冻20分钟后取出，均匀切成厚度为1.5mm的冠状面切片，进行TTC染色，评估大脑梗死面积。
b.免疫组化检测
另取新鲜大脑组织经固定、脱水、包埋、切片，分别进行GFAP、NeuN、EPO蛋白的免疫组化染色。
2.结果
(1)行为学结果
Longa试验结果显示，实验组大鼠大多能正常行走，少数左侧前爪不能完全伸展；而生理盐水组有一半以上无法正常行走，甚至有少数不能自发行走。
平衡木实验结果显示，实验组大鼠均能跳上平衡木行走，有不小比例能保持不跌倒；而生理盐水组仅少数能跳上平衡木，但在上面行走不会跌倒的机会大于50％，其余的大鼠则情况更糟。
肢体对称试验结果显示，实验组大鼠患侧错步数较少，而生理盐水组错步数较多。
前述结果的具体情况如图3所示。
总之，由行为学结果可以明确，实验组大鼠的缺血性脑卒中相比生理盐水组得到明显的缓解。表明tFNAs对缺血性脑卒中具有神经保护作用。
(2)存活率
存活率结果如图4所示。可见实验组大鼠在造模1天和2天后的存活率明显高于生理盐水组。
该结果进一步说明tFNAs对缺血性脑卒中患者具有神经保护作用。
(3)梗死面积
由图5可知，实验组大鼠缺血梗死面积(白色)十分显著地低于生理盐水组，进一步说明了tFNAs对缺血性脑卒中具有神经保护作用。
(4)免疫组化检测
神经核抗原(Neun)是成熟神经元细胞核的特异性标记物，其正常表达表明神经元完好。促红细胞生成素(EPO)可以保护神经元，减少神经元凋亡。
如图6所示，相对于SA组，tFNAs组右侧脑区EPO和Neun表达水平更高，表明神经元受损不严重，说明在tFNAs作用下，神经保护机制被较好地激活。
在缺血缺氧的情况下，星形胶质细胞内外水平衡被破坏，引起星形胶质细胞肿胀。
如图7所示，相对于SA组，tFNAs组缺血半暗带的星形胶质细胞体积变小，说明tFNAs可缓解缺血半暗带的缺血缺氧状况，抑制星形胶质细胞肿胀，保护缺血半暗带的神经元。
本实验例的结果表明，tFNAs可激活缺血性脑卒中的神经保护机制，减少梗死面积，并保护缺血半暗带神经元，改善脑卒中动物的行为能力。
综上，本发明的药物可对缺血性脑卒中患者具有良好的神经保护作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种缺血性脑卒中的神经保护药物
<130> GYKH1118-2020P0111984CC
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60
gaa 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60
tcg 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60
tcc 63
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60
ccg 63

Claims (3)

1.DNA四面体在用于制备缺血性脑卒中的神经保护药物中的用途；
所述药物是降低缺血性脑卒中导致的大脑梗死的面积的药物；
和/或，所述药物是保护缺血半暗带神经元的药物；
所述DNA四面体由4条DNA单链通过碱基互补配对合成；所述DNA单链的序列如SEQ IDNO.1～4所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述DNA四面体的制备方法为：
将四条DNA单链溶于缓冲液中，加热到95℃保持10min，再降温至4℃维持20min以上。
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述缓冲液含有10mM Tris-HCl、50mMMgCl2，pH＝8.0。
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