CN111991412B - 一种治疗帕金森病的药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗帕金森病的药物，属于神经退行性疾病药物领域，本发明的药物以DNA四面体和维生素B12的复合物为活性成分，可以通过减少活性氧的生成、减少钙离子内流、恢复细胞自噬功能、减少路易小体主要成分的异常积聚来发挥治疗帕金森病的作用。

Description

一种治疗帕金森病的药物

技术领域

本发明属于神经退行性疾病药物领域。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经系统变性疾病。1817年英国医生James Parkinson首先对此病进行了详细的描述，其临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍，同时患者可伴有抑郁、便秘和睡眠障碍等非运动症状。

维生素B12又叫钴胺素，是唯一含金属元素的维生素。研究表明，在帕金森病患者血清内维生素B12水平降低，维生素B12被认为有潜力防止大脑神经受到破坏，拯救多巴能神经元的衰退表型。另外，同时补充维生素B12和叶酸可以降低帕金森病人同型半胱氨酸(Hcy)水平，并对于帕金森病及其并发症的治疗有效(侯芳林，刘瑞珍.血清叶酸、维生素B12与帕金森病相关性研究进展.中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(07)：737-739.)。因此，有人建议对帕金森病人日常补充维生素B12。

但是，仅补充维生素B12并不能显著改善帕金森病的症状。有人通过对1147名帕金森病人进行3年随访，发现在帕金森病人形成感官症状的危险比(hazard ratios fordeveloping sensory symptoms)在日常补充100μg以上维生素B12的组别和未补充维生素的组别之间无显著差别(Cameron Dietiker等.Characterization of Vitamin B12Supplementation and Correlation with Clinical Outcomes in a LargeLongitudinal Study of Early Parkinson’s Disease.J Mov Disord 2019；12(2)：91-96)。

四面体骨架核酸(tetrahedral framework nucleic acids，TFNAs)又称DNA四面体(tetrahedral DNA，TDN)、四面体DNA纳米结构，是一种由4条单链DNA通过链间碱基互补配对形成的一种四面体结构，它合成效率高，合成步骤简单，具有良好的生物安全性和生物相容性。发明人早期研究表明，TFNAs对帕金森病患者具有一定的神经保护和神经治疗作用，效果有待提高(崔伟同.四面体骨架核酸对帕金森病的神经保护和神经治疗作用.中国生物工程学会.中国生物工程学会第十三届学术年会暨2019年全国生物技术大会论文集.中国生物工程学会：中国生物工程学会，2019：3.)。

目前还未见将TFNAs与维生素B12用以制备治疗帕金森病的药物的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种新的治疗帕金森病的药物。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种复合物，所述复合物是DNA四面体和维生素B12的复合物。

如前述的复合物，所述DNA四面体由序列如SEQ ID NO.1～4所述DNA单链分子通过碱基互补配对构成。

如前述的复合物，所述复合物中DNA四面体与维生素B12的摩尔浓度比为1∶10～15。

如前述的复合物，所述复合物中DNA四面体与维生素B12的摩尔浓度比为1∶12。

本发明还提供了一种制备前复合物的方法，该方法为：将DNA四面体和维生素B12在20～25℃共同孵育30～60min，即可。

进一步地，孵育温度为25℃；

和/或，孵育时间30min。

本发明还提供了前述的复合物在制备治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

进一步地，所述神经退行性疾病为帕金森病。

本发明还提供了一种治疗神经退行性疾病的药物，所述药物以前述复合物为活性成分。

进一步地，所述神经退行性疾病为帕金森病。

本发明的有益效果如下：

维生素B12单独使用无法治疗帕金森病，DNA四面体有一定的神经治疗作用但不显著。本发明通过将DNA四面体和维生素B12制备成复合物，使得DNA四面体和维生素B12协同增效，对帕金森病的治疗产生显著积极的效果。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：材料的表征。A，TFNAs透射电镜观察；B，T-V复合物投射电极观察；C，TFNAsZETA电位；D，T-V复合物ZETA电位。

