KR20230145403A - 단일클론 항체의 정제 공정 - Google Patents

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KR20230145403A
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라훌 샤라드 뱀부레
프라샨트 수레스라오 들가온카르
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카운슬 오브 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치
루핀 리미티드
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Abstract

본 발명은 대상 단백질을 배치, 통합된-연속 또는 유사-연속 방식으로 정제하는 공정에 관한 것이다. 이에, 본 발명은 단일클론 항체, 특히 IgG를 배치, 통합된-연속 또는 유사-연속 방식으로 정제하는 공정에 관한 것이다. 본 공정은 배치, 연속, 통합 연속 또는 유사-연속 방식으로 수행될 수 있다.

Description

단일클론 항체의 정제 공정
본 발명은 배치, 통합된 연속 또는 유사-연속 방식으로 대상 단백질을 정제하기 위한 공정에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 단일클론 항체, 특히 IgG를 배치, 통합된 연속 또는 유사-연속 방식으로 정제하기 위한 공정에 관한 것이다.
재조합 바이오의약품 단백질이 인간 환자에 투여하는데 허용 가능하기 위해서는 제조 및 정제 공정으로부터 기인한 잔류 불순물이 최종 생물학적 제품으로부터 제거되어야 한다. 이러한 공정 성분으로는 배양 배지 단백질, 면역글로불린 친화성 리간드, 바이러스 내독소, DNA 및 숙주 세포 단백질 (HCP)을 포함한다.
세포 배양물의 역가 증가와 생산에 사용되는 보다 대량의 세포 배양물로 인해, 산업계에서는 하류 공정을 병목 현상으로 평가하고 있다. 이는 특히 배치 부피를 하류 가공 용량으로 전환하는데 집중하는 단일클론 항체 (mAb) 생산과 관련 있다.
현재 하류 가공 처리는 상류 생산성 증가로 인해 거대 단일클론 항체 (mAb) 배치 규모를 가공 처리하는 능력을 제한할 수 있는 몇몇 장벽들에 직면해 있다. 한가지 도전 과제는 기존 제조 시설의 공간 제한과 운영의 유연성이다. 상류 공급원료로부터 생산물을 증가된 양으로 회수하기 위해서는 크로마토그래피 컬럼이 더 커야 하고, 그래서 필요한 수지의 양, 필터 표면적 및 완충제와 중간 풀 체적 (intermediate pool volumes) 역시 증가한다 (Low, 2007). 공정 중간 부피의 증가로 인해, 대체로 기존 풀 탱크는 더 큰 풀 부피를 수용하기에는 너무 작아, 대규모의 고 역가 생산 공정에서 병목 현상이 되고 있다.
단일 통과 접선 유동 여과 (Single Pass Tangential Flow Filtration, SPTFF)는, 재순환 루프 및 탱크가 필요 없는, 단백질 용액을 하나의 경로로 농축하는 것을 목표로 하는 새로운 기술이다 (De Los Reyes G, 2008). SPTFF 모듈 설계의 신규성은 단백질을 단일 경로로 농축하기 위해 복수의 여과 단계들을 단일한 장치에 배치하는 것으로, 전통적인 TFF 조작에 요구되는 재순환 탱크의 필요성이 생략된다. SPTFF 모듈을 사용하면, 더 많은 수준의 막 추가로 필터에서 용액의 체류 시간과 경로 길이를 연장하게 되며, 그래서 단 1회 통과로 투입 부피는 감소하고 더 많은 양의 투과물이 제거된다. 이의 단일-통과 방식으로 인해, SPTFF 공급원료는 일정한 단백질 농도를 유지하여, 시스템은 정상 상태 평형에 도달할 수 있다. 따라서, 일정한 공급 유량 (Q 공급)으로 인해, 농축물 유량 (retentate flow rate, Q 잔류물), 여과물 유량 (filtrate flow rate, Q 여과물) 및 농축 인자 역시 SPTFF 운영 중에 일정하게 유지된다.
과거 이러한 연구 분야에서 주목할 만한 진전이 달성되었는데, SPTFF 등의 고급 여과 기술을 이용한다.
미국 특허 공개번호 20150361129는 비-표적 단백질로부터 표적 단백질을 분리하는 공정을 기술하고 있다. 표적 단백질 및 비-표적 단백질을 함유한 샘플을 단일 통과 접선 유동 여과 (SPTFF)에 의해 농축한다. 표적 단백질은 배치 방식으로 추가로 정제한다. 표적 단백질과 비-표적 단백질을 농축한 후 연속적인 포획 크로마토그래피 단계를 수행하여야 한다.
미국 특허 5429746은 단백질 A, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 접선-유동 울트라 여과 등의 여과 기법 단계를 포함하는 혼합물 형태의 응집물로부터 IgG 모노머를 분리하는 방법을 기술하고 있다.
미국 특허 공개번호 20100234577은 순차적인, 직교 크로마토그래피, 및 접선 유동 울트라 여과 (TFUF)를 비롯한 여과 기법을 이용하여, 포유류 세포 배양 유체로부터 단일클론 항체를 정제함으로써, 인간 투여에 적합한 고 순도 및 품질을 수득하는 것을 개시하고 있다.
미국 특허 공개번호 20180155752는 친화성 크로마토그래피, 면역-친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 접선 유동 여과 및 크기 선별 크로마토그래피 (SEC) 단계를 수행함으로써 면역글로불린 등의 세포 생산물을 생산 및 정제하는 방법을 기술하고 있다.
단백질 정제 절차에 관한 문헌을 분석한 바, 당해 기술 분야에서는 선행 기술의 정제 절차에서 제기된 단점을 고려하는 정제 공정을 제공할 필요성이 있을 것으로 보인다.
이에, 본 발명의 주요 과제는 배치 (batch), 통합된-연속 (integrated-continuous) 또는 유사-연속 (pseudo-continuous) 방식으로 단백질을 정제하는 공정을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 과제는 배치, 통합된-연속 또는 유사-연속 방식으로 IgG 항체를 정제하는 공정을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명은 대상 단백질을 배치, 통합된-연속 또는 유사-연속 방식으로 정제하는 공정을 제공한다.
