CN112639119A - 检测核酸的方法 - Google Patents

检测核酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112639119A
CN112639119A CN201980056773.2A CN201980056773A CN112639119A CN 112639119 A CN112639119 A CN 112639119A CN 201980056773 A CN201980056773 A CN 201980056773A CN 112639119 A CN112639119 A CN 112639119A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
nucleic acid
detecting
recombinant protein
pei
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980056773.2A
Other languages
English (en)
Inventor
M.F.罗伯茨
S.M.张
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Original Assignee
GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd filed Critical GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Publication of CN112639119A publication Critical patent/CN112639119A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/125—Specific component of sample, medium or buffer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/137—Concentration of a component of medium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及用于检测包含絮凝剂和重组蛋白的样品中的核酸的方法，所述方法包括：(a)向所述样品中添加肝素和洗涤剂，(b)扩增至少一部分核酸，以及(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测所述样品中的所述核酸。本发明还涉及用于检测包含絮凝剂和重组蛋白的样品中的核酸的方法，所述方法包括：(a)向样品中添加洗涤剂和氢氧化钠，(b)扩增至少一部分核酸，以及(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测所述样品中的所述核酸。

Description

检测核酸的方法
本发明涉及在用于定量重组蛋白样品中的核酸的测定中减少干扰的方法，其通过向样品中添加肝素和洗涤剂，或向样品中添加洗涤剂和氢氧化钠，或向样品中添加洗涤剂并将样品的pH调节到至少约8。
技术背景
重组蛋白的大规模制造是生物技术行业的一项重要挑战。重组蛋白通常通过宿主细胞培养或通过无细胞系统产生。在每种情况下，从包含杂质的样品中纯化蛋白质至足以用作人治疗产品的纯度。
典型的方法包括初步澄清以除去固体颗粒，然后纯化以确保足够的纯度。澄清可以降低纯化期间后续色谱步骤的负担。典型的澄清步骤包括离心步骤或过滤步骤或两者。在澄清之前，可以采用预处理步骤作为调节样品的方法。调节预处理步骤的一个实例是絮凝，絮凝使固体颗粒形成较大的聚集体，然后通过澄清除去这些聚集体。PEI(聚乙烯亚胺)是一种絮凝剂，广泛用于抗体纯化方法中。
在生物制药产品生产期间，残留宿主细胞DNA是杂质，需要对其进行定量以确保其含量在可接受的水平内。残留DNA的水平通常在整个生产过程和原料药释放中受到严格监测和控制。实时定量PCR(qPCR)是一种广泛接受的用于定量重组治疗性蛋白质中的残留DNA的方法。然而，样品(例如，过程中或原料药样品)中的残留PEI强烈抑制残留DNA qPCR测定和用于产品质量和生物制药产品的释放测试中的许多其他测定。通常，由于存在浓度大于或等于20ppm的PEI，需要非常高的样品稀释度(例如1:10,000)来克服测定干扰。如此稀释样品对于满足关于每肠胃外剂量存在的残留宿主细胞基因组DNA的量(例如10ng/剂量)的管理要求所需的测定灵敏度产生很大风险。
因此，需要用于改进定量重组蛋白样品中的残留宿主细胞DNA的测定灵敏度的方法。
发明内容
在一方面，提供了用于检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，所述方法包括：
(a)向所述样品中添加洗涤剂和氢氧化钠(NaOH)，
(b)扩增至少一部分核酸，以及
(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测所述样品中的所述核酸。
在另一方面，提供了用于检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，所述方法包括：
(a)向所述样品中添加洗涤剂，
(b)将所述样品的pH调节到至少约8，
(c)扩增至少一部分核酸，以及
(d)检测步骤(c)中的扩增，从而检测所述样品中的所述核酸。
在又一方面，提供了用于检测包含絮凝剂和重组蛋白的样品中的核酸的方法，所述方法包括：
(a)向所述样本中添加肝素和洗涤剂，
(b)扩增至少一部分核酸，以及
(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测所述样品中的所述核酸。
附图说明
图1A是示出聚乙烯亚胺(PEI)的分子结构的示意图。示出了PEI的重复单元(顶部)和示例性分支PEI片段(底部)。图1B是示出PEI结合DNA并形成复合物的示意图。图1C是示出肝素的分子结构的示意图。
图2是示出在不同条件(例如是使用不同洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的处理条件)下获得的样品中的回收率的表。
图3是示出用于确定向含有PEI和DNA的样品中添加肝素和sarkosyl对测定灵敏度的影响的实验程序的示意图。
图4A是示出在用肝素和sarkosyl处理的样品中的加标回收率的表。图4B是在图4A的表中显示的结果的图。
图5是一组示出在用肝素(80μg/mL)和sarkosyl(0.05％)处理的具有100ppm PEI的mAb1洗脱液中的加标回收率表和图。
图6是示出在用sarkosyl或SDS加NaOH处理的具有20ppm PEI的mAb1原料药(BDS)样品中的加标回收率的图。
图7是示出在用不同浓度的SDS和NaOH处理的具有20ppm PEI和104pg/mL中国仓鼠卵巢(CHO)DNA的mAb2原料药(BDS)样品中的加标回收率的图。
图8是一组示出在不同浓度NaOH下具有20ppm PEI的mAb2原料药(BDS)样品中的加标回收率的图。
图9是一组示出在用0.5％SDS和25mMNaOH处理和通过Wako DNA提取的具有20％PEI和104pg/mL中国仓鼠卵巢(CHO)DNA的mAb1、mAb2和mAb3原料药(BDS)中的加标回收率的图。
具体实施方式
本发明至少部分基于以下发现：在进行qPCR分析之前，通过用肝素和洗涤剂(例如，sarkosyl)或洗涤剂(例如，SDS)和氢氧化钠处理样品，可以实现更灵敏的测定，该测定用于定量含有PEI的重组蛋白样品(例如，过程中或原料药样品)中的残留DNA。样品中的痕量PEI可以抑制许多测定，特别是残留宿主细胞DNA qPCR。
除去PEI并保留DNA，克服聚乙烯亚胺(PEI)对残留宿主细胞DNA qPCR测定和其他用于工艺过程开发和药物释放测试的测定的干扰，对于达到对证明生物制药产品的DNA清除所必需的测定灵敏度非常重要。
不受理论的束缚，认为用肝素和洗涤剂或洗涤剂和氢氧化钠处理样品减少PEI与DNA之间的相互作用，因此导致来自PEI的干扰减少并且提高qPCR测定灵敏度。不受理论的束缚，认为PEI结合DNA，并且带负电的分子(例如，肝素)可以竞争性地与PEI结合(PEI带正电)并由此释放DNA。
应理解，本发明不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应理解，本文所用的术语不旨在限制，而是仅用于描述特定实施方案的目的。如本说明书和所附权利要求书所用，除非上下文另有明确规定，否则单数名称包含其复数形式。因此，例如，提及“多肽”包括两种或更多种多肽的组合等。
术语“包含/包括”涵盖“包含/包括”或“由……组成”，例如，“包含/包括”X的组合物可以仅由X组成，或可以包含另外的东西，例如X+Y。术语“基本上由……组成”将特征的范围限制为指定的材料或步骤以及那些不会实质性影响要求保护的特征的基本特征的材料或步骤。术语“由……组成”排除任何另外组分的存在。