图2：材料的入胞。A，荧光显微镜观察；B，流式细胞仪检测。

图3：体外模拟材料穿过血脑屏障的能力。A，原理图；B，流式细胞仪检测图。

图4：材料对细胞内钙离子和活性氧水平的影响。

图5：材料对路易小体主要成分α-synuclein表达的影响。

图6：材料对凋亡自噬相关蛋白基因表达的影响。A，Lamp1基因表达；B，Rab10基因表达；C，Lamp1和Bcl2蛋白印迹检测。

图7：材料对小鼠脑部TH染色和尼氏染色的影响。A，尼氏染色；B，TH染色。

具体实施方式

实施例1T-V复合物的合成与鉴定

1.合成方法

1)将四条DNA单链(S1、S2、S3、S4)溶解于TM Buffer(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH＝8.0)中，使得四条DNA单链的终浓度为1000nM，充分混匀后迅速加热至95℃保持10分钟，之后迅速降温至4℃并维持20分钟以上，即可得到四面体骨架核酸TFNAs。

四条单链的序列(5′→3′)如下：

S1(SEQ ID NO.1)：

ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA

S2(SEQ ID NO.2)：

ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG

S3(SEQ ID NO.3)：

ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC

S4(SEQ ID NO.4)：

ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG

2)将1.5μM的维生素B12与125nM的TFNAs在25℃(20～25℃均可)孵育30min(30～60min均可)；即得四面体骨架核酸和维生素B12的复合物，简称T-V。

2.验证

图1A可见单纯的TFNAs粒径大小为20nm左右。T-V的粒径大小略大于单纯的TFNAs(图1B)。ZETA电位可见四面体骨架核酸所带电荷约为-6.34，T-V为-1.25(图1C、D)。以上结果均说明TFNAs和T-V成功合成。

以下将以实验例的形式对本发明进一步说明。未经特别说明，TFNAs和T-V复合物按照实施例1的方法制备。

实验例1帕金森病体外模型实验

1.方法

1.1构建帕金森病体外模型

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，分为Control组、MPTP组、vb12组、TFNAs组，T-V组。细胞贴壁生长24h时，五组分别弃去原培养液(1640RPMI)，PBS冲洗3次，对照组用含1％FBS的1640培养基继续培养。MPTP组、vb12组、TFNAs组，T-V组加入4mM的MPTP处理8h。随后，Control组和MPTP组更换为1640培养基；vb12组更换为1.5μM的维生素B12；TFNAs组更换为125nM TFNAs；T-V组更换为125nM T-V复合物溶液；五个组均处理6h。

1.2活性氧检测

选择DCFH-DA(2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐)法来检测活性氧的释放量。简单地说，用1640培养基将SH-SY5Y细胞在12孔板(3×10⁴/孔，5孔)中分组培养24小时。然后，在规定的时间内，对细胞进行MPTP和TFNAs治疗。经过相对处理后，在培养箱环境中用培养基(包括1‰(w/v)的DCFH-DA)孵育20分钟，然后用培养基冲洗3次，以去除残留的DCFH-DA。然后，在每个孔中加入300μ含有5-10μL的Hoechst(双苯并咪唑H33342三盐酸盐)的培养基对细胞核染色10分钟，其中Hoechst工作浓度为10μM。最后，用PBS清洗3次之后利用共聚焦显微镜获取免疫荧光图像。

1.3钙离子检测

选择邻甲酚酞络合铜比色法来检测钙离子的释放量。简单地说，将SH-SY5Y细胞在12孔板(3×10⁴/孔，5孔)中用1640培养基分组培养24小时。然后，在规定的时间内，对细胞进行MPTP和TFNAs治疗。经过相对处理后，在培养箱环境中用钙离子检测液孵育10分钟，然后用培养基冲洗3次。然后，在每个孔中加入300μ含有5-10μL的Hoechst(双苯并咪唑H33342三盐酸盐)的培养基对细胞核染色10分钟，其中Hoechst工作浓度为10μM。最后，用PBS清洗3次之后利用共聚焦显微镜获取免疫荧光图像。