본 발명은 일 구현예에서, 하기 단계들을 포함하는 대상 단백질을 배치, 통합된-연속 또는 유사-연속 방식으로 정제하는 공정을 제공한다:
(a) 단일클론 항체를 함유한 수확물을 AEX 하이브리드 필터 (멤브레인과 통합된 음이온 교환 기능)로 여과하여, 수확물을 청징 처리하고 탁도, HCP 및 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 상류 공정 중에 생성된 공정-관련 불순물을 제거하는 단계;
(b) AEX 하이브리드 필터 산출물을 제1 단일-통과 접선 유동 여과 (SPTFF) 시스템 또는 제1 인-라인 농축기 (ILC)를 사용해 농축하여, 포획 단계 정제하기 전 농축된 단일클론 항체 용액을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)의 농축된 단일클론 항체에 대해 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계로서, 이러한 크로마토그래피 공정은
(i) 단계 (b)의 농축된 단일클론 항체 용액을 pH 6.00 내지 9.50 범위 및 전도도 >1 mS/cm에서 친화성 크로마토그래피 수지에 주입하여, 단일클론 항체는 포획하고 공정 및 생산-관련 불순물은 제거하고,
(ii) 포획된 단일클론 항체를 pH 범위 2.00 내지 5.00 및 전도도 >0.5 mS/cm의 용출 완충제로 용출하는 것을 포함하고,
여기서 단계 (i)에서 친화성 크로마토그래피 수지에의 주입은 관류 용량 (breakthrough capacity) >0.1%로 수행되고,
친화성 크로마토그래피 정제 단계 (i)에서 사용되는 크로마토그래피 컬럼의 개수는 1개 이상이고,
친화성 크로마토그래피에서 용출은 pH 범위 2.00 내지 5.00 또는 염-기반의 농도 구배를 적용해 수행되고;
(d) 단계 (c)의 단백질 A 용출물에 대해 바이러스 불활화를 pH 범위 2.00 내지 4.00 및 전도도 >0.5 mS/cm에서 배치, 유사-연속 방식 -연속 방식 또는 연속 방식으로 수행하는 단계;
(e) 단계 (d)에서 수득한 바이러스 불활화된 이후의 액체 산출물에 대해, 공정 및 생산-관련 불순물을 분리하기 위해 양이온 교환 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
여기서, 음이온 교환 크로마토그래피는 공정-관련 불순물을 분리하기 위해 유동-관통 방식 (flow-through mode)으로 pH 6.50 내지 8.50 및 전도도 >0.5 mS/cm에서 수행되고,
양이온 교환 크로마토그래피는 pH 4.00 내지 7.00 및 전도도 >0.5 mS/cm에서 생산-관련 불순물을 분리하기 위해 결합 및 용출 방식으로 수행되고;
(f) 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피 산출물을 제2 단일-통과 접선 유동 여과 (SPTFF II) 시스템 또는 제2 인-라인 농축기 (ILC II)를 이용해 농축해, 농축물 (retentate)을 수득하는 단계; 및
(g) 단계 (f)의 농축물에 대해 바이러스 여과를 수행하여 정제된 단일클론 항체를 수득하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 선별되는 mAb 생산물은 배치, 피드-배치 또는 연속 세포 배양 공정을 이용해 생산된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 선별되는 mAb 생산물은 연속 세포 배양 공정으로 생산된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 수확물은 CHO 수확물이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 연속 하류 공정은 배치 공정 대비 생산성의 5x 증가를 보이는 제조 공정의 일환이다 (여기서 x는 배치 공정의 생산성이다).
본 발명의 다른 구현예에서, 대상 단백질은 단일클론 항체이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단일클론 항체는 IgG이다.
본 발명은 다른 이점 및 특징을 가지며, 이는 첨부된 도면과 연계하여 숙독하였을 경우 본 발명의 하기 상세한 설명 및 첨부된 청구항으로부터 더 쉽게 명확해질 것이다.
도 1: 단일클론 항체, 특히 IgG를 배치, 통합된-연속 또는 유사-연속 방식으로 정제하기 위한 방법을 도시한다.
도 2: AEX 여과 (B] 여과 산물출)하기 전 mAb 용액을 함유한 A] CHO 수확물에 대해 측정한 입자 크기 분포를 도시한다.
도 3: ILC/SPTFF를 이용해 수행한 5X, 10X 및 15X 농축 실험에서의 물질 균형 (mass balance) 및 수율 결과 (recovery values)를 도시한다.
도 4: ILC 또는 SPTFF를 이용해 수득한, 농축 효과와 관련한 탁도 계측 변화 (turbid metric change)를 도시한다.
도 5: MabSelect SuRe™ LX,MabSelect SuRe™ pcc, MabSelect™ PrismA, POROS® 20A, Praesto® Jetted A50 단백질 A 친화성 수지에 대한 6분 체류 시간에서의 파과 곡선 (breakthrough curve)을 도시한다.
도 6: 항체 용액을 연속 포획하기 위한 사이클 3회의 재현성을 도시한다.
도 7: 1X 공급 농도에 대한 4회 사이클 연속 단백질 A 크로마토그래피 실험을 도시한다.
도 8: 5X 공급 농도에 대한 4회 사이클 연속 단백질 A 크로마토그래피 실험을 도시한다.
도 9: 15X 공급 농도에 대한 4회 사이클 연속 단백질 A 크로마토그래피 실험을 도시한다.
도 10: Q Sepharose® 패스트 플로우에서의 음이온 교환 실험의 크로마토그램을 도시한다.
도 11: Fractogel® SO3 -(M) 수지를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피의 크로마토그램을 도시한다.
도 12: 다양한 공정 산출물에서 단일클론 항체를 정량적으로 추정하기 위한 분석용 단백질 A 크로마토그램을 도시한다.
도 13: 단일클론 항체 생산물의 응집물 및 분획을 분석하기 위한 분석용 크기 배제 크로마토그램을 도시한다.
도 14: 단일클론 항체 생산물의 전하 변이체 (charge variant)를 분석하기 위한 분석용 양이온 교환 크로마토그램을 도시한다.
도 15: MALDI-TOF 분석을 이용해 정제한 단일클론 항체에 대한 완전 질량 분석 (intact mass analysis)을 도시한다.
도 16: 개발된 정제 공정을 이용하여 정제한 단일클론 항체에 대한 far CD 분광분석을 도시한다.
본 발명은 특정 구현예를 참조하여 기술되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 범위로부터 이탈하지 않으면서 다양한 변화가 이루어질 수 있으며 균등물로 치환될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 특정한 상황 또는 물질을 본 발명의 교시 내용에 맞게 적응하기 위해 본 발명의 범위로부터 이탈하지 않으면서 여러가지 수정들이 행해질 수 있다.
본 명세서와 청구항 전체에 걸쳐, 하기 용어들은 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않은 한 본원에 명확하게 연관된 의미를 가진다. 관사 ("a", "an", 및 "the")의 의미는 복수의 참조를 포함한다. "에서 (in)"의 의미는 "내" 및 "상"을 포함한다. 도면을 참조하여 도면 전체에서 비슷한 숫자는 유사한 부분을 지칭한다. 아울러, 단수형에 대한 언급은 달리 언급되지 않은 한 또는 본원의 개시 내용과 불일치하지 않은 한 복수의 언급을 포함한다.
표, 도면 및 프로토콜은, 적절한 경우, 본원의 기술 내용이 본원의 기술 내용의 이점을 가진 당해 기술 분야의 당업자에게 쉽게 자명할 상세 내용에 의해 모호해지지 않도록 본 발명의 구현예를 이해하는데 적합한 구체적인 상세 내용만 나타내는, 도면에서 통례적인 표현으로 표시된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "VCF 값은"은 본 발명의 맥락에서 사용되는 경우, 부피 농축 인수 (volumetric concentration factor), 즉 공급 스트림이 초기 부피 대비 부피 감소된 정도를 지칭한다.