当涉及例如量、时间持续时间等的可测量值时，本文所用的“约”意味着涵盖偏离指定值±20％或±10％的变化，包括±5％、±1％和±0.1％，因为此类变化适合进行所公开的方法。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在实践中可以使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料用于本发明的测试，但是本文描述了优选的材料和方法。
重组蛋白
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指示氨基酸残基的聚合物。
如本文所用，“肽”包括作为本文具体示例的那些肽的保守变异的肽。如本文所用，“保守变异”是指氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基替代。保守变异的实例包括但不限于，将一个疏水性残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸)取代为另一种疏水性残基，或将一个极性残基取代为另一种极性残基，例如精氨酸取代为赖氨酸，谷氨酸取代为天冬氨酸，或谷氨酰胺取代为天冬酰胺等。可以彼此取代的中性亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。
“保守变异”还包括使用经取代的氨基酸替代未经取代的亲本氨基酸，条件是针对该经取代的多肽产生的抗体也与该未经取代的多肽发生免疫反应。此类保守取代在本文所述的蛋白质种类的定义内。
如本文所用，“治疗性蛋白质”是指可以向哺乳动物施用以引起组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的任何蛋白质和/或多肽。重组蛋白可以引起多于一种的生物学或医学反应。此外，术语“治疗有效量”是指与未接受此量的相应受试者相比导致但不限于治愈、预防或改善疾病、病症或副作用，或者降低疾病或病症进展的速度的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量以及有效引起患者生理功能的量，该生理功能增强或帮助第二药剂的治疗效果。
当涉及蛋白质一起使用时，“重组”指示该蛋白质已经在宿主细胞中重组表达。
重组蛋白可以包含抗原结合蛋白，例如抗体、单克隆抗体、抗体片段或结构域抗体。重组蛋白可以包含病毒蛋白、细菌毒素、细菌类毒素或癌症抗原。在一个实施方案中，重组蛋白是单克隆抗体。
如本文所用，术语“抗原结合蛋白”是指能够结合抗原的抗体、抗体片段和其他蛋白质构建体，例如结构域。
术语“抗体”在本文中以最广义使用来指示具有免疫球蛋白样结构域的分子。如本文所用，“免疫球蛋白样结构域”是指保留抗体分子的免疫球蛋白折叠特征的多肽家族，其含有两个β-折叠和通常保守的二硫键。该家族包括单克隆抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源偶联抗体；单可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫学有效片段、Fab、F(ab′)2、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv、双抗体、TANDABSTM等。
短语“单可变结构域”是指独立于不同可变区或结构域而特异性结合抗原或表位的抗原结合蛋白可变结构域(例如，VH、VHH、VL)。可以认为“结构域抗体”或“dAb”与能够结合抗原或表位的“单可变结构域”相同。术语“表位结合结构域”是指独立于不同结构域而特异性结合抗原或表位的结构域。
结构域抗体可以与其他可变区或可变结构域以一种形式(例如，同源多聚体或异源多聚体)存在，其中其他可变区或可变结构域不是通过单免疫球蛋白可变结构域的抗原结合所需要的(即，其中免疫球蛋白单可变结构域独立于另外的可变结构域而结合抗原)。
结构域抗体可以是人抗体可变结构域。dAb可以是人源的。换句话说，dAb可以基于人Ig框架序列。
如本文所用，术语“抗原结合位点”是指抗原结合蛋白上能够特异性结合抗原的位点，其可以是单结构域，或者可以是配对VH/VL结构域，如可以在标准抗体上发现的。单链Fv(ScFv)结构域也可以提供抗原结合位点。
抗原结合蛋白可以采取mAbdAb的蛋白质支架形式。“mAbdAb”和“dAbmAb”可互换使用，并且旨在具有与本文所用相同的含义。此类抗原结合蛋白包含与另外的结合结构域(例如结构域抗体)连接的蛋白质支架，例如Ig支架如IgG，例如单克隆抗体。mAbdAb具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个来自结构域抗体，并且至少一个来自配对VH/VL结构域。
如本文所用，“药物”是指可以施用到个体以通过与个体中的生物靶分子结合和/或改变其功能来产生有益的治疗或诊断效果的任何化合物(例如，小有机分子、核酸、多肽)。靶分子可以是由个体基因组编码的内源靶分子(例如，由个体基因组编码的酶、受体、生长因子、细胞因子)或由病原体基因组编码的外源靶分子。药物可以是dAb或mAb。
“dAb缀合物”是指包含dAb的组合物，药物通过共价或非共价连接化学缀合到dAb。优选地，dAb和药物共价键合。此种共价连接可以通过肽键或其他方式，例如通过经修饰的侧链。非共价键合可以是直接的(例如，静电相互作用，疏水相互作用)或间接的(例如，通过互补结合配偶体(例如，生物素和抗生物素蛋白)的非共价结合，其中一个配偶体与药物共价键合，并且互补结合配偶体与dAb共价键结合)。当使用互补结合配偶体时，结合配偶体之一可以直接或通过合适的接头部分与药物共价键合，并且互补结合配偶体可以直接或通过合适的接头部分与dAb共价键合。
如本文所用，“dAb融合体”是指包含dAb和多肽药物(其可以是多肽、dAb或mAb)的融合蛋白。dAb和多肽药物以单个连续多肽链的离散部(部分)形式存在。
本公开内容的方法可以应用于检测包含以下中的一种或更多种的样品中的核酸：重组蛋白、抗原结合蛋白、抗体、单克隆抗体(mAb)、结构域抗体(dAb)、dAb缀合物、dAb融合蛋白、mAbdAb或上述任何其他抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，重组蛋白样品包含治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，样品包含抗原结合蛋白。在一个实施方案中，样品包含单克隆抗体。
蛋白质的表达
重组蛋白可以通过许多常规技术中的任一种来制备。例如，可以从天然表达它们的细胞中纯化该蛋白质(例如，可以从产生它的杂交瘤中纯化抗体)，或者在重组表达系统中产生该蛋白质。在一个实施方案中，重组蛋白是从哺乳动物细胞或细菌细胞中产生/衍生的。在另一个实施方案中，哺乳动物细胞选自人或啮齿动物(例如仓鼠或小鼠)细胞。在另一个实施方案中，人细胞是HEK细胞，仓鼠细胞是CHO细胞，或小鼠细胞是NS0细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。
在某些实施方案中，宿主细胞选自CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、K562细胞、BHK细胞、PER.C6细胞和HEK细胞。或者，宿主细胞可以是选自大肠杆菌(E.coli)(例如，W3110、BL21)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其他合适的细菌的细菌细胞；和真核细胞，例如真菌或酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、曲霉属(Aspergillussp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙脉胞霉(Neurospora crassa))。
本文还描述了包含编码重组蛋白的重组核酸分子的载体。载体可以是表达载体，其包含与重组核酸可操作地连接的一种或更多种表达控制元件或序列。载体的实例包括质粒和噬菌粒。
合适的表达载体可以包含许多组分，例如复制起点、选择性标志物基因、一种或更多种表达控制元件(例如转录控制元件(例如启动子、增强子、终止子)和/或一种或更多种翻译信号)、信号序列或前导序列。表达控制元件和信号序列，如果存在的话，可以由载体或其他来源提供。例如，可以使用编码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译控制序列来指导表达。可以提供启动子以在所需细胞中表达。启动子可以是组成型的或诱导型的。例如，启动子可以可操作地连接至编码抗体、抗体链或其部分的核酸，使得它指导核酸的转录。
宿主细胞包含上述重组核酸分子或载体。
重组蛋白可以在细胞内表达。在另一个实施方案中，表达的重组蛋白具有信号序列(也称为信号肽)，其沿着细胞的分泌途径给蛋白质规定路线。