1.4材料的摄取

将细胞分为三组接种在共聚焦小皿中，24小时后，分别加入单纯培养基、CY5标记的S1单链与VB12的复合材料(S1-V)和CY5标记的T-V。2小时后将细胞固定。为了方便定位细胞，随后将细胞膜和细胞核进行了染色。为了检测材料是否能穿越血脑屏障，采用小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3和SH-SY5Y细胞共培养来建立血脑屏障体外模型。在Transwell板子的上室培养bEnd.3细胞，培养7天直到在bEnd.3细胞之间形成一个紧密的连接。然后将bEnd.3细胞与接种了SHSY-5Y细胞的培养皿共同培养，最后cy-5标记的T-V加入到上室的bEnd.3中(如图4A所示)。24小时后，发明人通过流式细胞术检测带荧光的下室细胞，反映了材料通过的能力血脑屏障。

1.5蛋白基因表达检测

通过免疫组织化学方法检测路易小体主要成分a-synuclein，并进一步提取五组细胞的RNA和蛋白，使用荧光定量PCR和Western blot分别检测路易小体主要成分a-synuclein、凋亡相关基因Bcl-2，以及自噬相关基因Lamp1相关基因的表达。

2.结果

2.1材料的摄取

Cy5的荧光信号能体现S1-V和T-V的位置。从图2A和图2B可以看出，加入Cy5荧光基团标记的T-V的细胞相比对照组和S1-V，具有更强的荧光。表明T-V能够有效进入细胞。

通过流式细胞术检测带荧光的下室细胞的结果如图3B所示，可见加入T-V的组别，下室荧光阳性率比对照和加入S1-V的组别更高。表明T-V具有穿过血脑屏障的能力。

2.2钙离子和活性氧释放水平

当细胞内Ca²⁺浓度过高时，则会引起钙稳态失调，进而引起细胞死亡产生神经毒性作用。在细胞正常代谢过程中产生活性氧基团(ROS)，发挥重要的生理功能。当ROS的水平超过细胞生理需要时，由于其高度的活性，可通过关键分子如DNA、蛋白质及脂质的氧化降解，影响细胞结构及功能完整性。当ROS的水平超过体内抗氧化防御的水平时可产生氧化应激。而脑组织对氧化应激尤为易感。氧化应激通过各种途径引起黑质多巴胺神经元的死亡，是帕金森病重要的发病机制之一。

结果如图4所示，MPTP组的活性氧和钙离子荧光强度显著高于对照组。但是T-V组钙离子和活性氧强度相较于MPTP组、TFNAs组、Vb12组，有明显降低。

2.3相关蛋白和基因表达的检测

路易小体是帕金森病为代表的神经退行性疾病的主要病理特征性标志物，而α-synuclein是路易小体的主要成分，其减少说明帕金森病减轻。

α-synuclein表达水平如图5和表1所示，可见T-V组α-synuclein水平比单独的VB12和TFNAs更低；且治疗组(VB12、TFNAs和T-V组)相对于MPTP组减少量中，T-V组的高于VB12、TFNAs组与MPTP组差值之和，表明T-V组内的TFNAs和维生素B12起到了针对帕金森病的协同增效作用。

表1α-synuclein表达水平(根据荧光强度量化统计)

Lamp1表达水平如图6A和图6C所示，T-V组Lamp1表达水平比单独的VB12和TFNAs更高；且T-V组Lamp1表达水平相对于MPTP组的差值要高于VB12和TFNAs两者相对于MPTP组差值之和，表明T-V组内VB12余TFNAs起到协同增效作用。Lamp1是脑内自噬标志物，其水平升高表明T-V可增强细胞自噬，促进神经细胞内细胞器的更新，利于帕金森病减轻。

Rab10表达水平如图6B所示，T-V组Rab10表达水平比单独的VB12和TFNAs更低，更接近对照组。

Bcl2表达水平如图6C所示，MPTP组表达水平明显低于Control组、TFNAs组和T-V组，和VB12组差异不大。结果说明T-V的治疗效果明显高于单纯的VB12组。

图6中数据表示为平均值±SD(n＝4)。学生t检验用于统计分析。统计学分析：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

本实验例的结果说明：T-V复合材料可以抑制钙离子内流，减少氧化应激，促进细胞的自噬，从而达到抑制路易小体生成和治疗帕金森病的目的。

实验例2帕金森病体内模型实验

1.方法

1.1构建帕金森病体内模型

采用C57/BL 8-10周龄体重为25-30g的雄性C57/BL 30只，提前适应性训练三天，去除运动不协调的小鼠。分为Control组、MPTP组、Vb12组、TFNAs组，T-V组。其中MPTP组、vb12组、TFNAs组，T-V组按体重30-40mg/kg腹腔注射给药7天MPTP药物来构建帕金森病的疾病模型。同时Control组给等量的生理盐水。造模完成后，vb12组、TFNAs组，T-V组分别尾静脉给7天的Vb12、TFNAs和T-V。同时Control组、MPTP组给等量的生理盐水。

