CN112578034B - 一种手性胺小分子及其盐的质量控制方法 - Google Patents

一种手性胺小分子及其盐的质量控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种手性胺及其盐的质量控制方法，该方法采用高效液相法色谱法分析，使用手性硅胶色谱柱及正己烷‑异丙醇流动相体系，该方法不经预处理即可以实现对手性胺与其异构体杂质的拆分，进而达到质量控制的目的。

Description

一种手性胺小分子及其盐的质量控制方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种简便、高效的手性胺小分子(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法。
背景技术
(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯(CAS：1626482-01-6，分子式：C11H19NO2)是一种手性胺类小分子；其结构式如下：
Figure BDA0002759716730000011
该手性片段被广泛作为一类流感病毒RNA聚合酶抑制剂的起始原料，其具有代表性的是美国Vertex公司研发的匹莫地韦，已进入临床三期阶段；该类药物通过抑制PB2亚基，显著降低病毒数量以及流感样症状的严重程度和持续时间，在解决流感病毒耐药性有着重大意义。因此，对其制备中的起始原料(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制也至关重要。
Figure BDA0002759716730000012
另外，还有众多现有技术也公开了使用该中间体的系列化合物；如WO2018041263A1和WO2018157830A1专利也公开了一系列具有抗流感病毒的化合物，其通式如下，该系列化合物也用到该(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯作为起始原料。
Figure BDA0002759716730000021
目前关于(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法报道较少，而且现有技术中的关注点主要在于(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯的制备工艺或者经预处理后再通过HPLC测量ee值，诸如：
公开号为CN105848683A的发明专利，公开了一种制备(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯的方法，后处理采用升高温度增加真空蒸馏的方法，但是未公开其异构体等杂质的分析方法。
公开号为CN105849105A的发明专利，公开了一种(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯经C1-6醇盐处理后经差向异构化的制备方法，而未公开其异构体等杂质的分析方法。
文献“Syntheses of Four Enantiomers of 2,3-Diendo-and 3-Endo-aminobicyclo[2.2.2]oct-5-ene-2-exo-carboxylic Acid and Their SaturatedAnalogues”,Molecules,2013,18,P15080-15093，公开了(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯的制备方法，并公开了一种HPLC测量(±)-2和(±)-3ee值的方法，采用Deicel Chirelcel OD-H色谱柱，正己烷-异丙醇(80:20/95:5)流动相，流速0.25mL/min，检测波长为233nm的色谱条件分离，该方法通过HPLC测其化合物的ee值，但该方法需经NaOH/甲苯、苯甲酰氯预处理样品后，再用甲苯溶剂分离，过滤，才可测量，其过程繁琐，耗时，仅是通过HPLC测量其化合物的纯度，并没有实现通过HPLC色谱条件来对(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯的异构体杂质有效的分离。
众所周知，药物手性杂质对药物安全的影响非常大，其诸多副作用的出现很大比例是由于杂质的缘故。药物杂质的来源一般包括药物制备工艺中的中间体、副产物以及降解产物。(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯是以匹莫地韦为代表的这一类流感病毒RNA聚合酶抑制剂的合成起始原料，现有技术公开的大多是以(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯作为合成起始原料的制备工艺，而对(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法均未涉及，也没有相关杂质质量控制方法可以同时适用于以匹莫地韦为代表的这类流感病毒RNA聚合酶抑制剂的合成所涉及到的起始物料杂质检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种手性胺小分子(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法。该方法采用正相涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶色谱柱分离(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的异构体杂质，该方法不经预处理即可实现对起始物料杂质定性及定量分析。
