CN112569192A - 一种具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法，该方法包括将破壁率为90‑92％的灵芝孢子粉，通过CO2超临界萃取工艺提取灵芝孢子油得到脱脂后灵芝孢子粉，将脱脂灵芝孢子粉与番茄红素油树脂以1‑2：1‑2的重量比例进行混合喷雾造粒。本发明方法制备得到的颗粒产品中有效成分含量高，番茄红素含量＞6％，多糖含量＞0.8％，且稳定性好，具有高效的抗氧化功效。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法。
背景技术
番茄红素是一种功能性食用天然色素，属于重要的类胡萝卜素，广泛存在于水果和蔬菜中，尤其番茄中含量最高。番茄红素是由11个共轭碳-碳双键组成的直链碳氢化合物，分子式C40H56，结晶纯品呈深红色。番茄红素在人类身体各个器官、组织中广泛分布，以顺式构型存在，顺式构型与反式构型可以根据环境的不同而相互转化。但几乎所有来源于天然植物中的番茄红素都是反式构型，此构型最耐热。
氧化应激损伤是指机体在遭受有害刺激时，体内活性氧自由基和活性氮自由基产生过多，或清除氧化自由基的酶系统功能减弱而导致的组织损伤。氧化应激损伤是导致人类皮肤衰老的重要因素，其对细胞组织造成伤害，可以导致机体功能蜕化，也是造成心脑血管疾病中神经损伤的主要因素。适当地补充抗氧化剂可以缓解机体地氧化应激损伤。近年来，大部分对于抗氧化的新药物研究开始聚焦于日常膳食中可提取的天然产物上，因为这些产物副作用小。天然抗氧化剂一直是冠心病、高血脂、糖尿病、神经退行性病变等多种中老年慢性疾病预防药物与保健行业地研究热点。
番茄红素的抗氧化作用主要表现在它能淬灭单线态氧和清除自由基，其清除单线态氧的速率常数是抗氧化剂维生素E的100倍，是β-胡萝卜素的2倍多，在防治前列腺癌、肺癌、调节机体免疫等方面具有重要生理功能，已成为国际上功能食品成分研究的一个关注热点。次氯酸可通过修饰蛋白、脱氧核糖核酸、核糖核酸导致心血管疾病中的组织氧化，而番茄红素具有清除次氯酸的作用，可减轻次氯酸引起的机体损伤。动物实验以及人群研究均表明番茄红素对神经系统有保护作用，番茄红素可以通过抑制相关炎症通路以减轻炎症因子的表达，降低体内炎症水平，并抑制凋亡通路，减少神经细胞缺失与凋亡，提高神经细胞抗氧化能力、抑制活性氧的产生，发挥神经保护作用。番茄红素与其他物质联合使用可增强其抗氧化作用，其临床使用前景光明。
由于番茄红素含有大量不饱和结构，在光、热和氧的作用下极易被氧化降解，在加工储藏过程中容易发生降解和异构化，导致生理活性降低，且番茄红素是一种脂溶性的类胡萝卜素，在水中是不溶解的，这些特性都大大限制了它的推广和应用。目前，番茄红素的原料主要有两种，即溶于脂溶性溶剂中的半流体状的原料(油树脂)及颗粒状包埋型固体原料。大分子包埋后的颗粒状包埋型原料在稳定性方面有较大的优势，服用后也不会受到胃液中强酸的破坏，使其生物利用度有所提高。
目前，番茄红素产品涵盖了医药、保健和化妆品等领域，有以番茄红素为主剂的多种针剂类药物，应用于防紫外线灼伤、清除色斑、保护皮肤以及癌症的辅助治疗；有以番茄红素为主成分的各类保健品，主要用于抗氧化、延缓衰老、增强免疫力，调血脂以及防癌抗癌；有以番茄红素为补充剂，添加到果酱、肉制品、乳制品及饮料中；有以番茄红素为防腐剂，添加到食用油中，防止油脂的氧化酸败变质，延长了油脂保质期。
目前含番茄红素的制剂目前主要是软胶囊剂，系将番茄红素油树脂与大豆油、红花籽油等食用油混合、灌装软胶囊。但该剂型的番茄红素产品其稳定性较差。包埋工艺也广泛应用于番茄红素产品中，包括硬胶囊、颗粒剂等，但采用了较多辅料，有效成分含量较低，一般不超过3％。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法。通过该方法得到的含番茄红素颗粒，其有效成分含量高，制备方便，稳定性高。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法，包括以下步骤：
