CN112611614A - 一种细胞半固态悬液的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞半固态悬液的制备方法及其应用，属于生物医学技术领域，具体步骤如下：选择对照细胞来源，并对细胞进行培养，培养完成后离心收集细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；对薄层切片进行预处理，加入半固态缓冲液制作细胞半固态悬液。利用本发明制备的细胞半固态悬液作为对照品，能够在减少一半的实验量的效果下，保证是实验的完全对照。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种细胞半固态悬液的制备方法及其应用。
背景技术
免疫组化、原位杂交等原位切片染色技术应用十分广泛，但在实际工作中必须设置阴性对照片与阳性对照片，其中阳性对照片一般为人体病变组织所制成的切片，在实验过程中使用和待测切片完全一致的操作流程与试剂，用以监控实验本身的可靠性。
目前，使用人体病变组织制成的切片做为阳性对照有3大缺陷。第一：这种人体病变组织个体存在差异性，且来源不稳定。如在ER项目检测中，从某一乳腺癌患者乳腺组织取材检测后为较为典型的ER阳性，该组织可做为其他病理切片检测的阳性对照片，但是该阳性对照片是有限的，用尽后需要找其他患者ER阳性的组织，但是由于肿瘤的异质性，从其他患者收集到的组织检测结果很难获得和之前阳性对照片完全一致的检测结果，组织癌变类型也不尽相同，很难保证对照切片的一致性。第二：由于组织蜡块是来源于患者人体组织，其归属权归于患者，严格来说病理科使用患者的蜡块用于制作阳性对照片存在伦理以及法律归属权上的风险，更不可能将患者的蜡块用于商业化开发。第三：由于每片待测切片都需要一张阳性对照进行监控，大大增加了病理科的实验工作量和阅片工作量。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种细胞半固态悬液的制备方法及其应用，利用本发明制备的细胞半固态悬液作为对照品，能够在减少一半的实验量的效果下，保证是实验的完全对照。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种细胞半固态悬液的制备方法，包括在获得的细胞中加入半固态缓冲液的步骤，所述半固态缓冲液包括保水剂；所述细胞是通过对蜡块包埋的细胞样本进行脱蜡处理得到。
优选的，所述蜡块包埋的细胞样本是通过离心、加入固定剂固定、乙醇脱水、浸蜡包埋以及薄层切片步骤获得。
优选的，所述半固态缓冲液的加入量为薄层切片体积的1-50倍。
优选的，所述保水剂为丙三醇、丁二醇、丙二醇、己二醇、聚丙二醇、山梨糖醇、聚乙二醇中的一种。
优选的，所述半固态缓冲液还包括防腐剂，所述防腐剂包括精氨酸、叠氮钠。
优选的，所述半固态缓冲液中，所述保水剂的体积分数为10％-50％，精氨酸的体积分数为1％-10％，叠氮钠的体积分数为0.01％-1％。
优选的，所述细胞为真核细胞或原核细胞。
本发明还公开了基于上述的细胞半固态悬液的制备方法得到的细胞半固态悬液。
本发明还公开了基于上述的细胞半固态悬液在制备适用于组织细胞原位检测或分析方法中的对照品中的应用。
优选的，所述组织细胞原位检测或分析方法选自包括免疫组化、原位杂交、原位细胞染色的组中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)不同来源的细胞做成的半固态对照品可以适用不同的对照目的。