本发明的上述目的通过下述技术方案实现：
一种手性胺小分子及其盐的质量控制方法，所述手性胺小分子为(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯，所述质量控制方法使用高效液相色谱分析，选用表面正相涂敷直链淀粉-三(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶色谱柱，色谱分析主要参数为：
流动相：
流动相的组成为正己烷(V正己烷)、质量百分比0.05％-0.15％的二乙胺-异丙醇溶液(V二乙胺-异丙醇)，其中V正己烷：V二乙胺-异丙醇＝88:12-95:5
检测波长：205nm-215nm
柱温：25℃-38℃
进样量：8μL-12μL
进样浓度：4mg/mL-6mg/mL
流速：0.3mL/min-1.5mL/min
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法，其步骤包括：
1)溶液配制；
2)进样；
3)等度洗脱。
具体的，所述溶液配制包括流动相配制、待测样品溶液配制(系统适用性溶液配制)等；所述待测样品溶液所需稀释剂的配制方法为：量取正己烷与无水乙醇各100mL，混合，摇匀；所述二乙胺-异丙醇溶液的配制方法为：精确量取二乙胺至1000mL异丙醇中，摇匀，超声处理10min，冷却至室温；所述待测样品溶液配制方法为：取对照品约500mg与异构体杂质约5mg，称定，置100mL量瓶中，加适量稀释剂，超声溶解，放冷至室温，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；所述流动相配制方法为：量取正己烷900mL和二乙胺-异丙醇溶液100mL，混合，摇匀，超声10min，冷却至室温。
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法的色谱柱是实现检测效果的重要方面。本领域研究人员可以理解，手性异构体其理化性质相似度较高且分离效果不可预知，因此不同填料的色谱柱其对手性胺对照品和异构体杂质分离度不同，对于本发明而言，可选用的手性拆分填料有：正相涂敷直链淀粉-三-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-三-(S)-α-甲基苯基氨基甲酸酯、直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；共价键合直链淀粉-三(3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)；正相涂敷纤维素-三-(4-甲基苯甲酸酯)、多糖衍生物-纤维素/直链淀粉等，其对应的品牌手性分析色谱柱有Daicel chiralpak AD-H(硅胶表面正相涂敷直链淀粉-三-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、Daicel chiralpak IG(共价键合直链淀粉-三(3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯))、Daicel chiralpak IB(共价键合纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))、Daicel chiralpak IA(共价键合直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))、Daicel chiralpak AS 5um(正相涂敷直链淀粉-三-(S)-α-甲基苯基氨基甲酸酯)、Daicel chiralpak AY-H色谱柱(正相涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯))、菲罗门chiral MJ(2)(正相涂敷纤维素-三-(4-甲基苯甲酸酯)、NanoChrom Unichiral AS(大孔硅胶表面修饰多糖衍生物-纤维素/直链淀粉)等。
具体地，本发明根据上述提及色谱柱进行具体分析，发现Daicel chiralpak AD-H(涂敷直链淀粉-三-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)色谱柱使对照品和异构体杂质峰形重叠，分离效果差；Daicel chiralpak IG(键合直链淀粉-三(3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯))使对照品和异构体杂质依次出峰，而分离度小于2.0；Daicel chiralpak IB(纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))使对照品和异构体杂质其保留时间为12min至15min，未达到基线分离且未倒峰；Daicel chiralpak IA(键合直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))色谱柱不能使对照品和异构体杂质达到基线分离且峰形为倒峰；NanoChrom Unichiral AS(大孔硅胶表面修饰多糖衍生物-纤维素/直链淀粉)色谱柱不能使对照品和异构体杂质达到基线分离且峰形重叠；菲罗门chiral MJ(2)(纤维素-三-(4-甲基苯甲酸酯)色谱柱不能使对照品和异构体杂质有效分离，并且菲罗门chiral MJ(2)色谱柱与溶剂峰未分离，不利于其异构体杂质的定量和定性检测；当使用Daicel chiralpak AY-H色谱柱(正相涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯))时，相同色谱条件下，对照品和异构体杂质依次出峰，达到基线分离且分离度大于2.0。