1.2制作石蜡切片和尼氏染色

制作石蜡切片。每组小鼠均被处死，取出全脑，在冰上切除小脑。剩下的部分被左右切开，一半放置在4％多聚甲醛中用于病理检查。生理盐水清洗脑组织后使用中性福尔马林固定30-50分钟；梯度酒精脱水(50％、70％、80％、95％、100％)各半小时；梯度二甲苯透明处理后浸蜡于石蜡I和石蜡II各半小时；升温至60℃，置于45-60℃的烫板上，换纯蜡3次(1-2小时/次)，倒好后置于冷水盆中，待石蜡全部凝固后取出晾干行切片粘片，烘干后30-40℃过夜。切片按序补水用二甲苯(2×30分钟)、无水乙醇(2×10分钟)、95、90、80和70％乙醇(各5分钟)清洗和蒸馏水。

尼氏染色。切片在Nissl溶液中染色10分钟，在95％的酒精中分化，最后脱水。切片用立式光学显微镜(CK31，Olympus，日本)观察，并采集图像进行分析。

1.3TH染色

切片按序补水用二甲苯(2×30分钟)、无水乙醇(2×10分钟)、95、90、80和70％乙醇(各5分钟)清洗和蒸馏水。然后在TH溶液中染色10分钟，在95％的酒精中分化，最后脱水。切片用立式光学显微镜(CK31，Olympus，日本)观察，并采集图像进行分析。

2.结果

尼氏小体是神经元合成蛋白质的主要场所。神经元受损时，尼氏体数量减少甚至消失，尼氏体大而多代表神经元合成蛋白质的功能较强。图7A尼氏染色(深蓝色)的结果显示，T-V组比TFNAs组、VB12组和MPTP组的尼氏小体数量更多，这说明T-V治疗组的神经元功能明显高于疾病模型MPTP组，同时T-V的治疗效果明显优于单纯的TFNAs和VB12。

酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)主要分布在黑质，其功能的缺失或表达不足直接影响多巴胺的合成与分泌。多巴胺是一种重要的神经递质，多巴胺能神经元对多巴胺不能合成或分泌不足会导致帕金森病。图7B中TH染色的结果说明T-V治疗后，TH阳性细胞数明显高于MPTP、TFNAs和Vb12组。

本实验例的结果表明，T-V可增强神经元合成蛋白质的功能，并增加TH的分泌，表明T-V对帕金森病产生了显著的治疗作用。T-V增强神经元合成蛋白的功能还可以用于治疗帕金森以外的其他神经退行性疾病。

综上，本发明的复合物，可以通过减少活性氧的生成、减少钙离子内流、恢复细胞自噬功能、减少路易小体主要成分的异常积聚来发挥治疗帕金森病的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种治疗帕金森病的药物

<130> GYKH1118-2020P0111486CC

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60

gaa 63

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60

tcg 63

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60

tcc 63

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60

ccg 63

Claims (8)

1.一种复合物，其特征在于：所述复合物是DNA四面体和维生素B12的复合物；所述DNA四面体由序列如SEQ ID NO .1～4所述DNA单链分子通过碱基互补配对构成；所述复合物中DNA四面体与维生素B12的摩尔浓度比为1:10～15。

2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述复合物中DNA四面体与维生素B12的摩尔浓度比为1:12。

3.一种制备权利要求1或2所述的复合物的方法，其特征在于：该方法为：将DNA四面体和维生素B12在20～25℃共同孵育30～60min，即可。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：孵育温度为25℃；和/或，孵育时间30min。

5.权利要求1或2所述的复合物在制备治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于：所述神经退行性疾病为帕金森病。

7.一种治疗神经退行性疾病的药物，其特征在于：所述药物以权利要求1或2所述复合物为活性成分。

8.如权利要求7所述的药物，其特征在于：所述神经退行性疾病为帕金森病。

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