(2)完全液态对照滴加到玻片上会迅速风干导致细胞上的表位被进一步破坏，需要后期较强的修复条件和修复时间才有可能将表位挽救回来；且液态对照滴加完成后必须马上进行实验，否则已经风干的对照区域效果会随着时间的过去，染色效果越来越差；半固态的对照由于缓冲液中加入了聚乙二醇等保水剂，在外界环境中可以保持10个小时以内的对照湿润，在湿盒中可以保持7天以内的对照湿润，即能更好地保存表位用于实验；缓冲液中还有精氨酸和除菌剂叠氮钠，可以防止细菌及其他因素对于对照蛋白的降解，提高了半固态对照的稳定性；含有保水剂的缓冲液在免疫组化和原位杂交中的烤片和清洗步骤中可以轻易去除。
(3)半固态阳性对照在使用时是涂抹到待测切片上的，和待测切片的实验流程和处理方式完全一致，在流程中完全共享一抗、二抗、显示剂等多种试剂，在能够减少一半的实验量的效果下且能保证是实验的完全对照。从通量和科学严谨性上大大强于目前每一张待测切片需要一张单独的组织切片作为对照的情况。
附图说明
图1为本发明靶点为ER的免疫组化抗体在MCF-7肿瘤细胞株来源的半固态免疫组化对照品上的染色情况(箭头指向染色位置)。
图2为靶点为Ki-67的免疫组化抗体在腹水来源的原代细胞半固态免疫组化对照品上的染色情况(箭头指向染色位置)。
图3为靶点为Her-2的免疫组化抗体在Her-2蛋白过表达的293细胞来源的半固态免疫组化对照品上的染色情况(箭头指向染色位置)。
图4为靶点为N蛋白的免疫组化抗体在大肠杆菌来源的半固态免疫组化对照品上的染色情况(箭头指向染色位置)。
图5为靶点为EBER的原位杂交探针在Raji半固态免疫组化对照品上的染色情况(箭头指向染色位置)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种细胞半固态悬液的制备方法，包括在获得的细胞中加入半固态缓冲液的步骤，所述半固态缓冲液包括保水剂以及防腐剂；所述细胞是通过对蜡块包埋的细胞样本进行脱蜡处理得到，所述细胞为真核细胞或原核细胞。具体如下：(1)对真核细胞或者原核细胞进行培养，培养完成后离心收集细胞；(2)运用细胞蜡块技术制作细胞样本的薄层切片；(3)对蜡块包埋的细胞样本的薄层切片进行脱蜡、水化处理，加入半固态缓冲液制作细胞半固态悬液。
所述保水剂为丙三醇、丁二醇、丙二醇、己二醇、聚丙二醇、山梨糖醇、聚乙二醇中的一种，在具体实施方式中，保水剂均采用聚乙二醇。
所述防腐剂包括精氨酸以及叠氮钠。
在所述半固态缓冲液中，所述保水剂的体积分数为10％-50％，精氨酸的体积分数为1％-10％，叠氮钠的体积分数为0.01％-1％；还包括0.1％-5％的伊红溶液。缓冲液中含有的伊红溶液有明亮的红色，可以为半固态对照在玻片上的明确位置，可以轻易观察到半固态对照所涂抹的位置，伊红可以在脱蜡、水化步骤中轻易去除，不会对实验产生任何负面影响。
本发明还公开了基于上述的细胞半固态悬液的制备方法制得的细胞半固态悬液。
实施例1
(1)对真核肿瘤细胞株进行培养，培养完成后离心收集细胞。具体如下：以MCF-7肿瘤细胞株为例，将细胞冷冻库中的肿瘤细胞株复苏至细胞培养瓶中；更换培养液，传代细胞株并将细胞状态调整至正常生长水平；弃细胞培养瓶中原培养液，加入胰酶将细胞消化，加入新鲜培养液终止消化，1500rpm离心5min后弃上清收集细胞并计数，将收集好的一瓶细胞按照1：4的比例传代(约1×106个/瓶)至多个空培养瓶中扩大；待细胞再次生长至细胞培养瓶底面融合度约70％时，再次收集细胞并重悬至PBS缓冲液后进行计数；将细胞悬液1500rpm离心5min弃上清液收集细胞并计数；再将细胞按照1：4的比例传代(约1×106个/瓶)至数个培养瓶中扩大；待细胞再次生长至细胞培养瓶底面融合度约70％时，再次收集细胞并重悬至PBS缓冲液后计数；收集细胞进行后续实验。