综合评价认为，选用表面正相涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶色谱柱较其他填料色谱柱更有利于实现对照品和异构体杂质的分离，进一步的，本发明采用的手性分析色谱柱为Daicel chiralpak AY-H。
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法的流动相是实现检测效果的重要技术关键。本领域研究人员可以理解，对于特定的手性色谱柱，不同的流动相溶剂及其组合对于特定手性异构体的分离效果差别巨大。对于本发明所述异构体杂质质量控制方法而言，不同醇类有不同的选择性，改变醇类的种类可改变其选择性。因此，本发明分别采用正己烷-异丙醇以及正己烷-乙醇为流动相；结果显示，正己烷-乙醇为流动相时，其对照品和异构体杂质依次出峰，虽分离度效果很好，但是对照品峰形异常，呈前肩峰，影响其定性及定量检测；反之，流动相为正己烷-异丙醇时，不仅可以使对照品和异构体杂质达到基线分离，且分离度大于2.0，峰形和峰面积正常；因此，流动相考虑选用正己烷-异丙醇。本研究人员还发现流动相为正己烷-异丙醇时，流动相的洗脱比例不同，分离效果不同；具体地，其V正己烷与V异丙醇的比例为88:12-95：5，可以实现对照品和异构体杂质的有效分离且峰形峰高等参数最佳，利于其定性定量检测，当异丙醇的体积占比高于12％时，其分离度显著下降，造成对照品和异构体杂质分离效果不佳；当异丙醇的体积占比低于5％时，其色谱重现性较差以及分析的灵敏性较低；优选的，当异丙醇体积比为10％，即V正己烷与V异丙醇的比例为90:10时，其分离度为大于2.0，不仅使对照品和异构体杂质依次出峰，分离效果最佳，而且对色谱重现性和分析的灵敏度均没有影响，利于对照品及异构体杂质的定量及定性检测。
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法的添加剂是实现检测效果的技术关键之一。本领域研究人员可以理解，流动相中根据样品特性需添加酸或碱来调节峰形；但其添加剂的浓度需要控制，本发明，根据手性胺的特性，选择碱性的添加剂来调整峰形并优化分离效果；具体地，当选用添加剂质量百分比浓度为0.05％-0.15％，可以实现异构体杂质和对照品完全分离且其他因素正常，利于异构体杂质的定性及定量分析；当质量百分比浓度大于0.15％时，虽可提高分离效果，但是会引起峰高和峰面积等参数显著下降，影响其定量检测；当质量百分比浓度低于0.05％时，其分离效果基本不变，但是调整峰形的效果并不显著且对其分离的峰高及峰面积等参数有一定的影响，亦不利于其定量检测；本发明采用的添加剂-二乙胺质量百分比为0.1％，不仅使分离度大于2.0且分离效果最佳，而且峰高和峰面积均不受影响，利于对照品及异构体杂质的定量检测。
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法的流速是影响分离效果的因素之一，本领域研究人员可以理解，流动相流速过高影响洗脱速度，缩短出峰时间，其分离效果受其影响；流动相流速过慢降低洗脱速度，增加出峰时间且拉宽各组分峰宽，同样不利于实现分离。具体地，本发明所采用的流动相流速为0.3mL/min-1.5mL/min，可以实现异构体杂质的有效分离，其柱效、峰形、峰面积和保留时间等因素均为正常；当流速高于1.5mL/min，洗脱速度会增加，其柱效会受其影响；当流速低于为0.3mL/min，影响样品峰形、峰面积和保留时间，洗脱速度降低；本发明研究人员选择流速为0.5mL/min、1.0mL/min，发现其分离度均大于2.0；但流速为0.5mL/min时，其峰面积、峰高及理论塔板数显著提高；由于峰面积、峰高及理论塔板数显著提高对于低响应地主峰更为重要，故优选流速为0.5mL/min。
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法的柱温是影响分离效果的因素之一，本领域研究人员可以理解，其提高柱温能够使峰形变窄变细；具体地，本发明采用柱温25℃-38℃，可以实现异构体杂质的有效分离，且分离度大于2.0；当柱温高于38℃时，虽分离度提高，但峰形变窄变细，影响分离样品的定量检测，并且温度升高对色谱柱损耗增大，且会影响分离效果；当柱温低于25℃时，其峰形受到影响，拖尾因子显著增加，不利于对分离样品的定量检测；本发明研究人员选择柱温为30℃和35℃，结果显示，分离度均大于2.0，且均可以分离对照品和异构体杂质；但柱温30℃时，其分离度大于柱温为35℃，并且分离效果增加，虽其拖尾因子略有增加，但其他参数无明显变化，再者分离度是我们考虑的因素，因此分离度的提高相比拖尾因子的略有增加更为重要，故优选30℃。