宿主细胞在适于表达重组蛋白的条件下生长。宿主细胞培养物可以在支持宿主细胞生长和重组蛋白表达的任何培养基中培养。此种培养基是本领域技术人员众所周知的。尽管重组蛋白的表达发生在宿主细胞的细胞质中，但是重组蛋白的最终位置可以是细胞质、周质或细胞外，这取决于重组蛋白的性质、所用宿主细胞和所用发酵条件。
发酵罐的体积可以是：
(i)约10,000升；约5,000升；约2,000升；约1,000升；约500升；约125升；约50升；约20升；约10升；约5升；或
(ii)5至10,000升；10至5,000升；20至2,000升；50至1,000升。
收获是发酵的结束。收获可以在发酵期间的被认为足以结束发酵过程并且回收表达的重组蛋白的任何时间点。收获可以包括排空细胞和细胞外培养基(即细胞培养物或肉汤)的发酵罐的可选步骤。
蛋白质的纯化
典型的纯化过程包括初步澄清以除去固体颗粒，然后纯化以确保重组蛋白具有足够的纯度。澄清可以降低纯化期间后续色谱步骤的负担。典型的澄清步骤包括沉降步骤——也称为沉降(例如，通过重力)、和/或离心步骤、和/或过滤步骤。在澄清之前，可以采用预处理步骤作为调节样品的方法。调节预处理步骤的一个实例是絮凝，絮凝使固体颗粒形成较大的聚集体，然后通过澄清除去这些聚集体。
纯化中可以使用一个或更多个色谱步骤，例如一种或更多种色谱树脂；和/或一个或更多个过滤步骤。例如，可以采用使用例如蛋白质A或L的树脂的亲和色谱法来纯化重组蛋白质。可替代地或除此之外，可以使用离子交换树脂例如阳离子交换树脂来纯化重组蛋白。
纯化的重组蛋白可以配制成药学上可接受的组合物。
样品
如本文所用，“原料药”样品或“BDS”样品是含有高浓度重组蛋白的样品。通常，原料药样品的蛋白质浓度为约50mg/mL至约250mg/mL。在一个实施方案中，原料药样品的蛋白质浓度为约100mg/mL至约120mg/mL。
在一个实施方案中，BDS样品包含至少约50mg/mL重组蛋白、至少约100mg/mL重组蛋白、至少约105mg/mL重组蛋白、至少约110mg/mL重组蛋白、至少约115mg/mL重组蛋白、至少约120mg/mL重组蛋白、至少约125mg/mL重组蛋白、至少约150mg/mL重组蛋白、至少约200mg/mL重组蛋白或至少约250mg/mL重组蛋白。在一个实施方案中，BDS样品包含约50mg/mL至约250mg/mL的重组蛋白。在另一个实施方案中，BDS样品包含约100mg/mL至约200mg/mL的重组蛋白。在另一个实施方案中，BDS样品包含约100mg/mL至约150mg/mL的重组蛋白。在另一个实施方案中，BDS样品包含约100mg/mL至约120mg/mL的重组蛋白。在一个实施方案中，重组蛋白是单克隆抗体。
如本文所用，“过程中”样品是包含低浓度的重组蛋白的样品。例如，过程中样品的蛋白质浓度通常具有约0.1mg/mL至约20mg/mL的蛋白质浓度。在一个实施方案中，过程中样品的蛋白质浓度为约1mg/mL至约15mg/mL。
在一个实施方案中，过程中样品包含约0.1mg/mL至约20mg/mL的重组蛋白。在一个实施方案中，过程中样品包含约0.5mg/mL至约20mg/mL的重组蛋白。在另一个实施方案中，过程中样品包含约1mg/mL至约20mg/mL的重组蛋白。在另一个实施方案中，过程中样品包含约1mg/mL至约15mg/mL的重组蛋白。在一个实施方案中，重组蛋白是单克隆抗体。
分析方法
本文所述的方法可以用于从样品中除去聚乙烯亚胺(PEI)，从而在各种分析方法中提高测定灵敏度。此类分析方法包括但不限于实时定量PCR(qPCR)、毛细管凝胶电泳(CGE)、表面等离振子共振(例如，BiacoreTM)和反相HPLC。
提供了一种在用于检测包含絮凝剂的样品中的分析物的测定中减少干扰和/或提高灵敏度的方法，该方法包括向样品中添加肝素和洗涤剂，从而在用于检测样品中的分析物的测定中减少干扰和/或提高灵敏度。在一个实施方案中，絮凝剂是PEI。在一个实施方案中，分析物是核酸。在一个实施方案中，样品还包含重组蛋白。在一个实施方案中，洗涤剂是sarkosyl或SDS。在一个实施方案中，测定是一种生物药物分析方法。在另一个实施方案中，测定是用于检测核酸的基于扩增的测定。在一个实施方案中，测定是qPCR。在另一个实施方案中，测定是毛细管凝胶电泳(CGE)。在另一个实施方案中，测定是表面等离子体共振。在另一个实施方案中，测定是反相HPLC。在一个实施方案中，将肝素添加到样品中至约50μg/mL至约1000μg/mL的最终浓度。在一个实施方案中，将sarkosyl添加到样品中至约0.01％至约2.0％的最终浓度。
提供了一种在用于检测包含絮凝剂的样品中的分析物的测定中减少干扰和/或提高灵敏度的方法，该方法包括(a)向样品中添加洗涤剂和氢氧化钠(NaOH)，从而在用于检测样品中的分析物的测定中减少干扰和/或提高灵敏度。在一个实施方案中，絮凝剂是PEI。在一个实施方案中，分析物是核酸。在一个实施方案中，样品还包含重组蛋白。在一个实施方案中，洗涤剂是sarkosyl或SDS。在一个实施方案中，测定是一种生物药物分析方法。在另一个实施方案中，测定是用于检测核酸的基于扩增的测定。在一个实施方案中，测定是qPCR。在另一个实施方案中，测定是毛细管凝胶电泳(CGE)。在另一个实施方案中，测定是表面等离子体共振。在另一个实施方案中，测定是反相HPLC。在一个实施方案中，将SDS添加到样品中至约0.01％至约2.0％的最终浓度。在一个实施方案中，将NaOH添加到样品中至约0.1mM至约100mM的最终浓度。
提供了一种在用于检测包含絮凝剂的样品中的分析物的测定中减少干扰和/或提高灵敏度的方法，该方法包括(a)向样品中添加洗涤剂，和(b)将样品的pH调节到至少约8，从而在用于检测样品中的分析物的测定中减少干扰和/或提高灵敏度。在一个实施方案中，絮凝剂是PEI。在一个实施方案中，分析物是核酸。在一个实施方案中，样品还包含重组蛋白。在一个实施方案中，洗涤剂是sarkosyl或SDS。在一个实施方案中，测定是一种生物药物分析方法。在另一个实施方案中，测定是用于检测核酸的基于扩增的测定。在一个实施方案中，测定是qPCR。在另一个实施方案中，测定是毛细管凝胶电泳(CGE)。在另一个实施方案中，测定是表面等离子体共振。在另一个实施方案中，测定是反相HPLC。在一个实施方案中，将pH调节到约9。在一些实施方案中，将SDS添加到样品中至约0.01％至2.0％的最终浓度。在一方面，提供了一种用于检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，该方法包括：(a)向样品中添加洗涤剂和氢氧化钠(NaOH)；(b)扩增至少一部分核酸；(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的核酸。
在一方面，提供了一种在检测包含絮凝剂和重组蛋白的样品中的核酸的测定中减少干扰和/或提高灵敏度的方法，该方法包括(a)向样品中添加肝素和洗涤剂，其中步骤(a)减少了核酸与絮凝剂之间的相互作用，该相互作用抑制了测定期间核酸的扩增，从而在用于检测样品中的核酸的测定中减少干扰和/或提高灵敏度。在一方面，提供了一种用于检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，该方法包括：(a)向样品中添加肝素和洗涤剂；(b)扩增至少一部分核酸；(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的核酸；其中步骤(a)减少了核酸和絮凝剂之间的相互作用，该相互作用抑制了测定期间核酸的扩增，从而在用于检测样品中的核酸的测定中减少干扰和/或提高灵敏度。在一些实施方案中，测定是qPCR。在一个实施方案中，将肝素添加到样品中至约50μg/mL至约1000μg/mL的最终浓度。在一个实施方案中，洗涤剂是sarkosyl。在一个实施方案中，将sarkosyl添加到样品中至约0.01％至约2.0％的最终浓度。
在一方面，提供了一种使用qPCR检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，该方法包括：(a)向样品中添加肝素和洗涤剂；(b)扩增至少一部分核酸；以及(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的核酸；其中步骤(a)减少了核酸和絮凝剂之间的相互作用，该相互作用抑制了测定期间核酸的扩增，从而在用于检测样品中的核酸的测定中减少干扰和/或提高灵敏度。
在一方面，提供了一种使用qPCR检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，该方法包括(a)向样品中添加肝素和洗涤剂，其中向样品中添加肝素至约50μg/mL至1000μg/mL的最终浓度；(b)扩增至少一部分核酸；以及(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的核酸；其中步骤(a)减少了核酸和絮凝剂之间的相互作用，该相互作用抑制了测定期间核酸的扩增，从而在用于检测样品中的核酸的测定中减少干扰和/或提高灵敏度。