(2)运用细胞蜡块技术制作细胞样本的薄层切片，包括离心、加入固定剂固定、乙醇脱水、浸蜡包埋以及薄层切片步骤。具体如下：将步骤(1)中收集到的细胞转移到15mL离心管中，细胞沉淀总量为2mL，在2500rpm的条件下离心5min，倒去上清液后再用移液器去除培养基上清液；再往离心管中加入10mL的10％中性福尔马林溶液作为固定剂，吹散细胞混匀，固定时间为30min；将混合液在2500rpm的条件下离心5min，倒去上清液，加入10mL75％的乙醇，吹散混匀细胞，在3000rpm的条件下离心5min，去除上清液。往离心管中缓慢加入12mL体积分数为95％的乙醇，静止脱水4h；倒去上清液，留少量乙醇在管内，敲击离心管底部，将固定好的细胞团块敲松，再用吸头将细胞团块从离心管中脱出；将细胞团块放入包埋盒中，加至无水乙醇中，孵育1h后取出包埋盒控干后再放至无水乙醇中，孵育1h；将包埋盒从无水乙醇中取出，控干后再放入二甲苯中进行透明处理，孵育1h取出包埋盒控干后再放至二甲苯中孵育1h；将包埋盒从二甲苯中取出控干再放入包埋机的蜡池中进行浸蜡，浸蜡过夜后进行包埋；包埋完成后即为制备好的细胞蜡块，将制备完成的细胞蜡块进行切片，得到厚度3μm的薄层切片。
(3)对蜡块包埋的细胞样本的薄层切片进行脱蜡、水化处理，加入半固态缓冲液制作细胞半固态悬液，具体如下：将薄层切片放到离心管中；往离心管中倒入约25mL脱蜡液，震荡混匀以溶解切片中的石蜡；将混合液2500rpm离心5min，倒去脱蜡液，加入25mL的异丙醇后将细胞沉淀与乙醇进行震荡混匀；将混合液2500rpm离心5min，倒去异丙醇，再往离心管中加入约1mL的无水乙醇，用吸头吹打均匀；将混合液放入1.5mL的离心管中，2500rpm离心5min，用吸头吸去乙醇，加入半固态缓冲液，半固态缓冲液的加入体积为切片体积的30倍，震荡混匀后形成细胞半固体悬液。其中，半固态缓冲液中包括保水剂以及防腐剂，保水剂为体积分数为30％的聚乙二醇，防腐剂为体积分数为5％的精氨酸以及体积分数为0.1％的叠氮钠，还包括体积分数为2％的伊红溶液。
实施例2
(1)对真核原代细胞进行培养，培养完成后离心收集细胞。以腹水细胞为例，具体如下：将从病人体内获取的腹水进行低速离心，获得真核原代细胞；将细胞用PBS洗涤几次后，加入高糖DMEM+10％FBS的培养基中进行悬浮培养；18h后进行换液，并观察真核原代细胞的生长情况；之后每24h进行培养液的更换，并记录真核原代细胞生长情况；待细胞长到总量为1×107个以上后，且总细胞代数不超过10代，收集细胞进行后续实验。
(2)运用细胞蜡块技术制作细胞样本的薄层切片，包括离心、加入固定剂固定、乙醇脱水、浸蜡包埋以及薄层切片步骤。具体如下：将步骤(1)中收集到的细胞转移到15mL离心管中，细胞沉淀总量为2mL，在2500rpm的条件下离心5min，倒去上清液后再用移液器去除培养基上清液；再往离心管中加入10mL10％中性福尔马林溶液作为固定剂，吹散细胞混匀，固定时间为30min；将混合液在2500rpm的条件下离心5min，倒去上清液，加入10mL 75％的乙醇，吹散混匀细胞，在3000rpm的条件下离心5min，去除上清液。往离心管中缓慢加入12mL体积分数为95％的乙醇，静止脱水4h；倒去上清液，留少量乙醇在管内，敲击离心管底部，将固定好的细胞团块敲松，再用吸头将细胞团块从离心管中脱出；将细胞团块放入包埋盒中，加至无水乙醇中，孵育1h后取出包埋盒控干后再放至无水乙醇中，孵育1h；将包埋盒从无水乙醇中取出，控干后再放入二甲苯中进行透明处理，孵育1h取出包埋盒控干后再放至二甲苯中孵育1h；将包埋盒从二甲苯中取出控干再放入包埋机的蜡池中进行浸蜡，浸蜡过夜后进行包埋；包埋完成后即为制备好的细胞蜡块，将制备完成的细胞蜡块进行切片，得到厚度3μm的薄层切片。