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法的波长选择，具体地，对照品和异构体杂质在205nm-220nm处均有特征吸收且出现响应信号，本发明研究人员发现，其对照品和异构体杂质在207nm、210nm波长处，不仅均有特征吸收且出现响应信号，但在207nm处，对照品和异构体杂质不仅呈现最大响应，而且其分离效果最佳，误差最小，故波长优选207nm。
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法的样品浓度和进样体积确定，具体地，本发明中研究人员分别采用空白溶液和系统适用性溶液做参考，结果显示空白溶液对结果无干扰；系统适用性溶液的分离度大于2.0；本发明的进样浓度选择4.0mg/mL-6.0mg/mL和进样量为8μL-12μL；当供试品溶液进样浓度高于6.0mg/mL和进样量高于12μL，由于进样浓度过载，导致拖尾因子显著增加，且峰形和峰高等参数受到影响；当进样浓度低于4.0mg/mL和进样量低于8μL，进样浓度降低，其峰高、峰形等参数均受到影响，且当以1％的自身对照溶液测定检测灵敏度；进样浓度过载或过低，均会影响其样品溶液中杂质的定性和定量检测；更具体地，本发明优选最佳进样浓度为5.0mg/mL，最佳进样量为10μL，既可以获得较好的分离效果，又保证了分析效率。
本发明所述的手性胺(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯的质量控制方法亦可以进一步用于对该手性胺盐的质量控制中，所述手性胺盐可为该手性胺的有机盐和/或无机盐，所述有机盐为手性胺与本领域常见的有机酸形成的盐，如甲酸盐、乙酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐等，所述无机盐为手性胺与本领域常见的无机酸形成的盐，如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等。如无特别说明，当本发明所述质量控制方法的分析对象为手性胺盐时，手性胺盐的质量均指代以游离手性胺计的质量。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法，具有较好的简便、快速特性，可以适用于以(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐为起始原料或共用中间体及其对应制剂的质量控制中；该方法不仅能控制起始原料中的杂质含量，实现对照品和异构体杂质完全达到基线分离，并且与杂质的分离度均大于2.0；同时，该方法省略现有技术预处理的过程，简化分离分析的步骤，达到更好的分离效果；采用区别于现有技术的手性色谱柱，不仅实现检测效率和检测准确度高于现有技术的目的，而且提高现有技术中对异构体杂质分离分析的速率；另外对于以VX-787为代表的这一类流感病毒RNA聚合酶抑制剂合成中起始原料中异构体杂质的分离分析方法实现首创。
附图说明
图1是实施例1所得HPLC谱图。
图2是实施例2所得HPLC谱图。
图3是实施例3所得HPLC谱图。
图4是实施例4所得HPLC谱图
图5是对比例1所得HPLC谱图。
图6是对比例2所得HPLC谱图。
图7是对比例3所得HPLC谱图
图8是对比例4所得HPLC谱图。
图9是对比例5所得HPLC谱图。
图10是对比例6所得HPLC谱图。
图11是对比例7所得HPLC谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1
仪器：岛津-LC-2030C 3D；
色谱柱：Daicel chiralpak AY-H 5um 4.6×250mm[涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)]
流动相：正己烷：0.1％二乙胺-异丙醇溶液(V正己烷：V0.1％二乙胺-异丙醇＝90:10)
进样量：10μL；
流速：0.5mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：207nm(DAD)
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法包含以下步骤：
1.溶液的配制：
具体地，所述溶液配制包括流动相配制、待测样品溶液配制(系统适用性溶液配制)等。其中，待测样品溶液所需稀释剂的配制方法为：量取正己烷与无水乙醇各100mL，混合，摇匀；二乙胺-异丙醇溶液的配制方法为：移取二乙胺1mL至1000mL异丙醇中，摇匀，超声处理10min，冷却至室温；系统适用性溶液的配制方法为：取对照品约500mg与异构体杂质约5mg，称定，置100mL量瓶中，加适量稀释剂，超声溶解，放冷至室温，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；流动相配制方法：量取正己烷900mL和二乙胺-异丙醇溶液100mL，混合，摇匀，超声10min，冷却至室温。
2.进样
3.等度洗脱
所得HPLC色谱图如图1所示，可以看出异构体杂质的保留时间为15.069min，对照品的保留时间为16.754min，该实施例方法可以有效区分异构体杂质和对照品，使异构体杂质和对照品达到基线分离，具有专属性强，灵敏度高的特点；因此，采用该方法可以实现对异构体杂质的定性和定量检测；并且采用本实施例的色谱条件，不仅可以有效分离异构体杂质和对照品，而且基线平稳，不存在峰裂的情况，相邻色谱峰分离度大于2.0，更有利于辨识与定位。