取破壁率为90-92％的灵芝孢子粉，通过CO2超临界萃取工艺提取灵芝孢子油得到脱脂后灵芝孢子粉，将脱脂后的灵芝孢子粉与番茄红素油树脂按照1-2：1-2的重量比例混合喷雾造粒。
上述灵芝孢子粉为赤灵芝喷发的灵芝孢子粉。脱脂灵芝孢子粉在600倍显微镜下仍可看到完整的灵芝孢子形状。
上述CO2超临界萃取工艺为：萃取温度为35～36℃，萃取压力为25～28Mpa，萃取时间为6～7小时，CO2流量为400～600L/h，每次装样量为38kg。
优选CO2超临界萃取工艺为：萃取温度为35℃，萃取压力为25Mpa，萃取时间为7小时，CO2流量为500L/h。
上述混合方式为：将番茄红素油树脂与少许无水乙醇混合得到番茄红素油树脂醇化物，增加其流动性。将脱脂灵芝孢子粉放入流化床制粒机，在流化床制粒机中，通过压缩空气将番茄红素油树脂醇化物由喷嘴雾化并喷至流化床层上正处于流化状态的破壁灵芝孢子粉上，使之润湿并充分混合，流动造粒。
喷雾造粒采用的条件为：喷嘴雾化速度40～100mL/min，雾化粒径10-12μm，流化床一次装样量为8-10kg。优选喷嘴雾化速度为100mL/min，雾化粒径为10μm，流化床一次装样量为8kg，流动造粒。该条件能够充分混匀，造粒后将制备的颗粒置阴凉干燥处阴干。
优选上述脱脂灵芝孢子粉与番茄红素油树脂的混合重量比例为1：1。
以该比例混合，可最大限量提升番茄红素含量，且颗粒均匀。
与现有技术比较，本发明的有益效果：本发明方法制备得到的颗粒产品中有效成分含量高，番茄红素含量＞6％，多糖含量＞0.8％，且稳定性好，具有高效的抗氧化功效。
附图说明
图1为本发明实施例番茄红素颗粒对AAPH引起BSA氧化降解的保护作用图。
图2为实施例番茄红素颗粒对U87细胞氧化损伤的保护作用图。
其中，L.番茄红素颗粒；Q.槲皮素；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01与对照组相比；#P＜0.05，##P＜0.01与损伤组相比。
图3为实施例番茄红素颗粒对8-OH-dG含量的影响图。
其中，CK.对照组；H.H2O2处理组；H+L1.1μmol·L-1番茄红素颗粒保护组；H+L 5.5μmol·L-1番茄红素颗粒保护组；H+L10.10μmol·L-1番茄红素颗粒保护组；H+Q5.5μmol·L-1槲皮素保护组。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释说明：其中，番茄红素油树脂购自晨光生物科技集团股份有限公司，为深红色液体油状物，其番茄红素含量大于12％。
实施例1
取破壁率为90-92％的灵芝孢子粉，采用CO2超临界萃取工艺提取灵芝孢子油得到脱脂后灵芝孢子粉，CO2超临界萃取工艺为：萃取温度为35℃，萃取压力为25Mpa，萃取时间为7小时，CO2流量为500L/h，每次装样量为38kg。脱脂灵芝孢子粉在600倍显微镜下仍可看到完整的灵芝孢子形状。以1：1的重量比例取脱脂灵芝孢子粉与番茄红素油树脂。
先将脱脂灵芝孢子粉放入流化床制粒机中，将番茄红素油树脂与少许无水乙醇混合后，通过压缩空气，将与乙醇混合后的番茄红素油树脂由喷嘴雾化并喷至流化床层上正处于流化状态的破壁灵芝孢子粉上，使之润湿并充分混合、流动造粒，其中，喷嘴雾化速度为100mL/min，雾化粒径为10μm，流化床一次装样量为8kg；制备的颗粒置阴凉干燥处阴干。
平行做三批样品，所得产品中番茄红素的含量分别为8.36％、8.29％、8.28％，多糖的含量分别为1.23％、1.25％、1.22。分别为1#、2#、3#产品(以下称番茄红素颗粒)。
对比例1
取破壁率为90-92％的灵芝孢子粉，采用CO2超临界萃取工艺提取灵芝孢子油得到脱脂后灵芝孢子粉，CO2超临界萃取工艺为：萃取温度为35℃，萃取压力为25Mpa，萃取时间7小时，CO2流量为500L/h，每次装样量为38kg。脱脂灵芝孢子粉在600倍显微镜下仍可看到完整的灵芝孢子形状。将脱脂灵芝孢子粉与番茄红素油树脂以1：1的重量比例充分混合，加入常规的糊精等辅料进行制粒，得到的颗粒为4#产品。
对比例2
取破壁率为90-92％的灵芝孢子粉，采用CO2超临界萃取工艺提取灵芝孢子油得到脱脂后灵芝孢子粉，CO2超临界萃取工艺为：萃取温度为35℃，萃取压力为25Mpa，萃取时间为7小时，CO2流量为500L/h，每次装样量为38kg。脱脂灵芝孢子粉在600倍显微镜下仍可看到完整的灵芝孢子形状。以9：1的重量比例取脱脂灵芝孢子粉与番茄红素油树脂。
先将脱脂灵芝孢子粉放入流化床制粒机中，将番茄红素油树脂与少许无水乙醇混合后，通过压缩空气，将与乙醇混合后的番茄红素油树脂由喷嘴雾化并喷至流化床层上正处于流化状态的破壁灵芝孢子粉粉末上，使之润湿并充分混合、流动造粒，其中，喷嘴雾化速度为100mL/min，雾化粒径为10μm，流化床一次装样量为8kg；制备的颗粒置阴凉干燥处阴干。得到的颗粒为5#产品。
对比例3
取破壁率为90-92％的灵芝孢子粉，采用CO2超临界萃取工艺提取灵芝孢子油得到脱脂后灵芝孢子粉，CO2超临界萃取工艺为：萃取温度为40℃，萃取压力为30Mpa，萃取时间为5小时，CO2流量为500L/h，每次装样量为38kg。以1：1的重量比例取脱脂灵芝孢子粉与番茄红素油树脂。
将脱脂灵芝孢子粉放入流化床制粒机中，将番茄红素油树脂与少许无水乙醇混合后，通过压缩空气，将与乙醇混合后的番茄红素油树脂由喷嘴雾化并喷至流化床层上正处于流化状态的破壁灵芝孢子粉粉末上，使之润湿并充分混合、流动造粒，其中，喷嘴雾化速度为100mL/min，雾化粒径为10μm，流化床一次装样量为8kg；制备的颗粒置阴凉干燥处阴干。得到的颗粒为6#产品。
将上述1#-6#番茄红素颗粒产品进行番茄红素含量稳定性测试和多糖含量稳定性，具体结果见表1和表2：
表1番茄红素含量稳定性数据
| 样品编号 | 0月 | 3月 | 6月 | 12月 |
| 1# | 8.36％ | 8.35％ | 8.33％ | 8.30％ |
| 2# | 8.29％ | 8.28％ | 8.28％ | 8.25％ |
| 3# | 8.28％ | 8.27％ | 8.26％ | 8.26％ |
| 4# | 3.26％ | 3.25％ | 3.24％ | 3.22％ |
| 5# | 1.27％ | 1.27％ | 1.26％ | 1.26％ |
| 6# | 7.84％ | 7.80％ | 7.72％ | 7.45％ |
表2多糖含量稳定性数据
番茄红素和多糖含量的测定方法如下：
一、高效液相色谱法检测该产品番茄红素含量
1、对待测样品进行前处理：
称取2g待测样品充分研磨，混合均匀后，精密称取100mg置于100mL棕色容量瓶中，加入20mL 4％氨缓冲溶液于55℃水浴中超声20min，每5min手摇一次；待溶液冷却至室温后用稳定的四氢呋喃溶液定容，在磁力搅拌器上搅拌20min后静置5min，待溶液澄清后吸取1.0mL上清液置于10mL棕色容量瓶中；最后再用体积比为90：10的二氯甲烷和甲醇溶液定容至刻度线，得到待测液。
其中，4％氨缓冲溶液的配制方法为：先将143mL氨水加入1L纯净水中混合均匀，再用85％磷酸调节pH至9.8，即得到4％氨缓冲溶液。稳定的四氢呋喃溶液是由0.25g BHT溶于1L四氢呋喃中配制而成。流动相溶液为体积比为90：10的二氯甲烷和甲醇溶液。
2、配制标准曲线溶液：
(1)配制标准贮备液：精密称取6.0mg番茄红素标准品置于25mL棕色容量瓶中，先用22.5mL二氯甲烷溶解，再用甲醇稀释至刻度线，配制得到0.2mg/mL番茄红素标准贮备液，瓶中充满氮气后密封，置于0℃保存，备用；
(2)配制标准曲线溶液：当用于检测时，取上述0.2mg/mL的番茄红素标准贮备液，分别取40μL、80μL、120μL、160μL、200μL分别放入5个1.0mL定量瓶中，用体积比为90：10的二氯甲烷和甲醇的流动相溶液分别配制成浓度为4μg/mL、8μg/mL、12μg/mL、16μg/mL、20μg/mL的标准曲线溶液。
3、高效液相色谱法分离检测待测液中的番茄红素：
将所述标准曲线溶液分别在色谱条件下进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准曲线方程；将前处理得到的待测液用0.45μm针式滤膜过滤后，在相同的色谱条件下进样，经反相高效分离色谱柱分离后，由紫外检测器检测，通过保留时间对待测样品进行定性；根据上述标准曲线方程，利用保留时间和峰面积计算得到待测样品中番茄红素的含量。
其中，所述色谱条件为：
色谱柱：C18柱
柱温：30℃
流速：0.6～0.8mL/min
流动相：二氯甲烷：甲醇的体积比为90：10
紫外检测器检测波长：472nm
进样量：5μL。
4、待测样品中番茄红素的含量的计算：
式中：X——样品中番茄红素的含量，％；
ρ——根据标准曲线计算得到样品中番茄红素的浓度，μg/mL；
V——样品的稀释倍数；
m——样品的称样量，g。
根据标准曲线方程计算样品中番茄红素的含量，并结合样品的质量，经计算得到待测样品中番茄红素的含量。
二、硫酸蒽酮法检测该产品多糖含量
1样品溶液的配制
取本品粉末约1g，精密称定，置于100mL量瓶中，加热水90ml，沸水浴中浸提2h，冷却至室温后，用水稀释并定容至刻度。过滤，精密量取续滤液2.0ml，加入乙醇30ml，摇匀，4℃放置12h，取出离心，倾去上清液，沉淀加水溶解，摇匀，定容到100ml，即为样品溶液。
2对照品溶液的配制
配制100mg/L葡萄糖溶液，精密量取对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分别置10mL的量瓶中，加水至2.0mL，再精密加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1g，加80％的硫酸溶液100mL使溶解，摇匀)6mL，摇匀，沸水浴中加热15分钟，取出，摇匀，冰水中冷却15分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法试验，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
3多糖含量测定
精密量取供试品溶液2.0mL，置10mL的具塞试管中，照对照品溶液的配制项下的方法，自“加入硫酸蒽酮溶液6mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中的葡萄糖的量，计算，即得。
式中：X---------样品中多糖含量，g/100g；
m1--------样品测定液中葡萄糖的质量，mg；
m--------样品的质量，mg；
V1--------样品处理定容体积，mL；
V2--------沉淀多糖所用样品溶液体积，mL；
V3--------沉淀多糖定容体积，mL；
V4-----测定用多糖溶液体积，mL。
根据标准曲线计算样品中多糖的含量，并结合样品的质量，经计算得到多糖的含量。
试验例1
1.1材料
本发明实施例1产品(以下称番茄红素颗粒)，槲皮素、番茄红素油树脂、脱脂后灵芝孢子粉、AAPH(2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐)、琼脂糖、8-OH-dG标准品均购自Sigma公司，脱氧核糖购自BioRad，十二烷基磺酸钠(SDS)购自Serva，恶性胶质瘤细胞U87引自兰州大学生命科学学院，DMEM培养基购自美国Gibco，新生牛血清为杭州四季青公司产品，其余试剂皆为国产分析纯。Evolution 201紫外－可见光分光光度计(ThermoScientific，美国)，台式冷冻高速离心机(Allegra 64R Beckman)，CO2培养箱(Precision Scientific，美国)，超净工作台(苏净集团，江苏)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，P/ACEMDQ型毛细管电泳仪(Beckman Coulter，美国)。
1.2方法
1.2.1还原力测定
抗氧化剂可将Fe3+还原成Fe2+，并与铁氰化钾生成可溶性的在700nm处有最大光吸收的蓝色配合物KFe[Fe(CN)6]。所以还原力越强，测得吸光值越大。不同浓度(1，10，100μmol·L-1)的番茄红素颗粒样品溶液、10μmol·L-1番茄红素油树脂和10μmol·L-1脱脂后灵芝孢子粉各取1mL，加入0.2molpH＝6.6的磷酸盐缓冲液和1％铁氰化钾(K3Fe(CN)6)溶液各2.5mL并混合均匀，置于50℃水浴中保温20min，加入2.5mL 10％的三氯乙酸，混合物4000r·min-1离心10min。取上清2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和1mL 0.1％的三氯化铁溶液。静置10min后在700nm处检测吸光值。
1.2.2羟自由基清除能力测定
采用脱氧核糖降解法，在体系中依次加入1160μLpH＝6.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，580μL的EDTA-Na2(1mmol·L-1)溶液和380μLFeCl3(1mmol·L-1)溶液，振荡摇匀。依次加入750μL脱氧核糖溶液(20mmol·L-1)、100μL 30％过氧化氢溶液和各浓度的抗氧化剂，以30μL的抗坏血酸(10mmol·L-1)溶液启动Fenton反应并振荡摇匀。将反应混合液置于50℃水浴中30min，取出冷却至室温，再加入500μL2.8％的三氯乙酸(TCA)溶液终止反应，500μL1％的显色剂硫代巴比妥酸(TBA)于100℃水浴显色30min。待冷却至室温后，532nm处检测吸光值。清除率(％)＝[1－A1/A0]×100(A0为未加清除剂的吸光值；A1为加入清除剂的吸光值)。
1.2.3超氧阴离子清除能力测定
取不同浓度样品各0.5mL，加入4.43mLpH＝8.2的Tris-HCl(50mmol·L-1)缓冲液后，加入70μL邻苯三酚溶液(10mmol·L-1)，立刻计时并迅速摇匀，在反应启动后每隔30s检测相应325nm处的吸光值，至4.5min为止。对照管用70μL盐酸(10mmol·L-1)代替邻苯三酚溶液。超氧阴离子清除率(％)＝[1－(A1－A2)/A0]×100(A0为未加清除剂的吸光值；A1为加入清除剂的吸光值；A2为未加邻苯三酚的吸光值)。
1.2.4对脂质过氧化的抑制
用硫代巴比妥酸比色法，参考刘国安等的方法提取微粒体，稀释至0.3～0.5g·L-1。取300μL微粒体加入100μLPBS及300μL蒸馏水，再加入不同浓度的样品100μL，阳性对照用蒸馏水代替。用200μLVc/Fe2+启动反应，37℃孵育1h，加入1mL 20％TCA终止反应，再与1.5mL0.67％的TBA混匀，沸水浴1h，离心30min，取上清液在532nm处检测吸光值。
1.2.5检测对蛋白氧化降解的保护作用
取200mL BSA(5mg·L-1)，加入400μLAAPH(50mmol·L-1)构成损伤模型反应体系。对照和加入5，50，500μmol·L-1番茄红素颗粒以及50μmol·L-1槲皮素的测试组在37℃孵育24h，加入200μL4％的BHT终止反应。依常规进行SDS-PAGE电泳、染色、脱色并拍照。
1.2.6细胞培养
瘤细胞U87培养于DEME完全培养基中，内含10％新生牛血清和链霉素(100μg·.L-1)及青霉素(100U·mL-1)，培养于5％CO2饱和湿度恒温箱(37℃)，取对数生长期细胞用于实验。
1.2.7 MTT比色法检测番茄红素对H2O2引起U87细胞损伤的保护作用
取对数生长期的U87细胞，以1×105个·mL-1的浓度接种于96孔板中，每孔100μL，孵育24h，保护组加入不同浓度番茄红素颗粒，使终浓度为0.5，1，5，25μmol·L-1，孵育2h后加入终浓度为100μmol·L-1的H2O2；对照组、损伤组分别加入含10％新生牛血清的DMEM完全培养基和终浓度为100μmol·L-1的H2O2，孵育24h，每孔加入20μLMTT(5mg·L-1)，37℃孵育4h，吸去上清，加入150μL DMSO，振荡10min溶解结晶，用酶标仪在490nm波长处检测每孔的吸光值(A)，并以对照组百分比表示细胞活性。细胞生长率(％)＝(A1－A0)/(A－A0)×100，其中，A0为空白组吸光值；A为对照组吸光值；A1为实验组吸光值。
1.2.8毛细管电泳检测番茄红素对U87细胞DNA损伤的保护作用
取对数生长期的U87细胞，以1×105个·mL-1的浓度接种于6孔板中，每孔100μL，孵育24h.保护组加入不同浓度的番茄红素，使终浓度为1，5，10μmol·L-1，孵育2h，加入终浓度为100μmol·L-1的H2O2；对照组、损伤组分别加入含10％牛血清的DEME完全培养基和终浓度为100μmol·L-1的H2O2，孵育24h，用天根DP304-02DNA提取试剂盒提取DNA，测定DNA纯度并进行上样前处理，进行毛细管电泳检测。检测条件：25℃，20kV，进样20s；检测10min；pH 9.0硼酸－氢氧化钠(10mmol·L-1)为电极缓冲液。结果以检测得峰面积带入线性回归方程y＝1245x-50176，相关系数R2＝0.966，得到8-OH-dG含量(x为8-OH-dG标准品浓度，y为峰面积)。
1.2.9数据处理
所有实验重复3次，实验结果以平均值±标准差表示，用t检验进行差异显著性分析，P＜0.05为有统计学意义。
2结果与分析
2.1番茄红素颗粒的还原力
槲皮素是常见的膳食抗氧化剂之一，以槲皮素为参照，对比番茄红素颗粒的活性。表1是不同浓度番茄红素颗粒的还原力，可看到随着浓度的增高，还原力也不断增高，在测试范围内呈正相关，并且在100μmol·L-1时吸光值达到0.0975.但与10μmol·L-1槲皮素相比活性较弱。
表3番茄红素颗粒的还原力
2.2番茄红素颗粒的清除自由基的作用
OH·和O2 -·是最具代表性的自由基，几乎所有需氧生物体内均可以产生，而OH·是生物体内最活泼、最具攻击性的活性氧，它们的异常产生可以损伤重要的如蛋白质、DNA等生物大分子，造成机体损伤。番茄红素颗粒对OH·和O2 -·的清除能力以清除率达到50％时的浓度-半数清除浓度(EC50)表示，结果见表2。番茄红素颗粒对OH·的EC50为0.03mol·L-1，而槲皮素为0.08μmol·L-1。番茄红素颗粒清除O2 -·的EC50为72.63μmol·L-1，而槲皮素是183.52μmol·L-1，表明番茄红素颗粒的活性强。
表4番茄红素颗粒清除自由基的能力
2.3番茄红素颗粒对脂质过氧化的抑制作用
表5表明番茄红素颗粒对大鼠肝微粒体脂质过氧化有抑制作用，半抑制浓度(IC50)为22.53μmol·L-1，其抑制作用较槲皮素(IC50为29.14μmol·L-1)强，显示出良好的抗氧化活性。
表5番茄红素颗粒对脂质过氧化的抑制作用
2.4实施例1番茄红素颗粒对蛋白质氧化损伤的保护作用
图1是番茄红素颗粒和槲皮素保护由AAPH引起的BSA氧化损伤的保护作用结果。与对照相比，BSA与AAPH在37℃作用后，通过SDS-PAGE凝胶电泳条带明显变浅，说明牛血清蛋白被氧化降解。向体系中加入不同浓度番茄红素颗粒后，随着浓度的增加，BSA的降解被抑制。根据条带的深浅可看出，5μmol·L-1的番茄红素颗粒具有一定的保护作用，50μmol·L-1时保护作用更强；而500μmol·L-1与50μmol·L-1组结果相似，都具有较强的保护作用并且与对照组条带相近。同时，相同浓度下，50μmol·L-1槲皮素处理组抑制蛋白降解的效果较弱，表明该体系中番茄红素颗粒比槲皮素具有更强的保护作用。
2.5番茄红素颗粒对H2O2引起U87细胞损伤的保护作用
H2O2是有机体的氧化代谢产物，同时是一种活性氧。用100μmol·L-1H2O2损伤U87细胞或预先加入不同浓度番茄红素处理，通过观察细胞活力评估番茄红素的保护作用。
由图2可知，槲皮素和0.5，1，5μmol·L-1番茄红素颗粒单独作用于U87细胞时，对细胞生长率并无太大影响，与对照相比无显著差异。而25μmol·L-1番茄红素颗粒对U87细胞有一定的生长抑制作用，生长率为76.60％。100μmol·L-1H2O2可导致细胞生长率急剧降低至66.28％。在用待测样进行预处理后，0.5μmol·L-1番茄红素颗粒无保护作用，槲皮素、1μmol·L-1、5μmol·L-1番茄红素颗粒使细胞活性升高，其中1μmol·L-1番茄红素颗粒的保护作用很微弱，与H2O2损伤组相比差异不显著，5μmol·L-1番茄红素颗粒的保护作用强，达到97.39％，与损伤组相比差异极显著(P＜0.01)，且使细胞生长率水平与对照达到同一水平；同时，与同浓度槲皮素(5μmol·L-1)相比，番茄红素颗粒保护能力更强，与损伤组相比差异极显著。高剂量番茄红素颗粒保护组的细胞活性(54.79％)甚至低于H2O2损伤组，不但无保护作用，还表现出一定的促氧化作用。
2.6番茄红素颗粒对细胞DNA氧化损伤的保护作用
机体自由基过量时，会攻击DNA并最终造成氧化损伤.已发现的各种DNA氧化损伤产物中，鸟嘌呤最容易被氧化损伤，这是由于它具有较高能级的分子轨道，在发生氧化损伤时极易形成修饰核苷且化学性质较稳定的8-OH-dG。大量研究表明8-OH-dG可以作为反映内源及外源因素对DNA氧化损伤的较灵敏和稳定的生物标记物。图3是用CE检测番茄红素颗粒对H2O2引起U87细胞DNA损伤的作用，结果中峰面积与8-OH-dG含量成正比，即含量越高DNA氧化损伤越严重。与对照组相比，加入H2O2损伤细胞后，峰面积增大，8-OH-dG含量升高。1μmol·L-1番茄红素颗粒对此损伤无作用，而浓度为5μmol·L-1时峰面积减小，8-OH-dG浓度降低，表现出明显保护作用；相比之下，10μmol·L-1也有一定的保护作用，但不如5μmol·L-1组强。同样，槲皮素的抗DNA损伤活性不如番茄红素颗粒强。
Claims (8)
1.一种具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法，其特征在于该方法包括以下步骤：破壁率为90-92％的灵芝孢子粉，通过CO2超临界萃取工艺提取灵芝孢子油得到脱脂后灵芝孢子粉，将脱脂灵芝孢子粉与番茄红素油树脂以1-2：1-2的重量比例混合喷雾造粒。
2.根据权利要求1所述的具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法，其特征在于脱脂灵芝孢子粉与番茄红素油树脂的重量比例为1：1。
3.根据权利要求1所述的具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法，其特征在于喷雾造粒为：将番茄红素油树脂与少许无水乙醇混合后得到番茄红素油树脂醇化物，采用流化床制粒机，通过压缩空气将番茄红素油树脂醇化物由喷嘴雾化并喷至流化床层上正处于流化状态的破壁灵芝孢子粉上，使之润湿并充分混合，流动造粒。
4.根据权利要求1所述的具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法，其特征在于喷雾造粒采用的条件为：喷嘴雾化速度40～100mL/min，雾化粒径10-12μm，流化床一次装样量为8-10kg。
5.根据权利要求4所述的具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法，其特征在于喷雾造粒采用的条件为：喷嘴雾化速度100mL/min，雾化粒径10μm，流化床一次装样量为8kg。
6.根据权利要求1所述的具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法，其特征在于所述的灵芝孢子粉为赤灵芝喷发的灵芝孢子粉。
7.根据权利要求1所述的具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法，其特征在于CO2超临界萃取工艺为：萃取温度为35～36℃，萃取压力为25～28Mpa，萃取时间为6～7小时，CO2流量为400～600L/h。
8.根据权利要求7所述的具有高效抗氧化功效的含番茄红素颗粒的生产方法，其特征在于CO2超临界萃取工艺为：萃取温度为35℃，萃取压力为25Mpa，萃取时间为7小时，CO2流量为500L/h。
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