在一方面，提供了一种使用qPCR检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，该方法包括(a)向样品中添加肝素和洗涤剂，其中洗涤剂是sarkosyl，并且向样品中添加到约0.01％至约2％的最终浓度；(b)扩增至少一部分核酸；以及(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的核酸；其中步骤(a)减少了核酸和絮凝剂之间的相互作用，该相互作用抑制了测定期间核酸的扩增，从而在用于检测样品中的核酸的测定中减少干扰和/或提高灵敏度。
在一方面，提供了一种使用qPCR检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，该方法包括(a)向样品中添加肝素和洗涤剂，其中洗涤剂是SDS，并且向样品中添加到约0.01％至约2％的最终浓度；(b)扩增至少一部分核酸；以及(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的核酸；其中步骤(a)减少了核酸和絮凝剂之间的相互作用，该相互作用抑制了测定期间核酸的扩增，从而在用于检测样品中的核酸的测定中减少干扰和/或提高灵敏度。
在另一方面，提供了一种在用于检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的基于扩增的测定中减少干扰和/或提高灵敏度的方法，该方法包括向样品中添加洗涤剂和氢氧化钠(NaOH)，其中步骤(a)减少了核酸-絮凝剂相互作用，该相互作用抑制了测定期间核酸的扩增，从而在用于检测样品中的核酸的测定中减少干扰和/或提高灵敏度。在一个实施方案中，测定是qPCR。在一个实施方案中，洗涤剂是SDS。在一个实施方案中，将SDS添加到样品中至约0.01％至约2.0％的最终浓度。在一个实施方案中，将NaOH添加到样品中至约0.1mM至约100mM的最终浓度。
在另一方面，提供了一种在用于检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的基于扩增的测定中减少干扰和/或提高灵敏度的方法，该方法包括(a)向该样品中添加洗涤剂；以及(b)将样品的pH调节到至少约8，其中步骤(a)和(b)减少了核酸-絮凝剂相互作用，该相互作用抑制了测定期间核酸的扩增，从而在用于检测样品中的核酸的测定中减少干扰和/或提高灵敏度。在一个实施方案中，测定是qPCR。在一个实施方案中，将pH调节到约9。在一个实施方案中，将SDS添加到样品中至约0.01％至2.0％的最终浓度。
在一个实施方案中，当与使用未经处理的样品的测定的灵敏度相比时，根据该方法对样品的处理导致测定的灵敏度提高了约5倍至200倍。在一个实施方案中，当与使用未经处理的样品的测定的灵敏度相比时，测定的灵敏度提高约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍、约100倍、约120倍、约140倍、约160倍、约180倍或约200倍。
在一个实施方案中，测定是用于检测核酸的基于扩增的测定。在一个实施方案中，测定是qPCR。在一个实施方案中，与使用未经处理的样品时约1:2000至1:10000的稀释因子相比，当以约1:200至约1:500的稀释因子稀释样品时根据该方法对样品的处理导致可接受的回收率，。
用于检测或定量核酸的方法
聚合酶链式反应(PCR)是一种常见的用于扩增DNA的热循环依赖性核酸扩增技术，由用以进行DNA解链和使用DNA聚合酶的酶促复制DNA的重复加热和冷却反应的循环组成。实时定量PCR(qPCR)是一种用于定量生物样品中的给定核酸序列的复制数的技术。目前，qPCR在整个反应过程中实时检测反应产物，并且将扩增曲线与对照的扩增比较，这些对照在每个反应开始时含有已知量的核酸(或已知的核酸与未知的测试核酸的相对比例)。对照的结果通常根据标准反应扩增曲线的对数部分用于构建标准曲线。这些值用于根据相较于标准对照量的未知核酸的扩增曲线来内插未知核酸量。
除PCR之外，还存在非热循环依赖性扩增系统或等温核酸扩增技术，包括但不限于：切口酶扩增反应、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)、自我持续序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、单引物等温扩增(SPIA)、Q-β复制酶系统和重组酶聚合酶扩增(RPA)。其他扩增技术包括连接酶链反应(LCR)、多重置换扩增(MDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和分支依赖性扩增(RAM)。
TaqMan qPCR系统广泛用于残留宿主细胞DNA的鉴定。TaqMan qPCR系统在两个引物之间添加荧光标记的探针、在PCR合成DNA片段期间聚合酶发夹探针、通过猝灭染料(quencher dye)失去控制的报告染料(reporter dye)，并与通过PCR合成的DNA片段数量按比例地生成荧光信号。与第一代PCR(常规PCR)相比，具有高通量的96孔形式显著提高了效率和定量能力。qPCR方法在灵敏度和特异性方面优异，但容易受到样品基质的干扰。通常，残留DNA宿主细胞DNA qPCR测定需要样品稀释、DNA提取和加标阳性对照DNA并评估加标回收率。
在一个实施方案中，通过实时定量PCR(qPCR)检测或定量样品中的核酸。在一个实施方案中，通过实时定量PCR(qPCR)检测或定量样品中的宿主细胞DNA。
洗涤剂
向重组蛋白样品中添加洗涤剂。在一个实施方案中，洗涤剂是sarkosyl。sarkosyl是一种阴离子表面活性剂。sarkosyl可以用于细胞裂解和蛋白质溶解。sarkosyl的结构提供如下：
Figure BDA0002954036150000131
在另一个实施方案中，洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。SDS的结构提供如下：
Figure BDA0002954036150000141
在另一些实施方案中，洗涤剂是胆酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X 100或吐温20。
在一个实施方案中，向重组蛋白样品中添加洗涤剂，使得样品中洗涤剂的浓度为约0.01％至约2.0％。在另一个实施方案中，样品中洗涤剂的浓度为约0.05％至约1.0％。在一个实施方案中，样品中洗涤剂的浓度为至少约0.01％、至少约0.05％、至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1.0％、至少约1.5％或至少约2.0％。在另一个实施方案中，样品中洗涤剂的浓度为约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％或约2.0％。
在一个实施方案中，向重组蛋白样品中添加sarkosyl，使得样品中sarkosyl的浓度为约0.01％至约2.0％。在另一个实施方案中，样品中sarkosyl的浓度为约0.05％至约1.0％。在一个实施方案中，样品中sarkosyl的浓度为至少约0.01％、至少约0.05％、至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1.0％、至少约1.5％或至少约2.0％。在另一个实施方案中，样品中sarkosyl的浓度为约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％或约2.0％。
在一个实施方案中，向重组蛋白样品中添加十二烷基硫酸钠(SDS)，使得样品中SDS的浓度为约0.01％至2.0％。在另一个实施方案中，样品中SDS的浓度为约0.05％至约1.0％。在一个实施方案中，样品中SDS的浓度为至少约0.01％、至少约0.05％、至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1.0％、至少约1.5％或至少约2.0％。在另一个实施方案中，样品中SDS的浓度为约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％或约2.0％。
在一个实施方案中，样品的pH为至少约8。在另一个实施方案中，样品的pH为约8至约11、或约9至约11。在一个实施方案中，样品的pH为至少约8、至少约9、至少约10或至少约11。在另一个实施方案中，样品的pH为约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5或约11。
氢氧化钠
在一个实施方案中，向重组蛋白样品中添加氢氧化钠(NaOH)。在一个实施方案中，向样品中添加NaOH，使得样品中NaOH浓度为约0.1mM至约100mM。在一个实施方案中，样品中NaOH的浓度为约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100mM。