实施例2
仪器：岛津-LC-2030C 3D；
色谱柱：Daicel chiralpak AY-H 5um 4.6×250mm[涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)]
流动相：正己烷：0.1％二乙胺-异丙醇溶液(V正己烷：V0.1％二乙胺-异丙醇＝90:10)
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
检测波长：207nm(DAD)
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法包含以下步骤：
1.溶液的配制：
溶液配制方法照实施例1进行
2.进样
3.等度洗脱
所得HPLC色谱图如图2所示，可以看出异构体杂质的保留时间为7.021min，对照品的保留时间为7.857min，该实施例方法可以有效区分异构体杂质和对照品，采用本实施例的色谱条件，不仅可以有效分离异构体杂质和对照品，而且对照品和异构体杂质达到基线分离，具有专属性强，灵敏度高等特点且基线平稳，不存在峰裂的情况，基本可以实现异构体杂质和对照品的有效分离。因此，采用该方法可以实现对异构体杂质的定性及定量检测。
实施例3
仪器：岛津-LC-2030C 3D；
色谱柱：Daicel chiralpak AY-H 5um 4.6×250mm[(硅胶涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯))]
流动相：正己烷：0.1％二乙胺-异丙醇溶液(V正己烷：V0.1％二乙胺-异丙醇＝90:10)
进样量：10μL；
流速：0.5mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：207nm(DAD)
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法包含以下步骤：
1.溶液的配制：
溶液配制方法照实施例1进行
2.进样
3.等度洗脱
所得HPLC色谱图如图3所示，可以看出异构体杂质的保留时间为15.000min，对照品的保留时间为16.884min，该实施例的方法可以有效分离对照品和异构体杂质，使两者达到基线分离，具有专属性强，灵敏度高等特点；实验中发现，柱温为30℃时，分离度显著增加，虽拖尾因子略有增加，但其他参数物明显变化且分离度的提高相比拖尾因子的略有增加更为重要。因此，采用该方法可以实现对异构体杂质的定性检测和定量检测。
实施例4
仪器：岛津-LC-2030C 3D；
色谱柱：Daicel chiralpak AY-H 5um 4.6×250mm[(硅胶涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯))]
流动相：正己烷：0.1％二乙胺-异丙醇溶液(V正己烷：V0.1％二乙胺-异丙醇＝90:10)
进样量：10μL；
流速：0.5mL/min；
柱温：35℃；
检测波长：207nm(DAD)
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法包含以下步骤：
1.溶液的配制：
溶液配制方法照实施例1进行
2.进样
3.等度洗脱
所得HPLC色谱图如图4所示，可以看出异构体杂质的保留时间为14.058min，对照品的保留时间为15.273min。该实施例的方法可以有效分离异构体杂质和对照品，使异构体杂质和对照品达到基线分离，具有专属性强，灵敏度高等特点；实验中发现，柱温为35℃时，其分离度大于2.0且依次出峰。因此，采用该方法可以实现对异构体杂质的定性检测和定量检测。
对比实施例1
仪器：岛津-LC-2030C 3D；
色谱柱：Daicel chiralpak IC 5um 4.6×250mm[(硅胶键合纤维素-三-(3,5)二氯苯基氨基甲酸酯)]
流动相：正己烷：0.1％二乙胺-异丙醇溶液(V正己烷：V0.1％二乙胺-异丙醇＝90:10)
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：207nm(DAD)
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法包含以下步骤：
1.溶液的配制：
溶液配制方法照实施例1进行
2.进样
3.等度洗脱
所得HPLC的色谱图如图5所示，结果显示，对照品和异构体杂质在保留时间13.748min和12.849min处，其峰未分离且峰形差。该对比例的色谱柱不能有效区分对照品和异构体杂质，而且对照品和异构体杂质峰型部分重叠，不能分离。经分析，可能与色谱柱中填充材料等有关，当选用表面共价键合纤维素-三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶色谱柱时，会造成异构体杂质相对保留时间发生变化，从而造成对照品和异构体杂质重叠。因此，该方法不能完全实现对异构体杂质的定性及定量检测。
对比实施例2
仪器：岛津-LC-20AD；
色谱柱：Daicel chiralpak AD-H 5um 4.6×250mm[硅胶表面涂敷直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]
