CN112578030B - 一种盐酸替罗非班注射液中对映异构体的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种盐酸替罗非班注射液中对映异构体的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：1)取D‑盐酸替罗非班对照品，加水溶解，得对照品溶液；2)取盐酸替罗非班注射液作为供试品溶液；3)分别取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪检测。本发明提供的盐酸替罗非班注射液中对映异构体的检测方法，能够更加准确地检测盐酸替罗非班注射液的对映异构体，可使对映异构体与注射液中的其他峰分开，实现对映异构体的准确检测，从而更好地控制盐酸替罗非班注射液的产品质量。

Description

一种盐酸替罗非班注射液中对映异构体的检测方法

技术领域

本发明涉及一种盐酸替罗非班注射液中对映异构体的检测方法，属于医药技术领域。

背景技术

盐酸替罗非班是一种可逆性非肽类血小板表面糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂，由美国Merck公司研制开发，于1998年5月首次在美国上市，目前已在瑞士、德国、英国、荷兰等国上市。其对血小板表面糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa受体具有高度的选择性和特异性，可逆性抑制血小板聚集且半衰期短，无抗原性，不良反应少。盐酸替罗非班注射液与肝素联用，适用于不稳定型心绞痛或非Q波心肌梗塞病人，预防心脏缺血事件，同时也适用于冠脉缺血综合征病人进行冠脉血管成形术或冠脉内斑块切除术，以预防与经治冠脉突然闭塞有关的心脏缺血并发症。

替罗非班具有一个手性碳原子，因此在合成过程中会存在两种构型，即D构型和L构型。其中只有L构型的替罗非班才具有治疗效果，而D构型的替罗非班则作为杂质需严格控制其含量。然而，针对盐酸替罗非班注射液中D-盐酸替罗非班的检测，目前并没有一种有效的方法。

因此，提供一种能够准确检测盐酸替罗非班注射液中对映异构体的高效液相色谱条件，成为一个急需解决的问题。专利CN102875449A公开了一种盐酸替罗非班异构体定量检测方法，该方法能实现高纯度盐酸替罗非班中D构型替罗非班的检测，但是注射液有辅料的存在，在更多杂质的影响下，该方法并不适用，因此，盐酸替罗非班注射液中对映异构体的准确检测的问题现有技术中仍然不能解决。

发明内容

本发明提供了一种盐酸替罗非班注射液中对映异构体的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：

1)取D-盐酸替罗非班对照品，加水溶解，得对照品溶液；

2)取盐酸替罗非班注射液作为供试品溶液；

3)分别取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：手性色谱柱；流动相：甲酸铵混合溶液(A)-乙腈(B)-甲醇(C)，其比例为A:B:C＝750～755：250～247：4～2；

所述甲酸铵混合溶液是由甲酸铵水溶液和三氟乙酸混合制成，其中甲酸铵水溶液和三氟乙酸的体积比为750：2。

进一步地，步骤1)所述对照品溶液每1ml含D-盐酸替罗非班0.015～0.30μg，优选0.15μg。

进一步地，步骤2)所述供试品溶液每1ml含盐酸替罗非班45～55μg，优选50μg。

进一步地，步骤3)所述色谱柱为CHIRALPAK IC，规格为4.6mm×250mm，5μm。

进一步地，步骤3)所述流动相比例为A:B:C＝750：250：4。

进一步地，步骤3)所述甲酸铵水溶液浓度为0.01mol/L；所述甲酸铵混合溶液用10％氨水试剂调节pH值至2.8～3.2，优选调节pH值至3.0。

进一步地，步骤3)所述色谱条件中检测波长222-232nm，柱温28-32℃，流动相流速0.28～0.32ml/min，进样量100～200μl。

更进一步地，所述检测波长227nm，柱温30℃，流动相流速0.3ml/min，进样量100μl。

本发明提供的盐酸替罗非班注射液中对映异构体的检测方法，能够准确地检测盐酸替罗非班注射液的对映异构体，可使对映异构体与注射液中的其他峰分开，实现对映异构体的准确检测，从而更好地控制盐酸替罗非班注射液的产品质量。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1系统适用性实验HPLC谱图