(3)对蜡块包埋的细胞样本的薄层切片进行脱蜡、水化处理，加入半固态缓冲液制作细胞半固态悬液，具体如下：将薄层切片放到离心管中；往离心管中倒入约25mL脱蜡液，震荡混匀以溶解切片中的石蜡；将混合液2500rpm离心5min，倒去脱蜡液，加入25mL的异丙醇后将细胞沉淀与乙醇进行震荡混匀；将混合液2500rpm离心5min，倒去异丙醇，再往离心管中加入约1mL的无水乙醇，用吸头吹打均匀；将混合液放入1.5mL的离心管中，2500rpm离心5min，用吸头吸去乙醇，加入半固态缓冲液，半固态缓冲液的加入体积为切片体积的1倍，震荡混匀后形成细胞半固体悬液。其中，半固态缓冲液中包括保水剂以及防腐剂，保水剂为体积分数为10％的聚乙二醇，防腐剂为体积分数为1％的精氨酸以及体积分数为0.01％的叠氮钠，还包括体积分数为0.1％的伊红溶液。
实施例3
(1)对真核过表达细胞株进行培养，培养完成后离心收集细胞。以293细胞为例，具体如下：将真核表达细胞按5×105个/mL的密度接种至对应培养基中，震荡培养过夜；往细胞中加入转染试剂及蛋白相对应的真核表达质粒；在蛋白表达完成后，离心收集细胞进行后续实验。
(2)运用细胞蜡块技术制作细胞样本的薄层切片，包括离心、加入固定剂固定、乙醇脱水、浸蜡包埋以及薄层切片步骤。具体如下：将步骤(1)中收集到的细胞转移到15mL离心管中，细胞沉淀总量为2mL，在2500rpm的条件下离心5min，倒去上清液后再用移液器去除培养基上清液；再往离心管中加入10mL10％中性福尔马林溶液作为固定剂，吹散细胞混匀，固定时间为30min；将混合液在2500rpm的条件下离心5min，倒去上清液，加入10mL 75％的乙醇，吹散混匀细胞，在3000rpm的条件下离心5min，去除上清液。往离心管中缓慢加入12mL体积分数为95％的乙醇，静止脱水4h；倒去上清液，留2mL乙醇在管内，敲击离心管底部，将固定好的细胞团块敲松，再用吸头将细胞团块从离心管中脱出；将细胞团块放入包埋盒中，加至无水乙醇中，孵育1h后取出包埋盒控干后再放至无水乙醇中，孵育1h；将包埋盒从无水乙醇中取出，控干后再放入二甲苯中进行透明处理，孵育1h取出包埋盒控干后再放至二甲苯中孵育1h；将包埋盒从二甲苯中取出控干再放入包埋机的蜡池中进行浸蜡，浸蜡过夜后进行包埋；包埋完成后即为制备好的细胞蜡块，将制备完成的细胞蜡块进行切片，得到厚度3μm的薄层切片。
(3)对蜡块包埋的细胞样本的薄层切片进行脱蜡、水化处理，加入半固态缓冲液制作细胞半固态悬液。具体如下：将薄层切片放到离心管中；往离心管中倒入约25mL脱蜡液，震荡混匀以溶解切片中的石蜡；将混合液2500rpm离心5min，倒去脱蜡液，加入25mL的异丙醇后将细胞沉淀与乙醇进行震荡混匀；将混合液2500rpm离心5min，倒去异丙醇，再往离心管中加入约1mL的无水乙醇，用吸头吹打均匀；将混合液放入1.5mL的离心管中，2500rpm离心5min，用吸头吸去乙醇，加入半固态缓冲液，半固态缓冲液的加入体积为切片体积的30倍，震荡混匀后形成细胞半固体悬液。其中，半固态缓冲液中包括保水剂以及防腐剂，保水剂为体积分数为50％的聚乙二醇，防腐剂为体积分数为10％的精氨酸以及体积分数为1％的叠氮钠，还包括体积分数为5％的伊红溶液。
实施例4
(1)对原核微生物细胞进行培养，培养完成后离心收集细胞。具体如下：将感受态大肠杆菌中加入对应蛋白的原核表达质粒，将质粒转化后进入大肠杆菌内部，并涂至对应抗性的固体培养基平板上，过夜培养；第二天挑取在平板上长出的菌落接种于液体细菌培养基中扩大培养24h；培养完成后离心收获菌体进行后续实验。
(2)运用细胞蜡块技术制作细胞样本的薄层切片，包括离心、加入固定剂固定、乙醇脱水、浸蜡包埋以及薄层切片步骤。具体如下：将步骤(1)中收集到的细胞转移到15mL离心管中，细胞沉淀总量为2mL，在2500rpm的条件下离心5min，倒去上清液后再用移液器去除培养基上清液；再往离心管中加入10mL10％中性福尔马林溶液作为固定剂，吹散细胞混匀，固定时间为30min；将混合液在2500rpm的条件下离心5min，倒去上清液，加入10mL 75％的乙醇，吹散混匀细胞，在3000rpm的条件下离心5min，去除上清液。往离心管中缓慢加入12mL体积分数为95％的乙醇，静止脱水4h；倒去上清液，留少量乙醇在管内，敲击离心管底部，将固定好的细胞团块敲松，再用吸头将细胞团块从离心管中脱出；将细胞团块放入包埋盒中，加至无水乙醇中，孵育1h后取出包埋盒控干后再放至无水乙醇中，孵育1h；将包埋盒从无水乙醇中取出，控干后再放入二甲苯中进行透明处理，孵育1h取出包埋盒控干后再放至二甲苯中孵育1h；将包埋盒从二甲苯中取出控干再放入包埋机的蜡池中进行浸蜡，浸蜡过夜后进行包埋；包埋完成后即为制备好的细胞蜡块，将制备完成的细胞蜡块进行切片，得到厚度3μm的薄层切片。
(3)对蜡块包埋的细胞样本的薄层切片进行脱蜡、水化处理，加入半固态缓冲液制作细胞半固态悬液。具体如下：将薄层切片放到离心管中；往离心管中倒入约25mL脱蜡液，震荡混匀以溶解切片中的石蜡；将混合液2500rpm离心5min，倒去脱蜡液，加入25mL的异丙醇后将细胞沉淀与乙醇进行震荡混匀；将混合液2500rpm离心5min，倒去异丙醇，再往离心管中加入约1mL的无水乙醇，用吸头吹打均匀；将混合液放入1.5mL的离心管中，2500rpm离心5min，用吸头吸去乙醇，加入半固态缓冲液，半固态缓冲液的加入体积为切片体积的50倍，震荡混匀后形成细胞半固体悬液。其中，半固态缓冲液中包括保水剂以及防腐剂，保水剂为体积分数为30％的聚乙二醇，防腐剂为体积分数为5％的精氨酸以及体积分数为0.1％的叠氮钠，还包括体积分数为2％的伊红溶液。
本发明还公开了基于上述的细胞半固态悬液在制备适用于组织细胞原位检测或分析方法中的对照品中的应用。所述组织细胞原位检测或分析方法选自包括免疫组化、原位杂交、原位细胞染色的组中的至少一种。
具体方法如下：采用滴加或涂抹的方式进行阳性或者阴性对照设置，即将半固体对照涂至待测切片周围后进行相关实验即可获得实验条件完全一致的阳性/阴性对照组。
将实施例1制备的细胞半固态悬液按照上述方法制成半固态对照品，进行靶点为雌激素受体(estrogen receptor，ER)的常规免疫组化实验，封片。染色结果如图1所示(箭头指向染色位置)，切片中的细胞呈现强度适中的ER细胞核阳性染色结果。
以Raji肿瘤细胞株为例，按照实施例1的方法制备细胞半固态悬液，并按照上述方法制成半固态对照品，进行靶点为EBER的原位杂交实验，封片。染色结果如图5所示(箭头指向染色位置)，切片中的细胞呈现强度适中的EBER细胞核阳性染色结果。
将实施例2制备的细胞半固态悬液按照上述方法制成半固态对照品，进行靶点为Ki-67的常规免疫组化实验，封片。染色结果如图2所示(箭头指向染色位置)，切片中的细胞呈现强度适中的Ki-67细胞核阳性染色结果。
将实施例3制备的细胞半固态悬液按照上述方法制成半固态对照品，进行靶点为Her-2的常规免疫组化实验，封片。染色结果如图3所示(箭头指向染色位置)，切片中的细胞呈现强度适中的细胞膜阳性染色结果。
将实施例4制备的细胞半固态悬液按照上述方法制成半固态对照品，进行靶点为新冠病毒N蛋白的免疫组化实验，封片。染色结果如图4所示，切片中的细胞呈现强度适中的细胞胞浆阳性染色结果。
半固态的对照由于缓冲液中加入了聚乙二醇等保水剂，在外界环境中可以保持10个小时以内的对照湿润，在湿盒中可以保持7天以内的对照湿润，即能更好地保存表位用于实验；缓冲液中还有精氨酸和叠氮钠，可以防止细菌及其他因素对于对照蛋白的降解，提高了半固态对照的稳定性。缓冲液中含有的伊红溶液有明亮的红色，可以为半固态对照在玻片上的明确位置，可以轻易观察到半固态对照所涂抹的位置。含有聚乙二醇的缓冲液在免疫组化和原位杂交中的烤片和清洗步骤中可以轻易去除，伊红可以在脱蜡、水化步骤中轻易去除，不会对实验产生任何负面影响。
应用例1
将根据本发明的制备方法制备获得的半固态对照品用于免疫组化实验，即：将切好的需要进行免疫组化检测的组织切片的上下左右边缘位置涂抹1-2μL半固态对照品作为实验阳性对照。涂抹过对照品的切片可以在自动免疫组化仪上进行自动化上机免疫组化实验(根据不同自动免疫组化平台设置程序执行)或使用手工滴加试剂的方式进行手工免疫组化实验。具体步骤如下：
(1)将涂抹过对照品的切片插入染色架中，然后置于62℃烤箱中烤片1h，将烤片完成的切片分别置于二甲苯、无水乙醇、95％乙醇、75％乙醇中浸泡2次，每次浸泡时间分别为15min、5min、5min、5min。
(2)根据不同的一抗要求，对切片进行抗原修复，选用Tris-EDTA修复液或柠檬酸修复液进行高压或常压修复。
(3)将修复完成的切片置于3％的过氧化氢溶液中10min进行封闭；再用水震荡冲洗3次。
(4)根据不同靶点的检测要求加入100μL一抗工作液，室温湿盒中孵育30min后，利用PBST缓冲液震荡清洗3次。
(5)在切片上加入100μL羊抗鼠/兔IgG聚合物二抗，室温湿盒中孵育30min后，利用PBST缓冲液震荡清洗3次。
(6)在切片上加入100μL的DAB显色剂，切片着色后迅速用水冲去DAB显色剂，再用水震荡冲洗3次。
(7)甩去切片上多余水分后，将切片浸入苏木素染色液中7min用于复染细胞核，染色完成后用水震荡冲洗，并放入PBST中反蓝60s。
(8)将切片分别放入75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇中处理30s，共处理2次；再将切片放入二甲苯中浸泡透明5min。
(9)取出切片沥干后用吹风机吹干切片，滴加1-2滴中性树胶后盖上盖玻片放入通风橱中晾干。
(10)将切片上下左右边缘的液态对照染色进行比较，液态对照的阳性染色模式正确则该免疫组化实验成功，如果染色为阴性或者染色模式错误，则该免疫组化实验失败。
应用例2
将根据本发明的制备方法制备获得的半固态对照品用于原位杂交实验，其具体步骤如下：
(1)将制备好的需要进行原位杂交的切片上下左右边缘位置涂抹1-2μL半固态对照品作为实验阳性对照。
(2)再将切片放置于50℃烤箱中烤片2-3h。
(3)将切片浸在70～75℃的70％甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2-3min。
(4)将变性完成的切片分别放入70％乙醇、90％乙醇和无水乙醇中浸泡，每次5min，然后于空气中干燥。
(5)将探针在75℃恒温水浴中温育5min，立即置0℃条件下5-10min，使双链DNA探针变性。然后将10μL已变性或预退火的DNA探针滴于切片上，盖上盖玻片，置于湿盒中37℃杂交过夜。
(7)将切片从37℃温箱中取出，放置于已预热45℃的50％甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
(8)再将切片放置到已预热45℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。再将切片于2×SSC中轻洗一下后自然干燥。
(9)再滴加200μL DAPI/antifade染液至切片中进行复染，盖上盖玻片。
封片完成后可先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，进行阅片；将切片上下左右边缘的液态对照染色进行比较，液态对照的荧光信号正确则该原位杂交实验成功，如果信号为阴性或者信号模式错误，则该原位杂交实验失败。
应用例3
将根据本发明的制备方法制备获得的半固态对照品用于细胞染色实验，其具体步骤如下：