流动相：正己烷：0.1％二乙胺-异丙醇溶液(V正己烷：V0.1％二乙胺-异丙醇＝90:10)
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：207nm(DAD)
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法包含以下步骤：
1.溶液的配制：
溶液配制方法照实施例1进行
2.进样
3.等度洗脱
所得HPLC色谱图如图6所示，结果显示，对照品和异构体杂质在保留时间为5.990min处峰型重叠未分离。该对比例的色谱柱不能有效区分对照品和异构体杂质，对照品和异构体杂质峰型重叠，不能分离。经分析，可能与色谱柱填充材料等因素有关，当选用表面涂敷直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅胶色谱柱时，会造成异构体杂质相对保留时间发生变化，从而造成对照品和异构体杂质重叠。因此，该方法不能实现异构体杂质的定性及定量检测。
对比实施例3
仪器：岛津-LC-2030C 3D；
色谱柱：NanoChrom Unichiral AS 5um 4.6×250mm[(硅胶表面修饰多糖衍生物]
流动相：正己烷：0.1％二乙胺-异丙醇溶液(V正己烷：V0.1％二乙胺-异丙醇溶液＝90:10)
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：207nm(DAD)
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法包含以下步骤：
1.溶液的配制：
溶液配制方法照实施例1进行
2.进样
3.等度洗脱
所得HPLC色谱图如图7所示，结果显示，对照品和异构体杂质峰型未分离且重叠。本对比例的色谱柱不能有效区分对照品和异构体杂质，并且对照品和异构体杂质的保留时间为4-6min，色谱峰未分离且峰形重叠。经分析，其结果与不同厂家色谱柱的填充材料有关，当选用大孔径球形硅胶为基质，表面修饰多糖衍生物的填料色谱柱时，会引起对照品与异构体杂质相重叠，从而造成对照品和异构体杂质分离效果不佳。因此，该方法不能完全实现对异构体杂质的定性及定量检测。
对比实施例4
仪器：岛津-LC-2030C 3D；
色谱柱：Daicel chiralpak AY-H 5um 4.6×250mm[硅胶表面涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)]
流动相：正己烷：0.1％二乙胺-乙醇溶液(V正己烷：V0.1％二乙胺-乙醇溶液＝90:10)
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
检测波长：207nm(DAD)
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法包含以下步骤：
1.溶液的配制：
具体地，待测样品溶液所需稀释剂的配制方法为：量取正己烷与无水乙醇各100mL，混合，摇匀；二乙胺-乙醇溶液配制方法为：移取二乙胺1mL至1000mL乙醇中，摇匀，超声处理10min，冷却至室温；系统适用性溶液的配制方法为：取对照品约500mg与异构体杂质约5mg，称定，置100mL量瓶中，加适量稀释剂，超声溶解，放冷至室温，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；流动相配制方法：量取正己烷900mL和二乙胺-乙醇溶液100mL，混合，摇匀，超声10min，冷却至室温。
2.进样
3.等度洗脱
所得HPLC色谱图如图8所示，结果显示，对照品和异构体杂质依次出峰，异构体杂质的出峰时间6.395min，对照品的出峰时间10.519min，分离度效果好，但是对照品峰形异常呈前肩峰。本对比例的流动相为乙醇时导致对照品的峰形异常。经分析，可能与主成分的极性大小、乙醇的比例等因素有关，当选用乙醇为流动相时，由于乙醇的极性过大，从而造成对照品峰形异常呈前肩峰。因此，该方法虽可以实现分离，但综合峰型等其他因素，认为仍不适用于对异构体杂质定性检测和定量检测。
对比实施例5
仪器：岛津-LC-2030C 3D；
色谱柱：Daicel chiralpak AY-H 5um 4.6×250mm[硅胶表面涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)]
流动相：正己烷：异丙醇(V正己烷：V异丙醇＝90:10)
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
检测波长：207nm(DAD)
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯的质量控制方法包含以下步骤：
1.溶液的配制：
具体地，待测样品溶液所需稀释剂的配制方法为：量取正己烷与无水乙醇各100mL，混合，摇匀；系统适用性溶液的配制方法为：取对照品约500mg与异构体杂质约5mg，称定，置100mL量瓶中，加稀释剂适量，超声溶解，放冷至室温，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；流动相配制方法：量取正己烷900mL和异丙醇溶液100mL，混合，摇匀，超声10min，冷却至室温。
2.进样
3.等度洗脱