图2流动相流速为0.28ml/min时HPLC谱图

图3流动相流速为0.30ml/min时HPLC谱图；

图4流动相流速为0.32ml/min时HPLC谱图

图5色谱柱柱温为28℃时HPLC谱图

图6色谱柱柱温为30℃时HPLC谱图

图7色谱柱柱温为32℃时HPLC谱图

图8未破坏辅料空白溶液HPLC谱图

图9未破坏对照品溶液HPLC谱图

图10未破坏供试品溶液HPLC谱图

图11酸破坏辅料空白溶液HPLC谱图

图12酸破坏供试品溶液HPLC谱图

图13碱破坏辅料空白溶液HPLC谱图

图14碱破坏供试品溶液HPLC谱图

图15高温破坏辅料空白溶液HPLC谱图

图16高温破坏供试品溶液HPLC谱图

图17强光破坏辅料空白溶液HPLC谱图

图18强光破坏供试品溶液HPLC谱图

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本发明盐酸替罗非班注射液中对映异构体D-盐酸替罗非班的检测

a、取盐酸替罗非班注射液作为供试品，盐酸替罗非班浓度为50μg/ml；

b、取D-盐酸替罗非班对照品，用水溶解，得到浓度为0.15μg/ml的对照品溶液；

c、分别取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：CHIRALPAK IC(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：甲酸铵混合溶液(A)-乙腈(B)-甲醇(C)，其体积比为A:B:C＝750：250：4；

流动相流速0.3ml/min；

检测波长227nm；

柱温30℃；

进样量100μl；

所述甲酸铵混合溶液(A)是由0.01mol/L甲酸铵水溶液和三氟乙酸混合制成，并用10％氨水试剂调节pH值至3.0，其中0.01mol/L甲酸铵水溶液和三氟乙酸的体积比为750：2。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1系统适用性考察

取1.5μg/ml D-盐酸替罗非班对照品溶液1ml，至10ml量瓶中，用盐替罗非班注射液(按表1所示盐酸替罗非班注射液处方配制)稀释至刻度，即得系统适用性溶液。

表1盐酸替罗非班注射液处方

成分	用量
		盐酸替罗非班	5.00g(按C<sub>22</sub>H<sub>36</sub>N<sub>2</sub>O<sub>5</sub>S计)
氯化钠	900.0g
		枸橼酸钠	54.0g
无水枸橼酸	3.2g
		注射用水	100L

取系统适用性溶液为供试品，采用实施例1的方法检测，HPLC谱图见图1，检测结果见表2。

表2盐酸替罗非班注射液高效液相检测结果

系统适用性实验表明，采用上述检测条件，D-盐酸替罗非班与盐酸替罗非班主峰可完全分离，可准确检测D-盐酸替罗非班。

实验例2流动相流速对D-盐酸替罗非班与相邻峰分离度的影响

取系统适用性溶液，分别考察流动相流速为0.28ml/min、0.30ml/min、0.32ml/min，检测条件如下：

色谱柱：CHIRALPAK IC(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：甲酸铵混合溶液：乙腈：甲醇体积比为750：250：4；其中甲酸铵混合溶液是由0.01mol/L甲酸铵水溶液和三氟乙酸混合制成，并用10％氨水试剂调节pH值至3.0，其中0.01mol/L甲酸铵水溶液和三氟乙酸的体积比为750：2；

波长：227nm，检测器：DAD检测器，柱温：30℃，进样量：100μl。

操作步骤同实施例1，检测结果见表3，HPLC谱图见图2～4。

表3流动相流速对D-盐酸替罗非班分离度的影响

试验结果：轻微改变流动相流速，对D-盐酸替罗非班与盐酸替罗非班的分离度影响不大，表明本发明对流动相流速的改变耐用性良好。

实验例3色谱柱柱温对D-盐酸替罗非班与相邻峰分离度的影响

取系统适用性溶液，分别考察色谱柱柱温为28℃、30℃、32℃，检测条件如下：

色谱柱：CHIRALPAK IC(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：甲酸铵混合溶液：乙腈：甲醇体积比为750：250：4；其中其中甲酸铵混合溶液是由0.01mol/L甲酸铵水溶液和三氟乙酸混合制成，并用10％氨水试剂调节pH值至3.0，其中0.01mol/L甲酸铵水溶液和三氟乙酸的体积比为750：2；

流速：0.3ml/min，波长：227nm，检测器：DAD检测器，进样量：100μl。

操作步骤同实施例1，检测结果见表4，HPLC谱图见图5～7。

表4色谱柱柱温对D-盐酸替罗非班分离度的影响

试验结果：轻微改变色谱柱柱温，对D-盐酸替罗非班与盐酸替罗非班的分离度影响不大，表明本发明对色谱柱柱温的改变耐用性良好。

实验例4盐酸替罗非班注射液破坏试验中对映异构体的测定

仪器：Agilent 1260液相色谱仪

色谱柱：CHIRALPAK IC(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：甲酸铵混合溶液：乙腈：甲醇体积比为750：250：4；其中甲酸铵混合溶液是由0.01mol/L甲酸铵水溶液和三氟乙酸混合制成，并用10％氨水试剂调节pH值至3.0，其中0.01mol/L甲酸铵水溶液和三氟乙酸的体积比为750：2；

流速：0.3ml/min，波长：227nm，检测器：DAD检测器，柱温：30℃，进样量：100μl。

辅料空白储备液：按照处方比例称取氯化钠、枸橼酸钠、无水枸橼酸适量，加水溶解制成每1ml中约含氯化钠90mg、枸橼酸钠5.4mg和无水枸橼酸0.32mg的溶液，作为辅料空白储备液。

供试品储备液：按照处方比例称取氯化钠、枸橼酸钠、无水枸橼酸、盐酸替罗非班适量，加水溶解制成每1ml中约含氯化钠90mg、枸橼酸钠5.4mg、无水枸橼酸0.32mg和盐酸替罗非班0.5mg的溶液，作为供试品储备液。

D-盐酸替罗非班对照品储备液：称取D-盐酸替罗非班对照品适量，加水溶解制成每1ml中约含D-盐酸替罗非班1.5μg的溶液，作为对照品储备液。

1、盐酸替罗非班注射液未破坏的异构体检测

取辅料空白储备液、对照品储备液、供试品储备液各1ml，分别置10ml量瓶中，加水稀释至刻度。各储备液注入液相色谱仪测定，HPLC谱图见图8～10。

2、盐酸替罗非班注射液酸破坏的异构体检测

取辅料空白储备液、供试品储备液各1ml，分别置10ml量瓶中，加入1mol/L盐酸0.1ml，室温避光放置20小时后加入1mol/L氢氧化钠0.1ml中和，加水稀释至刻度。各储备液注入液相色谱仪测定，HPLC谱图见图11～12。

3、盐酸替罗非班注射液碱破坏的异构体检测

取辅料空白储备液、供试品储备液各1ml，分别置10ml量瓶中，加入1mol/L氢氧化钠0.1ml，室温避光放置20小时后加入1mol/L盐酸0.1ml中和，加水稀释至刻度。各储备液注入液相色谱仪测定，HPLC谱图见图13～14。

4、盐酸替罗非班注射液高温破坏的异构体检测

取辅料空白储备液、供试品储备液各1ml，分别置10ml量瓶中，于90℃条件下放置6小时，冷却至室温后，加水稀释至刻度。各储备液注入液相色谱仪测定，HPLC谱图见图15～16。

5、盐酸替罗非班注射液高温破坏的异构体检测

取辅料空白储备液、供试品储备液各1ml，分别置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，于4500lx±500lx强光条件下放置10小时。各储备液注入液相色谱仪测定，HPLC谱图见图17～18。

从上述结果可见：注射液中产生的降解杂质不干扰异构体检测，本发明检测方法稳定性好，准确度高。

综上，本发明盐酸替罗非班注射液中对映异构体的检测方法，能够准确地检测盐酸替罗非班注射液的对映异构体，可使对映异构体与注射液中的其他峰分开，实现对映异构体的准确检测，从而更好地控制盐酸替罗非班注射液的产品质量。

Claims (7)

1.一种盐酸替罗非班注射液中对映异构体的检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：

1）取D-盐酸替罗非班对照品，加水溶解，得对照品溶液；

2）取盐酸替罗非班注射液作为供试品溶液；

3）分别取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：CHIRALPAK IC，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相：甲酸铵混合溶液A-乙腈B-甲醇C，其比例为A:B:C=750：250：4；检测波长222-232nm，柱温28-32℃，流动相流速0.28~0.32ml/min，进样量100~200μl；

所述甲酸铵混合溶液是由甲酸铵水溶液和三氟乙酸混合制成，其中甲酸铵水溶液和三氟乙酸的体积比为750：2；所述甲酸铵水溶液浓度为0.01mol/L；所述甲酸铵混合溶液用10%氨水试剂调节pH值至2.8~3.2。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1）所述对照品溶液每1ml含D-盐酸替罗非班0.015~0.30µg。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述对照品溶液每1ml含D-盐酸替罗非班0.15µg。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2）所述供试品溶液每1ml含盐酸替罗非班45~55µg。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤2）所述供试品溶液每1ml含盐酸替罗非班50µg。

6.据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3）所述甲酸铵混合溶液用10%氨水试剂调节pH值至3.0。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测波长227nm，柱温30℃，流动相流速0.3ml/min，进样量100μl。

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