在一个实施方案中，在向样品中添加NaOH之后，样品的pH为至少约8、至少约9、至少约10或至少约11。在另一个实施方案中，样品的pH为约8至约11、或约9至约11。在一个实施方案中，样品的pH为约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5或约11。
肝素
肝素是一种带强负电荷的分子。它可以用作抗凝剂(血液稀释剂)。肝素的结构示于图1C中。
在一个实施方案中，向重组蛋白样品中添加肝素。在一个实施方案中，向样品中添加肝素，使得样品中肝素的浓度为约50μg/mL至约1000μg/mL。在另一个实施方案中，肝素的浓度为约80μg/mL至约750μg/mL。在一个实施方案中，样品中肝素的浓度为至少约50μg/mL、至少约60μg/mL、至少约70μg/mL、至少约80μg/mL、至少约90μg/mL、至少约100μg/mL、至少约200μg/mL、至少约250μg/mL、至少约300μg/mL、至少约400μg/mL、至少约500μg/mL、至少约600μg/mL、至少约700μg/mL、至少约750μg/mL、至少约800μg/mL、至少约900μg/mL或至少约1000μg/mL。在一个实施方案中，样品中肝素的浓度为约50μg/mL、约60μg/mL、约70μg/mL、约80μg/mL、约90μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约250μg/mL、约300μg/mL、约400μg/mL、约500μg/mL、约600μg/mL、约700μg/mL、约750μg/mL、约800μg/mL、约900μg/mL或约1000μg/mL。
絮凝剂
絮凝剂引起不溶或固体物质的聚集，使得可溶性重组蛋白保留在溶液中。
絮凝剂包括：矿物或植物的水胶体；阳离子聚电解质(例如，聚乙烯亚胺(PEI)、阳离子聚丙烯酰胺)；聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)；聚胺；聚氨基酸；聚丙烯酰胺；聚烯丙基胺；聚乙烯胺；聚-N-甲基乙烯基胺(PMVA)；来自微生物的天然聚合物(例如，壳聚糖)；以及化学絮凝剂，例如硫酸铝、合成和非合成聚合物。絮凝剂的具体实例包括PEI、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)(低分子量版本MW：100kDa至200kDa；或高分子量版本400kDa至500kDa)、酸沉淀、CaCl2、壳聚糖(MW：110kDa)。
在一个实施方案中，絮凝剂是阳离子聚合物。在一个实施方案中，絮凝剂是聚二烯丙基二甲基氯化铵(pDADMAC)、聚胺、聚氨基酸、聚丙烯酰胺、壳聚糖、聚烯丙基胺、聚乙烯胺、聚乙烯亚胺(PEI)或聚N-甲基乙烯胺(PMVA)。
在一个实施方案中，絮凝剂是聚乙烯亚胺(PEI)。聚乙烯亚胺(PEI)是一种有机聚阳离子(带正电荷的聚合物)。PEI可以是线性、支化的(低支链、高支链)并且具有强正电荷(图1A)。PEI可以强有力且牢固地结合DNA(图1B)。PEI可以用作絮凝剂，以在下游纯化过程中除去宿主细胞DNA和HCP。PEI可以用于微生物细胞培养和CHO平台下游纯化过程。PEI还广泛用作基因治疗和转染的非病毒载体。通常，用于下游纯化的PEI是高度支化的，分子量为750kDa。
在一个实施方案中，絮凝剂是阳离子的。在一个实施方案中，絮凝剂是聚乙烯亚胺(PEI)。在一个实施方案中，PEI是高度支化的。在一个实施方案中，PEI具有约750kDa的分子量。
在一个实施方案中，重组蛋白样品包含约0至约1000ppm、或约10至约1000ppm、或约20至1000ppm、或约100至约1000ppm、或约20至约200ppm的絮凝剂。在一个实施方案中，样品包含至少约0.001ppm的絮凝剂、至少约0.01ppm的絮凝剂、至少约0.1ppm的絮凝剂、至少约1ppm的絮凝剂、至少约10ppm的絮凝剂、至少约20ppm的絮凝剂、至少约50ppm的絮凝剂、至少约100ppm的絮凝剂、至少约200ppm的絮凝剂、至少约500ppm的絮凝剂或至少约1000ppm的絮凝剂。在一个实施方案中，样品包含约50ppm至约1000ppm的絮凝剂。在一个实施方案中，样品包含约100ppm至约1000ppm的絮凝剂。在一个实施方案中，样品包含约10ppm至约500ppm的絮凝剂。在一个实施方案中，样品包含约20ppm至约200ppm的絮凝剂。
在一个实施方案中，样品包含约0至约1000ppm的聚乙烯亚胺(PEI)。在一个实施方案中，样品包含至少约0.001ppm的PEI、至少约0.01ppm的PEI、至少约0.1ppm的PEI、至少约1ppm的PEI、至少约10ppm的PEI、至少约20ppm的PEI、至少约50ppm的PEI、至少约100ppm的PEI、至少约200ppm的PEI、至少约500ppm的PEI或至少约1000ppm的PEI。在一个实施方案中，样品包含约50ppm至约1000ppm的PEI。在一个实施方案中，样品包含约100ppm至约1000ppm的PEI。在一个实施方案中，样品包含约10ppm至约500ppm的PEI。在一个实施方案中，样品包含约20ppm至约200ppm的PEI。
在一个实施方案中，向重组蛋白样品中添加肝素和sarkosyl，使得样品包含PEI、肝素和sarkosyl，比例为约1000ppm PEI:750μg/mL肝素:1％sarkosyl。
在一个实施方案中，向样品中添加SDS和氢氧化钠(NaOH)，其中样品中SDS的浓度为约0.5％，并且样品中NaOH的浓度为约25mM。
在一个实施方案中，向样品中添加sarkosyl和肝素，其中样品中sarkosyl的浓度为约1.0％，其中样品中肝素的浓度为约750μg/mL，其中该样品包含约1000ppm的PEI，并且其中该样品包含约1mg/mL至约15mg/mL重组蛋白。在另一个实施方案中，向样品中添加sarkosyl和肝素，其中样品中sarkosyl的浓度为约0.05％，其中样品中肝素的浓度为80μg/mL，其中样品包含约100ppm的PEI，并且其中样品包含约1mg/mL至约15mg/mL的重组蛋白。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测样品中的宿主细胞DNA的方法，该样品包含约1mg/mL至约15mg/mL的重组蛋白和约100ppm至约1000ppm的聚乙烯亚胺(PEI)，该方法包括：
(a)向样品中添加肝素和sarkosyl，其中肝素的浓度为约80μg/mL至约750μg/mL，并且sarkosyl的浓度为约0.05％至约1.0％，
(b)扩增至少一部分宿主细胞DNA，以及
(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的宿主细胞DNA。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测样品中的宿主细胞DNA的方法，该样品包含约1mg/mL至约15mg/mL的重组蛋白，该方法包括：
(a)向样品中添加肝素和sarkosyl，其中肝素的浓度为约80μg/mL至约750μg/mL，并且sarkosyl的浓度为约0.05％至约1.0％，
(b)扩增至少一部分宿主细胞DNA，以及
(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的宿主细胞DNA。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测样品中的宿主细胞DNA的方法，该样品包含约100mg/mL至约120mg/mL的重组蛋白和约20ppm至约200ppm的聚乙烯亚胺(PEI)，该方法包括：
(a)向样品中添加十二烷基硫酸钠(SDS)和氢氧化钠(NaOH)，其中样品的pH值为至少约8，其中样品中SDS的浓度为约0.5％，其中样品中NaOH的浓度约25mM，
(b)扩增至少一部分宿主细胞DNA，以及
(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的宿主细胞DNA。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测样品中的宿主细胞DNA的方法，该样品包含约100mg/mL至约120mg/mL重组蛋白，该方法包括：
(a)向样品中添加十二烷基硫酸钠(SDS)和氢氧化钠(NaOH)，其中样品的pH值为至少约8，其中样品中SDS的浓度为约0.5％，其中样品中NaOH的浓度为约25mM，
(b)扩增至少一部分宿主细胞DNA，以及
(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的宿主细胞DNA。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测样品中的宿主细胞DNA的方法，该样品包含约100mg/mL至约120mg/mL的重组蛋白和约20ppm至约200ppm的聚乙烯亚胺(PEI)，该方法包括：
(a)向样品中添加十二烷基硫酸钠(SDS)，其中样品中SDS的浓度约为0.5％，
(b)将样品的pH调节到至少约8，