所得HPLC色谱图如图9所示，结果显示，对照品与异构体杂质在保留时间为7.751min处峰形重叠，且峰形异常；本对比例中，无添加剂的流动相不能有效区分对照品与异构体杂质，而且对照品与异构体杂质峰型重叠未分离。经分析，可能与手性胺的酸碱性等因素有关，当选用无添加剂的异丙醇为洗脱溶剂时，会引起异构体杂质与对照品保留时间发生改变，从而造成对照品重叠且峰形异常。因此，该方法不能完全实现对异构体杂质的定性及定量检测。
对比实施例6
仪器：岛津-LC-2030C 3D；
色谱柱：Daicel chiralpak AY-H 5um 4.6×250mm[硅胶表面涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)]
流动相：正己烷：0.2％二乙胺-异丙醇溶液(V正己烷：V0.2％二乙胺-异丙醇溶液＝90:10)
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
检测波长：207nm(DAD)
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法包含以下步骤：
1.溶液的配制：
具体地，待测样品溶液所需稀释剂的配制方法为：量取正己烷与无水乙醇各100mL，混合，摇匀；二乙胺-异丙醇溶液的配制方法为：移取二乙胺2mL至1000mL异丙醇中，摇匀，超声处理10min，冷却至室温；系统适用性溶液的配制方法为：取对照品约500mg与异构体杂质约5mg，称定，置100mL量瓶中，加适量稀释剂，超声溶解，放冷至室温，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；流动相配制方法：量取正己烷900mL和二乙胺-异丙醇溶液100mL，混合，摇匀，超声10min，冷却至室温。
2.进样
3.等度洗脱
所得HPLC色谱图如图10所示，结果显示，对照品与异构体杂质依次出峰，分离度略有增加；本对比例，增加流动相中二乙胺的质量百分比，虽可以有效区分对照品与异构体杂质，但是引起峰高、峰面积等参数均明显下降。经分析，二乙胺质量百分比的增加，虽可以提高分离效果，但是不显著，同时引起峰高、峰面积等参数下降明显。考虑到样品响应因子本来小的前提，因此，该方法不能完全实现对异构体杂质的定性及定量检测。
对比实施例7
仪器：岛津-LC-2030C 3D；
色谱柱：Daicel chiralpak AY-H 5um 4.6×250mm[硅胶表面涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)]
流动相：正己烷：0.1％二乙胺-异丙醇溶液(V正己烷：V0.1％二乙胺-异丙醇溶液＝85:15)
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
检测波长：207nm(DAD)
所述(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制方法包含以下步骤：
1.溶液的配制：
具体地，待测样品溶液所需稀释剂的配制方法为：量取正己烷与无水乙醇各100mL，混合，摇匀；二乙胺-异丙醇溶液的配制方法为：移取二乙胺1mL至1000mL异丙醇中，摇匀，超声处理10min，冷却至室温；系统适用性溶液的配制方法为：取对照品约500mg与异构体杂质约5mg，称定，置100mL量瓶中，加适量稀释剂，超声溶解，放冷至室温，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；流动相配制方法：量取正己烷850mL和二乙胺-异丙醇溶液150mL，混合，摇匀，超声10min，冷却至室温。
2.进样
3.等度洗脱
所得HPLC色谱图如图11所示，结果显示，对照品与异构体杂质依次出峰且保留时间分别为5.838min和6.204min，但分离度小于2.0，两者峰形连接；本对比例中，改变流动相洗脱比例，虽可以使对照品与异构体杂质依次出峰，但是分离度明显下降。经分析，主要起分离效果的异丙醇浓度增加，会引起流动相整体极性增加，不利于对照品与异构体杂质的有效分离。因此，该方法不能完全实现对异构体杂质的定性及定量检测。
对比实施例8
参照文献：“Syntheses of Four Enantiomers of 2,3-Diendo-and 3-Endo-aminobicyclo[2.2.2]oct-5-ene-2-exo-carboxylic Acid and Their SaturatedAnalogues”,Molecules,2013,18,P15080-15093，公开(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯的制备方法以及一种HPLC测量(±)-2和(±)-3ee值的方法，具体如下：
色谱柱：Daicel Chirelcel OD-H[纤维素-三-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]
流动相：正己烷：异丙醇溶液(V正己烷：V异丙醇溶液＝80:20)
流动相：正己烷：异丙醇溶液(V正己烷：V异丙醇溶液＝95:5)
流速：0.25mL/min
波长：233nm
进样体积：2μL
1.溶液的配制：
