CN112575389B - 一种dna编码化合物库的液相色谱纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于DNA编码化合物库纯化的液相色谱纯化方法，所述方法为：取DNA编码化合物或其中间体，利用液相色谱柱进行洗脱，即可；其中，洗脱采用的流动相中，A相含有水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇，B相含有甲醇。实验结果表明，本发明提供的液相纯化方法可以有效去除DNA编码化合物库合成过程中引入的单段DNA片段，还能够有效去除多个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质，能够显著提升DNA编码化合物库的最终产物纯度，并显著减少DNA片段的用量，降低生产成本，具有非常好的应用前景。

Description

一种DNA编码化合物库的液相色谱纯化方法

技术领域

本发明涉及一种DNA编码化合物库的液相色谱纯化方法。

背景技术

在新药研发领域，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库。而且化合物能够通过基因测序的方法进行识别，大幅度地增加了化合物库的大小和合成效率，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(Accounts of Chemical Research,2014,47,1247-1255)。

DNA编码化合物库(DEL)的构建利用组合化学的“组合-拆分”策略，可快速得到数量巨大的化合物库，并且化合物中的每一维结构信息都可以由唯一的DNA片段进行标记。在DNA编码化合物库的构建过程中，每一维度都需要加入过量的DNA片段进行反应以保证化合物被正确标记。然而过量的DNA片段会继续与下一维度的DNA片段发生反应，导致后续的磁珠纯化不完全，从而影响最终DNA编码化合物库的纯度。另外由于DNA编码化合物库的成本大部分来自于DNA片段，过量的DNA片段会增加下一维度DNA片段的使用量，从而导致构建成本的大幅增加。

中国专利201610229301.0公开了一种固相合成DNA编码化合物库的方法，该专利对固相合成DNA编码化合物生产过程中的粗产物用蒸馏水和0.1M TEAA(醋酸三乙胺)缓冲溶液洗涤，进行纯化。但是，该纯化方法仅用于固相合成的纯化，并且不能除去未反应的DNA片段。目前液相合成DNA编码化合物库常用的纯化方法(如TEAA体系)并不能很好地除去未反应的DNA片段，因此，开发一种新的能够有效除去过量DNA片段的纯化方法，能大幅节约构建化合物库的成本，并且提高DNA编码化合物库的纯度，可以极大地提高DNA编码化合物库的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA编码化合物库的液相色谱纯化方法。

本发明提供了一种用于DNA编码化合物库纯化的液相色谱纯化方法，取DNA编码化合物或其中间体，利用液相色谱柱进行洗脱，即可；其中，洗脱采用的流动相中，A相含有水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇，B相含有甲醇。

进一步地，所述流动相中，B相的体积百分数为1％～90％。

进一步地，所述A相由水、二异丙基乙胺和六氟异丙醇组成。

进一步地，所述A相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.01～1％，六氟异丙醇的体积百分数为0.5％～10％，其余为水；

优选地，所述A相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.05～0.5％，六氟异丙醇的体积百分数为1％～5％，其余为水；

更优选地，所述A相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.15％，六氟异丙醇的体积百分数为2.5％，其余为水。

进一步地，所述B相为甲醇。

进一步地，所述方法中，洗脱条件如下：

时间(min)	梯度(B％，v/v)
		0	1
2	1
		12	45
13	90
		16	90
16.1	1
		20	1

或

时间(min)	梯度(B％)
		0	2
4	2
		4.1	17
16	57
		16.5	90
18.5	90
		19	2
25	2

。

进一步地，所述DNA编码化合物或其中间体的DNA部分长度为25～80bp。

进一步地，利用液相色谱柱进行洗脱除去的部分为长度10～60bp的单段DNA片段，或n个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质；其中n为2、3或4。

进一步地，所述液相色谱柱为C18色谱柱，优选为Waters XBridge BEH ShieldRP18或YMC Triant C18。

进一步地，所述液相色谱柱的柱温为35～45℃。

本发明中，ACN为乙腈，DIEA为二异丙基乙胺，HFIP为六氟异丙醇，MEOH甲醇，TEAA为醋酸三乙胺。

本发明中DNA编码化合物中间体表示制备DNA编码化合物库终产物之前得到的、连接了DNA片段的中间产物。

本发明中DNA编码化合物或其中间体中的DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链。

本发明的液相色谱纯化方法适用于C18色谱柱，可以根据分离样品量选择不同大小的色谱柱。

实验结果表明，本发明提供了一种DNA编码化合物库的液相纯化方法，该方法以水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇、甲醇为洗脱剂，可以将长度为10～60bp的单段DNA片段或多个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质与DNA部分长度为25～80bp的DNA编码化合物或其中间体分离。本发明的方法不仅能够有效的去除DEL生产过程中的单段DNA片段，还能够有效除去多个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质，能够显著提升DNA编码化合物库的最终产物纯度，并显著减少DNA片段的用量，降低生产成本，具有非常好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 DNA编码化合物库合成过程中的单次纯化步骤示意图。

图2 DNA编码化合物库合成过程中的多次纯化步骤示意图。

图3实施例1中使用TEAA体系分离的HPLC图谱。

图4实施例2中使用本发明方法分离的HPLC图谱。

图5实施例2中使用本发明方法纯化前(a)、后(b)HPLC对比图。

图6实施例2中使用本发明方法纯化前(a)、后(b)LC-MS对比图，图中的“DNA短片段”表示单段DNA片段。

图7实施例2中未使用本发明方法纯化组分(a)、使用本发明方法纯化后组分(b)连接下一维度DNA片段的凝胶电泳对比图。

图8实施例3中使用本发明方法分离的HPLC图谱，图中的“DNA短片段”表示单段DNA片段或多个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质。

图9实施例3中使用本发明方法纯化前(a)、后(b)HPLC对比图，图中的“DNA短片段”表示单段DNA片段或多个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明中采用DNA编码化合物中间体的DNA部分长度为25～80bp，DNA片段A、B的长度为10～60bp。

本发明实施例中采用的液相色谱柱型号为Waters XBridge BEH Shield RP18或YMC Triant C18。

实施例1、使用TEAA体系单次分离纯化DNA编码化合物库

按照附图1所示的DNA编码化合物库合成过程中的纯化1步骤，使用制备液相色谱(Gilson GX-281，柱温为35～45℃)按表1所示梯度进行梯度洗脱，使用紫外检测器检测，收集在260nm波长有吸收的组分，并使用LC-MS及HPLC对收集的组分冻干后进行表征。结果如图3所示。

表1：梯度洗脱条件(A相：100mM TEAA水溶液；B相：ACN)

时间(min)	梯度(B％)
		0	1
2	1
		12	45
13	90
		16	90
16.1	1
		20	1

结果表明，TEAA体系纯化不能将单段DNA片段或多个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质与目标产物分离，从而无法去除多余的单段DNA片段或多个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质。这些多余的DNA片段将作为杂质进入下一维度的反应或残留至最终产物中，影响最终产品的纯度。

对12个不同的DNA编码化合物库按照上述TEAA体系纯化，得到最终DNA编码化合物库产品的纯度结果如表2所示。结果表明，采用TEAA体系进行纯化所得DNA编码化合物库终产品的纯度仅为60.0％～74.8％。

表2：TEAA体系纯化的DNA编码化合物库终产品的纯度

实施例2、使用本发明方法多次分离纯化(去除单段DNA片段)DNA编码化合物库

(1)按照附图1所示的DNA编码化合物库合成过程中的纯化1步骤，使用制备液相色谱(Gilson GX-281，柱温为35～45℃)按表3所示梯度进行梯度洗脱，使用紫外检测器检测，收集在260nm波长有吸收的组分，并使用LC-MS及HPLC对收集的组分冻干后进行表征。结果如图4所示。

表3：梯度洗脱条件(A相：0.15％DIEA、2.5％HFIP的水溶液；B相：MEOH)

时间(min)	梯度(B％)
		0	1
2	1
		12	45
13	90
		16	90
16.1	1
		20	1

结果表明，本发明的液相纯化方法可以成功将单段DNA与目标产物分开。对纯化前后的组分进行HPLC及UPLC-MS分析(图5和图6)，结果表明，纯化后组分中单段DNA片段含量明显减少。

(2)进一步地，按照附图2所示的DNA编码化合物库合成过程，将上述纯化后的产物进行下一维度反应并进行纯化2步骤，得到最终DNA编码化合物库终产品的纯度为82.9％，显著高于TEAA体系纯化后得到的DNA编码化合物库终产品。

(3)将未经过本发明方法纯化的组分分别与0.6、1.0、1.5、2.0倍的下一维DNA片段进行反应时，能明显观察到DNA片段与下一维试剂连接的副产物；而经过本发明方法纯化后的组分分别与0.6(涌道1)、1.0(涌道2)、1.5(涌道3)、2.0(涌道4)倍的下一维DNA片段进行反应时，该副产物明显减少(图7)。经本发明方法纯化后，使用0.6倍的下一维DNA片段就可以达到未经纯化时使用1.0倍下一维DNA片段时的转化率，从而减少约40％的下一维度DNA片段的用量。

以上实验结果表明，本发明方法能够有效的去除DNA编码化合物库合成过程中的单段DNA片段，提升DNA编码化合物库的最终产品纯度，并显著减少DNA片段的用量，降低生产成本。

实施例3、使用本发明方法单次分离纯化(去除单段DNA片段以及两个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质)DNA编码化合物库

按照附图1所示的DNA编码化合物库合成过程中的纯化1步骤，使用制备液相色谱(Gilson GX-281，柱温为35～45℃)按表4所示梯度进行梯度洗脱，使用紫外检测器检测，收集在260nm波长有吸收的组分，并使用LC-MS及HPLC表征。结果如图8所示。

表4：梯度洗脱条件(A相：0.15％DIEA、2.5％HFIP的水溶液；B相：MEOH)

时间(min)	梯度(B％)
		0	2
4	2
		4.1	17
16	57
		16.5	90
18.5	90
		19	2
25	2

结果表明，本发明的液相纯化方法可以成功将单段DNA片段、两个单段DNA片段相连后的DNA片段杂质与目标产物分开。对纯化前后的组分进行HPLC分析(图9)，结果表明，纯化后组分中单段DNA片段和两个单段DNA片段相连后的片段杂质含量明显减少。

上述经本发明方法纯化后得到DNA编码化合物库终产品的纯度为82.2％，显著高于TEAA体系纯化后得到的DNA编码化合物库终产品。

以上实验结果表明，本发明方法不仅能够有效的去除DNA编码化合物库合成过程中的单段DNA片段，还能够有效除去多个单段DNA片段相连后的DNA片段杂质，能够提升DNA编码化合物库的最终产物纯度。

综上，本发明提供了一种DNA编码化合物库的液相纯化方法，该方法以以水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇、甲醇为洗脱剂，可以有效去除DNA编码化合物库合成过程中的单段DNA片段，还能够有效除去多个单段DNA片段相连后的DNA片段杂质，能够显著提升DNA编码化合物库的最终产物纯度，并显著减少DNA片段的用量，降低生产成本，具有非常好的应用前景。

Claims (5)

1.一种用于DNA编码化合物库纯化的液相色谱纯化方法，所述方法为：取DNA编码化合物或其中间体，利用液相色谱柱进行洗脱，即可；其中，所述液相色谱柱为C18色谱柱；洗脱采用的流动相中，A相由水、二异丙基乙胺和六氟异丙醇组成，其中异丙基乙胺的体积百分数为0.15％，六氟异丙醇的体积百分数为2.5％，其余为水；B相为甲醇；

洗脱条件如下：

时间(min) 梯度(B％，v/v) 0 1 2 1 12 45 13 90 16 90 16.1 1 20 1

或

时间(min) 梯度(B％) 0 2 4 2 4.1 17 16 57 16.5 90 18.5 90 19 2 25 2

。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述DNA编码化合物或其中间体的DNA部分长度为25～80bp。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：利用液相色谱柱进行洗脱除去的部分为长度10～60bp的单段DNA片段，或n个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质；其中n为2、3或4。

4.根据权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于：所述C18色谱柱为WatersXBridge BEH Shield RP18或YMC Triant C18。

5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：所述液相色谱柱的柱温为35～45℃。