(c)扩增至少一部分宿主细胞DNA，以及
(d)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的宿主细胞DNA。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测样品中的宿主细胞DNA的方法，该样品包含约100mg/mL至约120mg/mL重组蛋白，该方法包括：
(a)向样品中添加十二烷基硫酸钠(SDS)，其中样品中SDS的浓度约为0.5％，
(b)将样品的pH调节到至少约8，
(c)扩增至少一部分宿主细胞DNA，以及(d)检测步骤(b)中的扩增，从而检测样品中的宿主细胞DNA。
在一个实施方案中，样品中核酸的浓度为约109pg/mL至约103pg/mL。在一个实施方案中，样品中核酸的浓度为约109pg/mL，约108pg/mL，约107pg/mL，约106pg/mL，约105pg/mL，约104pg/mL或约103pg/mL。在一个实施方案中，样品中的核酸是DNA。在一个实施方案中，样品中的核酸是宿主细胞DNA。
在一个实施方案中，该方法还包括使样品中的核酸变性的步骤。在一个实施方案中，使核酸变性的步骤包括核酸的热变性。在一个实施方案中，使核酸变性的步骤包括在约85℃、约90℃或约95℃的温度下孵育样品。在一个实施方案中，使核酸变性的步骤包括在约85℃、约90℃或约95℃下孵育样品约5min、约10min或约15min。在一个实施方案中，使核酸变性的步骤在向样品中添加洗涤剂的步骤之后进行。在一个实施方案中，使核酸变性的步骤在向样品中添加洗涤剂和NaOH的步骤之后进行。在另一个实施方案中，使核酸变性的步骤在向样品中添加洗涤剂并将样品的pH调节到至少约8的步骤之后进行。在另一个实施方案中，使核酸变性的步骤在向样品中添加肝素和洗涤剂的步骤之后进行。在一个实施方案中，核酸是DNA。
在一个实施方案中，该方法还包括对样品进行离心的步骤。在一个实施方案中，对样品进行离心的步骤包括以约10000rpm至约16000rpm对样品进行离心。在一个实施方案中，以约10000rpm、约11000rpm、约12000rpm、约13000rpm、约14000rpm、约15000rpm或约16000rpm对样品进行离心。在一个实施方案中，对样品进行离心的步骤包括以约10000rpm、约11000rpm、约12000rpm、约13000rpm、约14000rpm、约15000rpm或约16000rpm对样品离心约5min、约10min或约15min。在一个实施方案中，对样品进行离心的步骤在向样品中添加洗涤剂的步骤之后进行。在一个实施方案中，对样品进行离心的步骤在向样品中添加洗涤剂和NaOH的步骤之后进行。在另一个实施方案中，对样品进行离心的步骤在向样品中添加洗涤剂并将样品的pH调节到至少约8的步骤之后进行。在另一个实施方案中，对样品进行离心的步骤在向样品中添加肝素和洗涤剂的步骤之后进行。在另一个实施方案中，对样品进行离心的步骤在使核酸变性的步骤之后进行。在一个实施方案中，核酸是DNA。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，该方法包括：
(a)向样品中添加洗涤剂和氢氧化钠(NaOH)，
(b)使核酸变性，
(c)对样品进行离心，
(d)扩增至少一部分核酸，以及
(e)检测步骤(d)中的扩增，从而检测样品中的核酸。
在另一个实施方案中，提供了一种用于检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，该方法包括：
(a)向样品中添加洗涤剂，
(b)将样品的pH调节到至少约8，
(c)使核酸变性，
(d)对样品进行离心，
(e)扩增至少一部分核酸，以及
(f)检测步骤(e)中的扩增，从而检测样品中的核酸。
在又一个实施方案中，提供了一种用于检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，该方法包括：
(a)向样本中添加肝素和洗涤剂，
(b)使核酸变性，
(c)对样品进行离心，
(d)扩增至少一部分核酸，以及
(e)检测步骤(d)中的扩增，从而检测样品中的核酸。
实施例
本发明人已经设计了样品制备方案，该方案已经证明了克服了由于PEI对残留DNAqPCR测定的干扰影响的能力。开发的样品制备利用在热变性和离心之前向样品中添加的阴离子试剂(肝素)和洗涤剂(sarkosyl)的新混合物。其他开发的样品制备利用向样品中添加的洗涤剂(SDS)和氢氧化钠。在一些样品制备中，通过用肝素/sarkosyl分离PEI和DNA并对样品进行离心将DNA与PEI/肝素/sarkosyl复合物分离，来从样品中分离并(部分或全部)除去PEI，离心后PEI保留在溶液中。至少一些样品是含有mAb1、mAb2或mAb3的过程中或原料药样品。mAb1、mAb2和mAb3是单克隆抗体，其中每个结合不同的靶标。
实施例1
PEI对qPCR的干扰
通常，过程中样品中有100ppm(0.01％)PEI，并且BDS(原料药)样品中有20ppm(0.002％)PEI。这些样品需要稀释2000倍至10000倍，以通过qPCR获得可接受的DNA回收率(图2)。这导致两个问题。首先，测定灵敏度降低，因为报告的结果低于定量(LOQ)x稀释因子的限制，稀释因子为10000，并且LOQ为1pg/mL，结果小于10000pg/mL。其次，存在无法满足FDA对残留DNA的要求(10ng/剂量)的重大风险。
用肝素和sarkosyl处理的样品的Wako DNA/qPCR结果
图4示出了包含0.1％(1000ppm)PEI+104pg/mL中国仓鼠卵巢(CHO)细胞DNA最终浓度的样品的回收率。当仅PEI(未处理)与用肝素和sarkosyl处理的进行比较时，存在很大差异。在仅以10000稀释的PEI(未处理)下，通过第一级加标检测不到DNA，并且第二级加标回收率为25％。在肝素和sarkosyl处理下，在1:100时，第一级加标示出回收率为76.5％，并且第二级加标回收率为62.7％。测定灵敏度提高了至少100倍。
图5示出了用肝素(80μg/mL)和sarkosyl(0.05％)处理的具有100ppm PEI的mAb1液体苯基洗脱液样品的回收率。
原料药(BDS)样品的结果
本发明人发现，即使在加热和离心样品之后，用肝素和sarkosyl处理的BDS样品也具有固体样的稠度。
代替肝素和sarkosyl，用十二烷基硫酸钠(SDS)和氢氧化钠(NaOH)处理BDS样品。图6示出了用SDS和NaOH处理的具有20ppm PEI和104pg/mL CHO细胞DNA的mAb1原料药(BDS)样品的回收率。图6中的结果表明，SDS加NaOH的效果优于sarkosyl。图7和图8示出了用SDS和NaOH处理的具有20ppm PEI和104pg/mL CHO细胞DNA的mAb2 BDS的回收率。结果表明，0.5％SDS+25mM NaOH从BDS样品中除去了PEI。图7中的结果还表明0.5％SDS是最佳测定条件，并且10mM NaOH的效果优于5mM NaOH。用SDS和NaOH处理的样品的pH为约9-11。
图9示出了用0.5％SDS和25mM NaOH处理的具有20ppm PEI和104pg/mL CHO细胞DNA的mAb1BDS、mAb2 BDS和mAb3 BDS样品的回收率。未经处理的具有20ppm PEI的BDS需要1:2000稀释，以达到超过60％的加标回收率。0.5％SDS+25mM NaOH处理将测定灵敏度提高约10倍。通过1:200稀释，qPCR结果可以容易地满足FDA对残留DNA qPCR测定的要求。
结果总结
总而言之，结果表明，在样品中使用0.5％SDS和25mM NaOH(最终浓度)有效除去样品中的PEI，并且将对BDS样品(20ppm PEI)的测定灵敏度提高10倍。结果还表明，对于1000ppm PEI，750μg/mL肝素+1％sarkosyl，并且对于100ppm PEI，80μg/mL肝素+0.05％sarkosyl，将对过程中样品的qPCR测定灵敏度提高20-100倍。
使用以下材料和方法获得实施例1中所述的结果：
材料和方法
化学品和样品
肝素钠盐购自Sigma-Aldrich(H3149)。N-月桂酰肌氨酸(Sarcosyl)钠盐购自Sigma-Aldrich(L9150)。10％SDS，十二烷基硫酸钠溶液通过Life Technology(24730)购自gibco。氢氧化钠购自Sigma-Aldrich(S8045)。聚乙烯亚胺750kDa(PEI)来自AldrichChemistry目录号181878，批号MKBW9508V，在H2O中50wt％。脱氧胆酸钠来自Sigma-Aldrich(D5670)。Wako DNA提取试剂盒来自Wako(295-50201)，Kingfisher flex自动DNA提取试剂：来自BioMerieux的EasyMag试剂、EasyMag缓冲液1#280130、EasyMag缓冲液2#280131、EasyMag缓冲液3#280132、EasyMag裂解缓冲液#280134、EasyMag磁性硅石#280133。该研究使用在CHO细胞中制造的五种不同抗体的BDS(原料药)和过程中样品。