取(+)-2·HCl,(–)-2·HCl,(+)-3·HCl or(–)-3·HCl样品10mg置于瓶中，加入1mol/L的氢氧化钠溶液1mL；甲苯1mL和15mol/L的苯甲酰氯，混合，室温静置15min，待甲苯层分离、干燥、蒸发后；将残渣溶于2mL的正己烷和异丙醇溶液(8:2)中，过滤得经苯甲酰预处理样品溶液。流动相的配制：量取正己烷800mL和异丙醇溶液200mL，混合，摇匀，超声10min，冷却至室温；量取正己烷950mL和异丙醇溶液50mL，混合，摇匀，超声10min，冷却至室温。
2.进样
3.采用文献记载的浓度设置洗脱：
所得样品(+)-2·HCl,(–)-2·HCl,(+)-3·HCl or(–)-3·HCl HPLC的保留时间分别为26.1min；34.3min；33.48min；35.2min，该方法采用Daicel Chirelcel OD-H色谱柱，流动相为正己烷-异丙醇(80:20/95:5)的色谱条件，测其化合物的ee值；其中，样品经过NaOH/甲苯、苯甲酰氯预处理后，再经甲苯溶剂分离，过滤，才可测量，其过程繁琐，耗时，仅是通过其HPLC测量其化合物的纯度，并没有实现通过HPLC色谱条件来对(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯的异构体杂质有效分离。
综合以上实施例及对比实施例可知，采用实施例1-4的方法，不仅可以实现对异构体杂质的基线分离，同时其杂质有最佳的响应，并进一步实现对杂质的定性和定量检测，利于(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐作为起始原料的合成中杂质的质量控制；反观对比实施例1-8，其由于色谱柱、流动相等因素中的至少一项不在本发明所述质量控制方法的范围内，使对应方法所得谱图具有分离效能，峰形、峰面积等评判标准存在至少一项不符合，使得对应方法不适用于(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯及其盐的质量控制。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种手性胺小分子及其盐的质量控制方法，其特征在于，所述手性胺小分子为(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯，所述质量控制方法使用高效液相色谱分析，选用表面正相涂敷有直链淀粉-三(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶色谱柱，其检测条件如下：
流动相：流动相的组成为正己烷、质量百分比0.05％-0.15％的二乙胺-异丙醇溶液，其中，二者体积比V正己烷：V二乙胺-异丙醇＝88:12-95:5
检测波长：205nm-215nm
柱温：25℃-38℃
进样量：8μL-12μL
进样浓度：4mg/mL-6mg/mL
流速：0.3mL/min-1.0mL/min；
所述方法，其步骤包括：
1)溶液配制；
2)进样；
3)等度洗脱。
2.根据权利要求1所述的手性胺小分子及其盐的质量控制方法，其特征在于，所述色谱柱为Daicel chiralpak AY-H色谱柱。
3.根据权利要求1所述的手性胺小分子及其盐的质量控制方法，其特征在于，所述流动相洗脱剂体积比V正己烷:V二乙胺-异丙醇＝90:10。
4.根据权利要求1所述的手性胺小分子及其盐的质量控制方法，其特征在于，所述流动相二乙胺-异丙醇溶液中添加剂二乙胺质量百分比为0.1％。
5.根据权利要求1所述的手性胺小分子及其盐的质量控制方法，其特征在于，所述柱温为30℃，所述流动相流速为0.5mL/min，进样体积为10μL，所述进样浓度为5mg/mL。
6.根据权利要求1所述的手性胺小分子及其盐的质量控制方法，其特征在于，所述检测波长为207nm。
7.一种手性胺小分子及其盐的质量控制方法，其特征在于，所述手性胺小分子为(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯，通过高效液相色谱进行检测，其特征检测条件如下：
色谱柱：Daicel chiralpak AY-H 5um 4.6×250mm，其硅胶表面正相涂敷直链淀粉-三-(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)；
流动相：V正己烷：V0.1％二乙胺-异丙醇溶液＝90:10；
进样量：10μL；
流速：0.5mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：207nm，DAD；
所述方法包含以下步骤：
1)溶液配制；
2)进样；
3)等度洗脱。
8.根据权利要求7所述的手性胺小分子及其盐的质量控制方法，其特征在于，所述步骤1)中的溶液配制，包括流动相配制、待测样品溶液配制，所述待测样品溶液所需稀释剂的配制方法为：量取正己烷与无水乙醇各100mL，混合，摇匀；所述二乙胺-异丙醇溶液的配制方法为：精确量取二乙胺至1000mL异丙醇中，摇匀，超声处理10min，冷却至室温；所述待测样品溶液配制方法为：取对照品约500mg与异构体杂质约5mg，称定，置100mL量瓶中，加适量稀释剂，超声溶解，放冷至室温，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；所述流动相配制方法为：量取正己烷900mL和二乙胺-异丙醇溶液100mL，混合，摇匀，超声10min，冷却至室温。
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