이에, 본 발명의 과제를 달성하기 위해, 본 발명은 대상 단백질을 배치, 통합-연속 또는 유사-연속 방식으로 정제하는 방법을 제시한다.
본 발명의 일 구현예에서, 하기 단계를 포함하는, 도 1에 도시된, 대상 단백질을 배치, 통합된 연속 또는 유사-연속 방식으로 정제하는 공정을 제공한다:
(a) 단일클론 항체를 함유한 수확물을 AEX 하이브리드 필터 (멤브레인과 통합된 음이온 교환 기능)로 여과하여, 수확물을 청징 처리하고, 탁도, HCP 및 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 상류 공정 중에 생성된 공정-관련 불순물을 제거하는 단계;
(b) AEX 하이브리드 필터 산출물을 제1 단일-통과 접선 유동 여과 (SPTFF) 시스템 또는 제1 인-라인 농축기 (ILC)를 사용해 농축하여, 농축된 단일클론 항체 용액을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)의 농축된 단일클론 항체에 대해 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계로서. 이러한 크로마토그래피 공정은
(i) 단계 (b)의 농축된 단일클론 항체 용액을 pH 6.00 내지 9.50 범위 및 전도도 >1 mS/cm에서 친화성 크로마토그래피 수지에 주입하여, 단일클론 항체는 포획하고 공정 및 생산-관련 불순물은 제거하고,
(ii) 포획된 단일클론 항체를 pH 범위 2.00 내지 5.00 및 전도도 >0.5 mS/cm의 용출 완충제로 용출하는 것을 포함하고,
단계 (i)에서 친화성 크로마토그래피 수지에의 주입은 관류 용량 >0.1%로 수행되고,
친화성 크로마토그래피 정제 단계 (i)에서 사용되는 크로마토그래피 컬럼의 개수는 1개 이상이고,
친화성 크로마토그래피에서 용출은 pH 범위 2.00 내지 5.00 또는 염-기반의 농도 구배를 적용해 수행되고,
(d) 단계 (c)의 단백질 A 용출물에 대해 바이러스 불활화를 pH 범위 2.00 내지 4.00 및 전도도 >0.5 mS/cm에서 배치, 유사-연속 방식 -연속 방식 또는 연속 방식으로 수행하는 단계;
(e) 단계 (d)에서 수득한 바이러스 불활화된 이후의 액체 산출물에 대해, 공정 및 생산-관련 불순물을 분리하기 위해 양이온 교환 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계,
여기서, 음이온 교환 크로마토그래피는 공정-관련 불순물을 분리하기 위해 유동-관통 방식으로 pH 6.50 내지 8.50 및 전도도 >0.5 mS/cm에서 수행되고,
양이온 교환 크로마토그래피는 생산-관련 불순물을 분리하기 위해 결합 및 용출 방식으로 pH 4.00 내지 7.00 및 전도도 >0.5 mS/cm에서 수행되고,
(f) 단계 (e)의 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피 산출물을 제2 단일-통과 접선 유동 여과 (SPTFF II) 시스템 또는 제2 인-라인 농축기 (ILC II)를 이용해 농축해, 농축물을 수득하는 단계; 및
(g) 단계 (f)의 농축물에 대해 바이러스 여과를 수행하여 정제된 단일클론 항체를 수득하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 수확물은 CHO 수확물이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 대상 단백질은 단일클론 항체이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 단일클론 항체를 배치, 통합된 연속 또는 유사-연속 방식으로 정제하는 공정은 친화성 크로마토그래피에 대해 전도도 >0.5 mS/cm 및 pH 범위 6.00 내지 9.50에서 수행되는 AEX-여과 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, AEX-하이브리드 여과 유닛이 1개보다 많을 경우, 이들 유닛은 연속 방식으로 AEX 하이브리드 여과 조작을 용이하기 위해 적절한 압력 또는 시간 또는 체적 또는 단백질 농도 기반의 흐름 및 흐름 경로 제어기와 병렬로 또는 직렬로 연결된다.
본 발명의 추가적인 구현예에서, AFX-여과 단계를 이용해 달성되는 HCP 및 HC-DNA 로그 감소는 0.5 이상이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, AEX-여과 산출물의 탁도는 10.0 NTU 이하이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 단일-통과 접선 유동 여과 (SPTFF) 또는 인-라인 농축기 (ILC)가 1개보다 많을 경우, 이는 SPTFF/ILC 조작을 연속 방식으로 이행하기 위해 적절한 압력 또는 시간 또는 체적 또는 단백질 농도 기반의 흐름 및 흐름 경로 제어기와 병렬로 또는 직렬로 연결된다.
본 발명의 추가적인 구현예에서, 단일-통과 접선 유동 여과 (SPTFF) 또는 인-라인 농축기 (ILC)는 친화성 크로마토그래피에 대해 전도도 >0.5 mS/cm 및 pH 범위 6.00 내지 9.50에서 수행된다.
본 발명의 일 구현예에서, 단일 통과 접선 유동 여과 (SPTFF) 또는 인-라인 농축기 (ILC) 유닛을 이용해 달성되는 부피 농축 인수 (VCF)는 1.1X 이상이며, 여기서 X는 공급물의 초기 단백질 농도이다. 5X, 10X 및 15X 농축 실험에서 VCF 값은 ILC/SPTFF를 이용해 결정하였으며, 1.1X 이상인 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 다른 구현예에서, AEX-하이브리드 여과 및 SPTFF 또는 ILC 유닛은 1회 또는 수회 사용된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, ILC/SPTFF 산출물에서 단일클론 항체 농도는 수확물에서의 단일클론 항체 농도와 비교해 항상 더 높다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, SPTFF 또는 ILC 시스템의 공급 유입구는 AEX 하이브리드 필터의 유출구와 연결되고, SPTFF 또는 ILC 시스템의 농축물 유출구는 단백질 A 친화성 크로마토그래피와 연결된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단백질 A 기반의 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피에서 체류 시간은 15초보다 길다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 단백질 A 기반의 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피는 축류 (axial flow) 또는 방사류 (radial flow) 크로마토그래피 컬럼을 이용해 수행된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 단백질 A 기반의 친화성 크로마토그래피는 천연 폴리머 비드 기반의 또는 합성 폴리머 비드 기반의, 멤브레인 기반의, 하이드로겔 기반의 또는 섬유 기반의 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정된 단백질 A 리간드를 이용해 수행된다.