CHO DNA qPCR方法
TaqMan通用PCR主混合物购自Applied Biosystems(目录号4304437)。使用来自AppliedBiosystems的7500实时PCR系统。选择用于该测定的引物和探针靶向CHO Alu-2等效序列。扩增子大小为107bp。CHO DNA标准是从CHO DG44裸细胞系分离的基因组DNA。用分光光度计(Agilent 8453)通过OD 260/280确定DNA浓度。无核酸酶水来自Ambion(AM9932)。运行TaqMan标准程序45次循环，重复进行DNA提取，并通过4次重复非加标和4次重复加标进行qPCR。CHO DNA qPCR的LOD和LOQ为0.3和1.0pg/mL。通过加标样品的平均浓度-未加标样品的平均浓度/10000pg/mL计算加标回收率。加标回收率的接受标准为60％-140％。
由于Wako DNA提取/qPCR可能既费时又费力，因此直接微滴数字PCR(ddPCR)也用于比较不同的测定条件。Bio-RadddPCR系统(Qx200微滴发生器，PX1 PCR板封闭剂，T100热循环仪，QX200微滴读取器)。ddPCR试剂购自Bio-Rad，用于探针的ddPCR Suppermix(目录号1863010)，用于探针的微滴产生油(目录号1863005)，微滴读取器油(目录号1863031)。引物和探针与实时荧光定量PCR所用的相同，CHO DNA标准中每μL到pg/mL转换的拷贝数与实时PCR所用的相同。
样品制备
下面描述的样品制备流程图示于图3中。
1.)将PEI添加到样品或水中，最终浓度为20ppm(0.002％)至2000ppm(0.2％)。将50μL含有PEI的样品或水转移到Eppendorf管中。添加10μL CHO DNA标准液(105pg/mL或106pg/mL)。这是第一级加标。涡旋混合并在室温下放置10min。PEI快速且牢固地结合DNA。
2.)添加肝素最终浓度为80-750μg/mL，sarkosyl最终浓度0.05-1％。总体积为100μL。涡旋混合并在室温下放置10min。
3.)通过加热块在90℃下孵育10min。
4.)在室温下以14000rpm离心10min。
5.)用无核酸酶水以1:50-10000稀释样品，将CHO DNA加标到样品中(最终104pg/mL，向500μL稀释的样品中添加5μL 106pg/mL CHO DNA)。这是第二级加标。进行ddPCR或Wako DNA提取/qPCR。

Claims (29)

1.用于检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，所述方法包括：
(a)向所述样品中添加洗涤剂和氢氧化钠(NaOH)，
(b)扩增至少一部分核酸，以及
(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测所述样品中的所述核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤剂是SDS。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂是PEI。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述样品包含浓度为约20ppm至约200ppm的絮凝剂。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述样品包含浓度为约50mg/mL至约250mg/mL的重组蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述洗涤剂是SDS，并且所述样品中SDS的浓度为约0.01％至约2.0％。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述样品中NaOH的浓度为约0.1mM至约100mM。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的扩增包括聚合酶链反应(PCR)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述核酸是宿主细胞DNA。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是抗体，例如单克隆抗体。
11.用于检测包含重组蛋白和絮凝剂的样品中的核酸的方法，所述方法包括：
(a)向所述样品中添加洗涤剂，
(b)将所述样品的pH调节到至少约8，
(c)扩增至少一部分核酸，以及
(d)检测步骤(c)中的扩增，从而检测所述样品中的所述核酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述洗涤剂是SDS。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂是PEI。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述样品包含浓度为约20ppm至约200ppm的絮凝剂。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述样品包含浓度为约50mg/mL至约250mg/mL的重组蛋白。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，其中所述洗涤剂是SDS，并且所述样品中SDS的浓度为约0.1％至约2.0％。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的扩增包括聚合酶链反应(PCR)。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述核酸是宿主细胞DNA。
19.根据权利要求11-18中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是抗体，例如单克隆抗体。
20.用于检测包含絮凝剂和重组蛋白的样品中的核酸的方法，所述方法包括：
(a)向所述样品中添加肝素和洗涤剂，
(b)扩增至少一部分核酸，以及
(c)检测步骤(b)中的扩增，从而检测所述样品中的所述核酸。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述洗涤剂是sarkosyl。
22.根据权利要求20-21中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂是PEI。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂以约100ppm至约1000ppm的浓度存在于所述样品中。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白以约0.1mg/mL至约20mg/mL的浓度存在于所述样品中。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述洗涤剂是sarkosyl，并且所述样品中sarkosyl的浓度为约0.01％至约2.0％。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述样品中肝素的浓度为约50μg/mL至约1000μg/mL。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的扩增包括聚合酶链反应(PCR)。
28.根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其中所述核酸是宿主细胞DNA。
29.根据权利要求20-28中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是抗体，例如单克隆抗体。
CN201980056773.2A 2018-08-30 2019-08-26 检测核酸的方法 Pending CN112639119A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862724696P 2018-08-30 2018-08-30
US62/724,696 2018-08-30
PCT/IB2019/057154 WO2020044201A1 (en) 2018-08-30 2019-08-26 Methods of detecting nucleic acid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112639119A true CN112639119A (zh) 2021-04-09

Family

ID=68109404