(1)将切好的需要进行细胞染色实验的组织切片的上下左右边缘位置涂抹上1-2μL半固态对照品作为实验阳性对照。
(2)将切片插入染色架中放入62℃烤箱烤片1h。
(3)将烤片完成的切片分别置于二甲苯、无水乙醇、95％乙醇、75％乙醇中浸泡2次，每次分别的浸泡时间为15min、5min、5min、5min。
(4)将切片浸入苏木素染色液中8min用于染细胞核，染色完成后用水震荡冲洗3次。
(5)将切片放入0.5％盐酸的乙醇溶液中分化2s；然后依次将切片放入水中反蓝15min，放入伊红溶液中染色2s。
(6)将切片分别放入75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇中处理30s，共处理2次；再将切片放入二甲苯中浸泡透明5min。
(7)取出切片沥干后用吹风机吹干切片，滴加1-2滴中性树胶后盖上盖玻片放入通风橱中晾干。
(8)将切片上下左右边缘的液态对照染色进行比较，液态对照的阳性染色模式正确则该细胞染色实验成功，如果染色为阴性或者染色模式错误，则该细胞染色实验失败。
在本发明中，半固态阳性对照在使用时是涂抹到待测切片上的，和待测切片的实验流程和处理方式完全一致，在流程中完全共享一抗、二抗、显示剂等多种试剂，在能够减少一半的实验量的效果下且能保证是实验的完全对照。从通量和科学严谨性上大大强于目前每一张待测切片需要一张单独的组织切片作为对照的情况。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (10)
1.一种细胞半固态悬液的制备方法，其特征在于：包括在获得的细胞中加入半固态缓冲液的步骤，所述半固态缓冲液包括保水剂；所述细胞是通过对蜡块包埋的细胞样本进行脱蜡处理得到。
2.根据权利要求1所述的一种细胞半固态悬液的制备方法，其特征在于：所述蜡块包埋的细胞样本是通过离心、加入固定剂固定、乙醇脱水、浸蜡包埋以及薄层切片步骤获得。
3.根据权利要求2所述的一种细胞半固态悬液的制备方法，其特征在于：所述半固态缓冲液的加入量为薄层切片体积的1-50倍。
4.根据权利要求1所述的一种细胞半固态悬液的制备方法，其特征在于：所述保水剂为丙三醇、丁二醇、丙二醇、己二醇、聚丙二醇、山梨糖醇、聚乙二醇中的一种。
5.根据权利要求4所述的一种细胞半固态悬液的制备方法，其特征在于：所述半固态缓冲液还包括防腐剂，所述防腐剂包括精氨酸、叠氮钠。
6.根据权利要求5所述的一种细胞半固态悬液的制备方法，其特征在于：所述半固态缓冲液中，所述保水剂的体积分数为10％-50％，精氨酸的体积分数为1％-10％，叠氮钠的体积分数为0.01％-1％。
7.根据权利要求1-6任一所述的一种细胞半固态悬液的制备方法，其特征在于：所述细胞为真核细胞或原核细胞。
8.根据权利要求1所述的制备方法得到的细胞半固态悬液。
9.根据权利要求1所述的细胞半固态悬液在制备适用于组织细胞原位检测或分析方法中的对照品中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述组织细胞原位检测或分析方法选自包括免疫组化、原位杂交、原位细胞染色的组中的至少一种。
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2020
- 2020-11-26 CN CN202011356471.8A patent/CN112611614B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112611614B (zh) | 2022-09-13 |
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