본 발명의 추가적인 구현예에서, 단백질 A 기반의 친화성 크로마토그래피 매트릭스는 MabSelect SuRe™, MabSelect SuRe™ LX, MabSelect SuRe™ pcc, MabSelect™ PrismA, Fibro PrismA, Praesto® Jetted A50, Amsphere™ A3, TOYOPEARL®, AF-rProtein A HC-650F, KANEKA KanCapA™, KANEKA KanCapA™ 3G, Eshmuno® A, Praesto® AP 및 MabSpeed™ rP202로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 비드 기반의, 멤브레인 기반의, 하이드로겔 기반의 또는 섬유 기반의 크로마토그래피 매트릭스에 연결된, 다이에틸아미노에틸, 4급 암모늄, 및 폴리에틸렌이민, 트리메틸암모늄에틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온 교환 관능기를 이용해 수행된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 DEAE Sepharose® Fast Flow, Q Sepharose® Fast Flow, SOURCE™ 15Q, SOURCE™ 30Q, Fractogel® EMD DEAE, POROS® 50 HQ, Nuvia™ Q, Capto™ ImpRes Q, CaptoTM Q, Capto™ DEAE, Fractogel® EMD TMAE, Fractogel® EMD DMAE, Natrix® Q, Sartobind® Q 및 Mustang® Q로 이루어진 군으로부터 선택되는 수지 또는 멤브레인을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 단일한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통해 통과하는 단일클론 항체 생산물의 총 양은 수지 L 당 30 g/L 이상이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 비드 기반의, 멤브레인 기반의, 하이드로겔 기반의 및 섬유 기반의 크로마토그래피 매트릭스에 연결된, 설포네이트 기, 설포프로필 기 및 설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온 교환 관능기를 이용해 수행된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 Fractogel® EMD SO3 -(M), Capto™ SP ImpRes, POROS® XS, Nuvia™ S, SOURCE™ 15S, SOURCE™ 30S, SP Sepharose® Fast Flow, Natrix® HD-Sb, Sartobind® S 및 Mustang® S로 이루어진 군으로부터 선택되는 수지 또는 멤브레인을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피에서 농도구배 용출은 염 농도구배 및/또는 pH 구배를 이용해 달성된다.
본 발명의 일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 단일클론 항체에 대한 다이나믹 결합 용량이 수지 L 당 10 g/L보다 높다.
본 발명의 다른 구현예에서, 정제된 항체 약물 물질은 용해성 응집물을 0.3% 이하로 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 정제된 항체 약물 물질은 최종 약물 물질에 HCP를 100 ppm 이하로 함유한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 정제된 항체 약물 물질은 최종 약물 물질에 DNA를 10 ng/mL 이하로 함유한다.
본 발명의 일 구현예에서, 선별되는 mAb 생산물은 배치, 피드-배치 또는 연속 세포 배양 공정을 이용해 생산된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 선별되는 mAb 생산물은 연속 세포 배양 공정으로 생산된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 선별되는 mAb 생산물은 IgG이다.
본 발명의 추가적인 구현예에서, 연속적인 하류 공정은 생산성이 배치 공정에 비해 5X 높은 제조 공정의 일부이다 (여기서, x는 배치 공정의 생산성임).
본 발명의 바람직한 구현예에서, 공정은 단백질 수율 30 g/L/h를 달성한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 15X까지 VCF 개선 효과는 더 높은 생산 값을 달성하기 위해 25X로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 공정의 물질 균형은 >100%이고, 정제된 mAb의 수율은 >90%이고, 초기 농도와 관련 없다.
실시예
바람직한 구현예를 포함하는 하기 실시예들이 본 발명의 실시를 예시하기 위해 제공될 것이며, 제시된 구체적인 사항들은 예를 든 것으로 본 발명의 바람직한 구현예를 예시하기 위한 목적인 것으로 이해된다.
실시예 1: AEX 하이브리드 여과
단일클론 항체를 함유한 수확물을 AEX 필터 (멤브레인과 통합된 음이온 교환 기능)를 이용해 여과하여 수확물을 청징 처리하고, 상류 공정 중에 생성된 공정-관련 불순물 (탁도, HCP 및 DNA)을 제거하였다. 150.0 mM NaCl을 함유한 pH 7.40 ± 0.20의 20.0 mM 소듐 포스페이트 완충제를 필터 평형화에 이용하였으며, IgG 함유 수확물을 AEX (멤브레인과 통합된 음이온 교환 기능) 하이브리드 필터를 통해 플럭스 222.0 LMH 및 처리율 250.0 L/m2로 여과하였다. 표 1은 수확물을 AEX 하이브리드 여과를 통해 수득한 숙주 세포 단백질 및 DNA 불순물의 결과를 열거한다. 도 2는 동적 광 산란 측정에 따른 AEX-하이브리드 여과를 이용한 염색질 불순물의 제거를 도시한다.
표 1: AEX 필터 산출물의 숙주 세포 단백질 및 DNA 불순물 수준
샘플 탁도 HCDNA (ng/mL) HCP (ng/mL) HC-DNA log 감소 HCP log 감소
AEX - 하이브리드 필터 산출물 1.88 ± 0.5 697.54 373986.26 1.02 0.09
실시예 2: 단일 통과 접선 유동 여과 또는 인-라인 농축
단일클론 항체 용액을 함유한 AEX-필터 산출물의 인-라인 농축을 Cadence TM 인-라인 농축기를 이용해 수행하였다. 수확물의 공급 압력 및 유입구 유량을 적정하여 mAb의 원하는 농도 (5X, 10X 또는 15X)를 달성하였다. 플럭스 32 LMH 및 처리율 272.32 L/m2로 운영하였다. 150.0 mM NaCl을 함유한 pH 7.40 ± 0.20의 20.0 mM 소듐 포스페이트 완충제를 단일-통과 접선 유동 여과 조작을 위한 평형 완충제로 이용하였다. 도 3은 5X, 10X 및 15X 농축 실험에서 수득한 mAb의 회수율 및 물질 균형을 도시한다. 도 4는 ILC/SSPTFF를 이용하여 AEX-필터 산출물의 농축 후 탁도 변화 (turbidimetric change) 연관성을 도시한다.
실시예 3: 다양한 단백질 A 친화성 수지 실험에 대한 파과 곡선 측정
파과 곡선 (breakthrough curve)을 측정하기 위해, 컬럼 산출물 내 단일클론 항체 용액의 농도가 공급물의 초기 mAb 농도와 일치할 때까지 단백질 A 친화성 수지에 과다 주입하였다. 친화성 수지를 150 mM NaCl을 함유한 pH 7.40 ± 0.20의 20 mM 소듐 포스페이트 완충제로 평형화하였다. 농축된 단일클론 항체 용액 (인-라인 농축기 산출물)을 단백질 A 친화성 수지에 2분 체류 시간으로 주입하였다. 주입한 후 컬럼을 150 mM NaCl을 함유하는 pH 7.40 ± 0.20의 20 mM 소듐 포스페이트 완충제 및 100 mM 글리신 HCl, pH 3.00 ± 0.20로 각각 세척 및 용출시켰다. 6분 체류 시간으로 MabSelect SuRe™ LX 단백질 A 친화성 수지, MabSelect SuRe™ PCC 단백질 A 친화성 수지, MabSelect SuRe™ PrismA 단백질 A 친화성 수지, Praesto® Jetted A50 단백질 A 친화성 수지, POROS™ 20 A 단백질 A에 대한 파과 곡선을 6분 체류 시간에 측정하였다.
실시예 4: mAb의 포획 단계 정제를 위한 트윈 컬럼 단백질 친화성 크로마토그래피
MabSelect™ PrismA 수지를 이용해 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 친화성 크로마토그래피는 ChromaCon AG 사의 Contichrom® CUBE+를 이용해 트윈 컬럼 크로마토그래피 시스템으로 수행하였다. 농축된 단일클론 항체 용액 (SPTFF/ILC 산출물)을 공급 물질로 이용하였다. 농축된 물질로부터 IgG를 포획하기 위한 실험을 평형 완충제로서 150 mM NaCl을 함유한 pH 7.40 ± 0.20의 20 mM 소듐 포스페이트, 세척 완충제로서 500 mM NaCl을 함유한 pH 7.40 ± 0.20의 20 mM 소듐 포스페이트, 용출 완충제로서 100 mM 글리신 HCl, pH 3.00 ± 0.20, 스트립 완충제로서 100 mM 글리신 HCl, pH 2.00 ± 0.20을 이용해 수행하였으며, 0.1 M NaOH를 수지 클리닝에 이용하였다. 용출은 단계적 pH 구배를 이용해 수행하였다. 모든 공정 단계는 2-분 체류 시간으로 수행하였다. 도 5는 6분 체류 시점에 MabSelect SuRe™ LX,MabSelect SuRe™ pcc, MabSelect™ PrismA, POROS® 20A, Praesto® Jetted A50 단백질 A 친화성 수지에 대한 파과 곡선을 도시한다.
단백질 A 친화성 수지의 이용성을 높이기 위해, 다양한 파과 곡선에서 로딩 용량 %을 구하였다. 표 2는 단백질 A 친화성 포획 단계의 생산성; 수율 및 물질 균형에 대한 여러가지 파과 곡선 %의 영향을 나타낸다. 생산성은 파과 곡선 % 증가에 따라 증가하는 것으로 입증되었다. 도 6은 항체 용액을 연속 포획하기 위한 사이클 3회 운영의 재현성을 보여준다.
표 2: 포획 단계의 생산성, 수율 및 물질 균형에 대해 미치는 여러가지 파과 곡선 %의 영향
매개변수 단위 60% BTC 70% BTC 80% BTC
수율 [%] 95.2 104.9 104.9
물질 균형 [%] 96.2 104.9 106.3
생산성 [g/L/h] 11.87 11.53 12.39
포획 공정의 생산성에 미치는 세포 배양물 역가의 영향:
도 7 내지 도 9는 ILC/SPTFF를 이용해 수득한 1X, 5X, 15X 공급물 역가에서 연속 포획 운영한 크로마토그램을 보여준다. 연속 포획 공정의 생산성은 표 3에 나타낸 바와 같이 공급물 역가 증가에 따라 증가하였다. 표 4는 SPTFF/ILC 및 단백질 A 친화성 크로마토그래피 산출물에서의 불순물의 함량을 보여준다.
표 3: 공급물 역가가 포획 단계의 생산성, 수율 및 물질 균형에 미치는 영향
매개변수 단위 ILC 비-포함 5X 10X 15X
수율 [%] 104.9 93.3 104.3 93.7
물질 균형 [%] 106.3 105.8 105.8 94.1
생산성 [g/L/h] 12.39 20.07 26.65 25.59
표 4: 인-라인 농축 및 친화성 크로마토그래피 산출물의 불순물 함량
샘플 HCDNA (ng/mL) HCP (ppm) HC-DNA log 감소 HCP log 감소
인-라인 농축 (ILC) 산출물 10723.97 150633.95 해당사항 없음 0.46
친화성 크로마토그래피 산출물 393.79 142.47 1.44 3.02
실시예 5: 다양한 공정 관련 불순물에 대한 음이온 교환 크로마토그래피
음이온 교환 크로마토그래피를 도 10의 크로마토그램에 나타낸 바와 같이 DEAE Sepharose® Fast Flow 및 Q Sepharose® Fast Flow 수지를 사용해 수행하였다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 산출물인 단일클론 항체 용액을 공급원으로 이용하였다. 음이온 교환 실험은 평형 완충제로서 5 CV, 20 mM Tris, pH 7.50 ± 0.20를, 세척 완충제로서 5 CV, 20 mM Tris, pH 7.50 ± 0.20을, 용출 완충제로서 5 CV, 20 mM Tris + 1 M NaCl, pH 7.50 ± 0.20을 이용해 수행하였으며, 4 CV, 0.5 M NaOH를 수지 클리닝에 사용하였다. 용출은 단계적인 염 농도 구배를 이용해 수행하였다. 모든 공정 단계는 6-분 체류 시간으로 수행하였다. 또한, 음이온 교환 크로마토그래피는 도 10에 나타낸 바와 같이 Q Sepharose® Fast Flow 수지를 이용해 pH 7.00 ± 0.20에서 수행하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 HCP 및 HCDNA가 제거되었다.
표 5: 음이온 교환 크로마토그래피 산출물의 불순물 함량
공정 단계 물질 균형
(%) 		수율
(%) 		HCDNA (ng/mL) HCP (ppm) HC-DNA log 감소 HCP log 감소
음이온 교환 크로마토그래피 산출물 100.31 95.87 54.05 16.31 0.86 0.94
실시예 6: 다양한 생산 관련 불순물을 분리하기 위한 양이온 교환 크로마토그래피
양이온 교환 크로마토그래피를 Fractogel® SO3-(M), POROS® XS 및 Capto™ SP ImpRes 수지를 이용해 수행하였다. 음이온 교환 크로마토그래피의 통과 분획으로서 단일클론 항체 용액을 공급원으로 사용하였다. 양이온 교환 실험은 평형 완충제로서 5 CV, 20 mM 소듐 아세테이트, pH 5.00 ± 0.20을, 세척 완충제로서 3 CV, 20 mM 소듐 아세테이트, pH 5.00 ± 0.20을, 그리고 용출 완충제로서 15 CV, 20 mM 소듐 아세테이트 + 1 M NaCl, pH 5.00 ± 0.20을 이용해 수행하였다. 용출은 용출 완충제 10%에서 100%까지 선형적인 염 농도구배를 적용해 수행하였다. 모든 공정 단계는 5-분 체류 시간으로 수행하였다. 또한, 양이온 교환 크로마토그래피는 Fractogel® SO3-(M) at pH 7.00 ± 0.20을 이용해 수행하였다. 도 11 및 표 6에 나타낸 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 HCP 및 HCDNA가 제거되었다.
표 6: 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피 산출물의 불순물 함량
공정 단계 물질 균형
(%)		 수율 (%) HCDNA (ng/mL) HCP (ppm) HC-DNA log 감소 HCP log 감소
양이온 교환 크로마토그래피 산출물 98.55 76.44 3.03 검출 한계 미만 1.25 해당사항 없음
실시예 7: 다양한 분석 기법을 이용한 단일클론 항체에 대한 분석 특징 규명
i. 단일클론 항체 생산물을 정량하기 위한 단백질 A HPLC 분석
다양한 크로마토그래피 산출물 내 단일클론 항체 생산물의 농도를 Agilent 1200 HPLC 시스템에서 2.1 mm x 30 mm, 입자 크기 20 ㎛ POROSTM A 20 컬럼을 사용해 결정하였다. 이동상은 1X PBS pH 7.2 ± 0.20 (완충제 A) 및 3% GAA pH 2.5 ± 0.20 (완충제 B)로 구성되었다. 유속은 파장 280 nm에서 5분 방법으로 A -> B 농도구배 하에 1 mL/min으로 유지하였다. 다양한 공정 산출물 내 단일클론 항체에 대한 정량적인 추정은 이러한 분석 방법을 이용해 결정하였으며, 도 12에 또한 도시하였다.
ii. 단일클론 항체 생산물에 대한 SEC- HPLC 응집 분석
단일클론 항체 생산물 내 응집물과 단편을 Agilent 1200 HPLC 시스템에서 7.8 mm x 300 mm YARRATM SEC 3000 컬럼, 입자 크기 3 ㎛을 이용해 결정하였다. 이동상은 소듐 포스페이트 완충제 pH 6.5 ± 0.20 (완충제 A)로 구성되었다. 유속은 파장 280 nm에서 등용매 방법 하에 0.75 mL/min으로 유지하였다. 정제한 단일클론 항체 생산물의 고 분자량 불순물 (HMW), 주 피크 및 저 분자량 불순물 (LMW)을 이 방법을 이용해 결정하였으며, 도 13에 또한 도시하였다.
iii. 산출물 단일클론 항체 샘플에 대한 전하 변이체 분석을 위한 CEX HPLC 분석:
단일클론 항체에서 산성 및 염기성 변이체를 코어 입자 5 ㎛의 MAbPacTM SCX-10 컬럼을 이용해 수득하였다. 이동상은 소듐 포스페이트 완충제 pH 6 (완충제 A)와 소듐 포스페이트 완충제 + NaCl pH 6 (완충제 B)으로 구성하였다. 또한, 전하 변이체 분석은 Agilent 1200 HPLC 시스템에서 YMC Biopro 크기 5 ㎛, 4.6*250 mm 컬럼을 사용하고, 이동상 20mM 소듐 아세테이트 (완충제 A) 및 20mM 소듐 아세테이트 + 300mM NaCl (완충제 B)을 적용해 수행하였다. 유속은 파장 220 nm에서 농도구배 방법 하에 0.5 mL/min으로 유지하였다. 정제한 단일클론 항체의 산성, 염기성 변이체 및 주 피크를 이노베이터 단일클론 항체 (innovator monoclonal antibody)와 비교하였으며, 또한 도 14에 도시하였다.
iv. MALDI - TOF 분석을 이용한 정제한 단일클론 항체에 대한 완전 질량 분석
정제한 단일클론 항체 생산물에 대해 완전 질량 분석을 MALD-TOF 분석을 이용해 수행하였다. MALDI-TOF 분석을 수행하기 위해 이노베이터 단일클론 항체와 정제한 단일클론 항체를 시나핀산과 1:1로 혼합하였다. 매트릭스 시나핀산 (20 mg/ml)은 ACN: 정제수: 트리플루오로아세트산 (TFA)(50:50:0.1) 중에 준비하였다. 샘플과 매트릭스의 균질화된 혼합물 1 ㎕를 깨끗한 384 웰 MALDI 플레이트 상에 증착시켰다. 이 플레이트를 AB SCIEX TOF/TOFTM 5800 장치에 넣었다. 이 장치는 파지티브 이온 선형 모드로 이용하였다. 337 nm 방사선의 질소 레이저를 이온화 소스로 유지하였다. MALDI-TOF 범위는 10KDa 내지 400 KDa였으며, 레이저 강도 5000 내지 6000을 도 15에 도시된 샘플 분석에 적용하였다. BSA를 양성 대조군으로 사용하였다. Data Explorer 소프트웨어를 사용해 결과를 분석하였다.
v. CD 분광분석
단백질 샘플에 대한 CD 분광 분석을 위해 JASCO (J-815)를 이용하였다. 모든 샘플은 25℃에서 분석하였다. Far UV CD의 경우 데이터 피치 (data pitch)는 0.025 nm 및 1.00 nm로 설정하고 1 mm 큐벳을 사용해 연속 스캐닝 방식을 적용하였고, Near UV CD의 경우 데이터 피치는 1.00 nm로 설정하고 1 cm 큐벳을 사용해 연속 스캐닝 방식을 적용하였다. 분석에 이용한 샘플은 Far UV CD에서는 0.2 mg/mL, Near UV CD에서는 1.5 mg/mL이었다. Far UV CD 스펙트럼 스캔은 단백질의 2차 구조에 대한 정보를 포함하는 190-240 nm이었다. 이노베이터 및 바이오시밀러 생산물에 대한 Far UV CD 스펙트럼은 유사한 2차 구조를 나타내었다. Near UV CD 스펙트럼 스캔은 240-350 nm였으며, 단백질의 3차 구조에 대한 정보를 포함하였다. 이노베이터 및 바이오시밀러 생산물에 대한 Near UV CD 스펙트럼은 유사한 구조를 표시하였다. 도 16은 단일클론 항체에 대한 Far CD 분광분석 결과를 도시한다.
vi. 단일클론 항체에 대한 숙주 세포 단백질 ( HCP ) 정량화를 위한 ELISA 분석
공정 샘플에 대한 숙주 세포 단백질 분석을 2-부위 면역-효소학적 분석 (Cygnus CHO HCP 3세대 키트 F550)으로 수행하였다. CHO HCP를 함유한 샘플들을, 친화성-정제된 항-CHO 포획 항체가 코팅된 마이크로타이터 스트립에서 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP) 효소-표지된 항-CHO 항체 (염소 다클론)와 동시에 반응시켰다. 면역학적 반응으로 고상 항체 - HCP - 효소 표지된 항체 간의 샌드위치 복합체가 형성되었다. 마이크로타이터 스트립을 헹궈 임의의 미-결합 반응물을 제거하였다. 기질로서 테트라메틸벤지딘 (TMB)을 이후 반응시켰다. 혼성화된 기질의 양을 마이크로타이터 플레이트 리더에서 450 및 650 nm 하에 판독하였으며, 이는 존재하는 CHO HCP 농도에 정비례하였다.
vii. 단일클론 항체의 단백질 A 침출 정량을 위한 ELISA 분석
Mix - N - Go 단백질 A 분석은 2-부위 면역 효소적 분석 (Cygnus Mix - N - Go 단백질 A 분석, F 600, F 610)이다. 단백질 A를 함유한 샘플을 먼저 키트에 제공된 Mix - N - Go 샘플 희석제에 희석하였다. 그 후, Mix - N - Go 변성 완충제를 첨가 및 혼합하여 생산 항체로부터 단백질 A를 용해하였다. 샘플을 다클론 항-단백질 A 포획 항체로 코팅된 마이크로타이터 스트립에서 반응시켰다. 말 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 효소로 직접 표지된 제2 항-단백질 A 항체를 동시에 반응시켜 고상 항체-단백질 A: HRP 표지된 항체로 이루어진 샌드위치 복합체를 형성시켰다. 임의의 미-결합 반응물을 제거하기 위해 세척 단계를 거친 후, 스트립을 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질과 반응시켰다. 가수분해된 기질의 양을 마이크로타이터 플레이트 리더에서 450 nm 및 650 nm에서 판독하였으며, 이는 샘플에 존재하는 단백질 A 농도에 정비례할 것이다.
viii. 피코그린 분석에 의한 숙주 세포 DNA 분석
다양한 공정 샘플에서 DNA의 존재를 Quant- iTTM PicoGreen ds DNA 시약 및 키트 (Invitrogen, Catalog number: P11496)를 사용해 추정하였다. 이중 가닥 람다 DNA를 100 ㎍/mL에서 2 ㎍/mL까지 희석하여 표준 곡선을 작성하였다. 샘플 0.1 mL 및 피코 그린 시약 (200배 희석한 반응물) 0.1 mL을 이용해 공정 샘플을 분석하였다. 반응 혼합물을 5분간 인큐베이션한 다음 형광 분광광도계를 480 nm 및 520 nm 파장에서 사용해 형광을 측정하였다 (여기 파장 480 nm, 방출 파장 520 nm).
실시예 8: 크로마토그래피 컬럼 3종을 이용한 연속적인 단백질 A 포획 단계 친화성 크로마토그래피
MabSelect™ PrismA 수지를 사용해 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 친화성 크로마토그래피는 Novasep 사의 BioSCTM를 이용해 3-컬럼 크로마토그래피 시스템을 이용해 수행하였다. 단일클론 항체 농축 용액 (SPTFF/ILC 산출물)을 공급물로 이용하였다. 농축 물질로부터 연속적인 단백질 A 친화성 크로마토그래피 IgG까지의 실험은 평형 완충제로서 20 mM 소듐 포스페이트 + 150 mM NaCl, pH 7.40 ± 0.20을, 세척 완충제로서 20 mM 소듐 포스페이트 + 500 mM NaCl, pH 7.40 ± 0.20을, 용출 완충제로서 100 mM 글리신-HCl, pH 3.00 ± 0.20을, 스트립 완충제로서 100 mM 글리신 HCl, pH 2.00 ± 0.20을 이용해 수행하였으며, 수지 클리닝에는 0.1 M NaOH를 이용하였다. 용출은 단계적인 pH 구배를 이용해 수행하였다. 모든 공정 단계는 2분 체류 시간으로 수행하였다. 단백질 A 친화성 수지의 공정 생산성 및 이용성을 높이기 위해, 다양한 전체 파과 %에서 부하 용량을 수행하였다. 3-컬럼 연속 친화성 공정에서, 연속적인 단백질 A 포획 단계의 생산성은 아래 표에 나타낸 바와 같이 공급물 역가 증가에 따라 증가하였다. 표 7은 3-컬럼 연속 정제 공정에서 공급물의 농도 증가에 따른 생산성 증가를 보여준다.
표 7: 연속적인 3- 컬럼 단백질 A 포획 단계 정제의 생산성에 대한 공급물의 농도 효과
공급물 농도 (g/L) 생산성 (g/L/h)
1 14.2
10 21.5
발명의 효과
· 본 발명에서와 같은 연속적인 하류 공정 플랫폼의 이용은 완충제 소모 감소를 촉진한다.
· 기존 제조 공정 대비 거의 5배의 생산성 개선이 IgG 하류 공정에 연속적인 크로마토그래피 정제 단계들을 통합함으로써 달성되었다.
· 본 공정에 따라 정제한 수득된 IgG 또는 단일클론 항체는 이노베이터 생산물의 순도 표준에 부합하는 고 순도를 가진다.
· 본 발명에 의해 생산된 IgG 및 단일클론 항체는 이의 치료학적 활성을 유지한다.

Claims (31)

  1. 하기 단계를 포함하는, 단일클론 항체의 정제 공정:
    (a) 단일클론 항체를 함유한 CHO 수확물을 AEX 하이브리드 필터를 이용해 여과하는 단계;
    (b) AEX 하이브리드 필터 산출물을 제1 단일-통과 접선 유동 여과 (single-pass tangential flow filtration; SPTFF) 시스템 또는 제1 인-라인 농축기 (in-line concentrator; ILC)를 사용해 농축하여, 농축된 단일클론 항체 용액을 수득하는 단계;
    (c) 단계 (b)의 농축된 단일클론 항체 용액에 대해 하기를 포함하는 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계로서;
    i. 단계 (b)의 농축된 단일클론 항체 용액을 pH 6.00 내지 9.50 범위 및 전도도 >1 mS/cm에서 친화성 크로마토그래피 수지에 주입하여, 단일클론 항체는 포획하고 공정 및 생산 관련 불순물은 제거하고,
    ii. 포획된 단일클론 항체를 pH 범위 2.00 내지 5.00 및 전도도 >0.5 mS/cm의 용출 완충제로 용출하는 것을 포함하고,
    단계 (i)에서 친화성 크로마토그래피 수지에의 주입은 관류 용량 >0.1%로 수행되고,
    친화성 크로마토그래피 정제 단계 (i)에서 사용되는 크로마토그래피 컬럼의 개수는 1개 이상이고,
    친화성 크로마토그래피에서의 용출이 pH 범위 2.00 내지 5.00 또는 염 기반의 농도구배를 이용해 수행되는, 단계;
    (d) 단계 (c)의 단백질 A 용출물에 대해 바이러스 불활화를 pH 범위 2.00 내지 4.00 및 전도도 >0.5 mS/cm에서 수행하는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 수득한 바이러스 불활화된 이후의 액체 산출물에 대해 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
    (f) 단계 (e)의 이온 교환 크로마토그래피 산출물을 제2 단일-통과 접선 유동 여과 (SPTFF II) 시스템 또는 제2 인-라인 농축기 (ILC II)를 이용해 농축해, 농축물 (retentate)을 수득하는 단계; 및
    (g) 단계 (f)의 농축물에 대해 바이러스 여과를 수행하여 정제된 단일클론 항체를 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 공정이 배치, 통합된 연속 또는 유사-연속 공정을 포함하는, 공정.
  3. 제2항에 있어서, 상기 공정이 연속 공정인, 공정.
  4. 제1항에 있어서, AEX-하이브리드 여과 유닛의 개수가 1개 이상인, 공정.
  5. 제4항에 있어서, 상기 AEX-하이브리드 여과 유닛이 1개보다 많을 경우 AEX 하이브리드 여과 조작을 연속 방식으로 가능하도록 적절한 압력 또는 시간 또는 부피 또는 단백질 농도 기반의 유동 및 유동 경로 제어기와 병렬로 또는 직렬로 연결된, 공정.
  6. 제1항에 있어서, 상기 AEX-여과 단계가 친화성 크로마토그래피에 대해 전도도 >0.5 mS/cm 및 pH 범위 6.00 내지 9.50에서 수행되는, 공정.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단일-통과 접선 유동 여과 (SPTFF) 및 인-라인 농축기 (ILC) 유닛의 개수가 1개 이상인, 공정.
  8. 제7항에 있어서, 단일 통과 접선 유동 여과 (SPTFF) 또는 인-라인 농축기 (ILC)가 1개보다 많을 경우 SPTFF/ILC 조작을 연속 방식으로 가능하도록 적절한 압력 또는 시간 또는 부피 또는 단백질 농도 기반의 유동 및 유동 경로 제어기와 병렬로 또는 직렬로 연결된, 공정.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단일-통과 접선 유동 여과 (SPTFF) 및 인-라인 농축기 (ILC)가 친화성 크로마토그래피에 대해 전도도 >0.5 mS/cm 및 pH 범위 6.00 내지 9.50에서 수행되는, 공정.
  10. 제1항에 있어서, 상기 AEX-하이브리드 여과 및 SPTFF 및/또는 ILC 유닛이 1회 또는 수회 사용되는, 공정.
  11. 제1항에 있어서, SPTFF 및/또는 ILC 시스템 둘다 공급 유입구가 AEX 하이브리드 필터의 유출구와 연결된, 공정.
  12. 제1항에 있어서, SPTFF 및/또는 ILC 시스템 둘다 농축물 유출구가 단백질 A 친화성 크로마토그래피와 연결된, 공정.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단백질 A 기반의 친화성 크로마토그래피가 크로마토그래피 매트릭스에 고정된 단백질 A 리간드를 이용해 수행되는, 공정.
  14. 제13항에 있어서, 상기 단백질 A 기반의 친화성 크로마토그래피가 천연 폴리머 비드 기반의 크로마토그래피 매트릭스 또는 합성 폴리머 비드 기반의 크로마토그래피 매트릭스, 멤브레인 기반의 크로마토그래피 매트릭스, 하이드로겔 기반의 크로마토그래피 매트릭스 또는 섬유 기반의 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정된 단백질 A 리간드를 이용해 수행되는, 공정.
  15. 제14항에 있어서, 상기 크로마토그래피 매트릭스가 MabSelect SuRe™, MabSelect SuRe™ LX, MabSelect SuRe™ pcc, MabSelect™ PrismA, Fibro PrismA, Praesto® Jetted A50, Amsphere™ A3, TOYOPEARL®, AF-r단백질 A HC-650F, KANEKA KanCapA™, KANEKA KanCapA™ 3G, Eshmuno® A, Praesto® AP 및 MabSpeed™ rP202로 이루어진 군으로부터 선택되는, 공정.
  16. 제1항에 있어서, 상기 이온-교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는, 공정.
  17. 제16항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피가 DEAE Sepharose® Fast Flow, Q Sepharose® Fast Flow, SOURCE™ 15Q, SOURCE™ 30Q, Fractogel® EMD DEAE, POROS® 50 HQ, Nuvia™ Q, Capto™ ImpRes Q. CaptoTM Q, Capto™ DEAE, Fractogel® EMD TMAE, Fractogel® EMD DMAE, Natrix® Q, Sartobind® Q 및 Mustang® Q로 이루어진 군으로부터 선택되는 수지 또는 멤브레인을 포함하는, 공정.
  18. 제16항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피가 pH 6.50 내지 8.50 및 전도도 >0.5 mS/cm에서 공정 관련 불순물을 분리하기 위해 유동-관통 방식으로 수행되는, 공정.
  19. 제18항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피가 비드 기반의 크로마토그래피 매트릭스, 멤브레인 기반의 크로마토그래피 매트릭스, 하이드로겔 기반의 크로마토그래피 매트릭스 또는 섬유 기반의 크로마토그래피 매트릭스에 연결된, 다이에틸아미노에틸, 4급 암모늄, 폴리에틸렌이민 및 트리메틸암모늄에틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온 교환 관능기를 이용해 수행되는, 공정.
  20. 제16항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피가 Fractogel® EMD SO3-(M), Capto™ SP ImpRes, POROS® XS, Nuvia™ S, SOURCE™ 15S, SOURCE™ 30S, SP Sepharose® Fast Flow, Natrix® HD-Sb, Sartobind® S 및 Mustang® S로 이루어진 군으로부터 선택되는 수지 또는 멤브레인을 포함하는, 공정.
  21. 제20항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피가 pH 4.00 내지 7.00 및 전도도 >0.5 mS/cm에서 공정 관련 불순물을 분리하기 위해 결합 및 용출 방식으로 수행되는, 공정.
  22. 제21항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피가 비드 기반의 크로마토그래피 매트릭스, 멤브레인 기반의 크로마토그래피 매트릭스, 하이드로겔 기반의 크로마토그래피 매트릭스 및 섬유 기반의 크로마토그래피 매트릭스에 연결된, 설포네이트 기, 설포프로필 기 및 설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온 교환 관능기를 이용해 수행되는, 공정.
  23. 제1항에 있어서, 상기 단백질 A 기반의 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피가 축류 또는 방사류 크로마토그래피 컬럼을 이용해 수행되는, 공정.
  24. 제23항에 있어서, 상기 방사류 크로마토그래피 컬럼이 축류 또는 방사류 크로마토그래피 컬럼으로부터 선택되는, 공정.
  25. 제1항에 있어서, 상기 단백질 A 기반의 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피에 대한 체류 시간이 15초보다 긴, 공정.
  26. 제3항에 있어서, 상기 연속 공정이 여러가지 농도의 단일클론 항체에 대한 부피 농축 인수 (VCF) 값이 적어도 1.1X이고, X가 공급물의 초기 농도인, 공정.
  27. 제3항에 있어서, 상기 공정이 단일클론 항체를 수율 25.59 g/L/h로 생산하는, 공정.
  28. 제3항에 있어서, 상기 정제된 단일클론 항체가 용해성 응집물을 0.3% 이하로 함유하는, 공정.
  29. 제3항에 있어서, 상기 정제된 단일클론 항체가 HCP를 100 ppm 이하로 함유하는, 공정.
  30. 제3항에 있어서, 상기 정제된 단일클론 항체가 DNA를 10 ng/mL 이하로 함유하는, 공정.
  31. 제3항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 IgG인, 공정.
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