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980056773.2A Pending CN112639119A (zh) 2018-08-30 2019-08-26 检测核酸的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20210246497A1 (zh)
EP (1) EP3844301A1 (zh)
JP (1) JP2021536241A (zh)
KR (1) KR20210049880A (zh)
CN (1) CN112639119A (zh)
IL (1) IL281037A (zh)
SG (1) SG11202101113YA (zh)
WO (1) WO2020044201A1 (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2586213A1 (en) * 2004-11-03 2006-05-26 Curagen Corporation Formulations, methods of production and uses of fgf-20
US20060177855A1 (en) * 2005-01-21 2006-08-10 Utermohlen Joseph G Nanoparticles for manipulation of biopolymers and methods of thereof
CN102675469A (zh) * 2012-03-08 2012-09-19 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 新型鸭呼肠孤病毒重组σB(SigmaB)蛋白抗原、制备方法及应用
CN104245922A (zh) * 2011-12-15 2014-12-24 安姆根有限公司 絮凝方法
US20150291656A1 (en) * 2012-11-01 2015-10-15 Novozymes A/S Method for removal of dna

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1654279A2 (en) * 2003-08-06 2006-05-10 ZymoGenetics, Inc. Adipocyte complement related protein zacrp12
WO2006073472A2 (en) * 2004-05-21 2006-07-13 Mo Bio Laboratories, Inc. Kits and processes for removing contaminants from nucleic acids in environmental and biological samples
KR20070058621A (ko) * 2004-09-17 2007-06-08 센텔리옹 에스아에스 플라스미드 ｄｎａ의 안정한 액체 제제
RU2015128651A (ru) * 2013-01-31 2017-03-06 Глаксо Груп Лимитед Способ продуцирования белка

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2586213A1 (en) * 2004-11-03 2006-05-26 Curagen Corporation Formulations, methods of production and uses of fgf-20
US20060177855A1 (en) * 2005-01-21 2006-08-10 Utermohlen Joseph G Nanoparticles for manipulation of biopolymers and methods of thereof
CN104245922A (zh) * 2011-12-15 2014-12-24 安姆根有限公司 絮凝方法
CN102675469A (zh) * 2012-03-08 2012-09-19 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 新型鸭呼肠孤病毒重组σB(SigmaB)蛋白抗原、制备方法及应用
US20150291656A1 (en) * 2012-11-01 2015-10-15 Novozymes A/S Method for removal of dna

Also Published As

Publication number Publication date
US20210246497A1 (en) 2021-08-12
EP3844301A1 (en) 2021-07-07
IL281037A (en) 2021-04-29
SG11202101113YA (en) 2021-04-29
WO2020044201A1 (en) 2020-03-05
KR20210049880A (ko) 2021-05-06
JP2021536241A (ja) 2021-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220289832A1 (en) Protein purification
US10487133B2 (en) Codon optimization for titer and fidelity improvement
JP2015213511A (ja) 免疫グロブリン溶液を精製するための方法
TW201444863A (zh) 增加蛋白質之焦－麩胺酸形成的方法
EP2951192A1 (en) Method of producing a protein
US20210188953A1 (en) Heteromultimeric binding molecules for toxin neutralization, compositions and methods thereof
US20210261626A1 (en) Genetically encoded polypeptide for affinity capture and purification of biologics
CN112313336A (zh) 一种用于优化抗体表达的方法
US11603548B2 (en) Fc-binding protein exhibiting improved alkaline resistance, method for producing said protein, antibody adsorbent using said protein, and method for separating antibody using said antibody adsorbent
WO2014115430A1 (ja) ヒト化抗ｈｍｇｂ１抗体もしくはその抗原結合性断片
KR20210119374A (ko) 항-Taq DNA 중합효소 항체 및 이의 응용
KR20150027743A (ko) 재조합 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 단백질의 정제 방법
KR20200045485A (ko) 바이러스 오염물을 불활성화하는 방법
CN109306008B (zh) 一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法
JP2021525548A (ja) 転写調節エレメント及びそれの外来タンパク質発現の増強における応用
CN116462766A (zh) 用于生产ig样分子的方法和手段
CN112639119A (zh) 检测核酸的方法
JP7125933B2 (ja) 免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの回収精製法
US20180105554A1 (en) Use of dextran sulfate to enhance protein a affinity chromatography
US20160362448A1 (en) Methods for reducing chromatin content in protein preparations by treatment with alkyl cations
JP2022548100A (ja) 低温、広いｐＨ範囲、及び高塩濃度で活性な新規な非特異的易熱性ヌクレアーゼ
CN118344468A (zh) 抗SARS-CoV-2的中和抗体、其抗原结合片段及应用
CN118344469A (zh) 抗SARS-CoV-2的中和抗体、其抗原结合片段及应用
CN113912708A (zh) 单域重链抗体及其编码基因和制备方法及应用和药物组合物
CN117343172A (zh) 一种抗TGFβ的人源化纳米抗体及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination