CN112553324A - 检测trex1基因突变的引物、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测TREX1基因突变的引物和方法，其包括扩增TREX1基因全外显子序列的引物；采用Sanger测序技术和测序引物。本发明可快速地将TREX1基因全外显子的突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可以辅助诊断Aicardi‑Goutieres综合征，对疾病的诊断和预后有重要的参考意义。

Description

检测TREX1基因突变的引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于分子检测领域，特别涉及一种检测TREX1基因突变的试剂盒和检测方法。

背景技术

Aicardi-Goutieres综合征(AGS)是一组罕见的以神经系统及皮肤受累为主的遗传性疾病，绝大多数患儿出生时各项指标均正常，疾病可能会在出生后的数天或1个月内发作，表现为癫痫发作、皮肤上冻疮样皮疹及无菌性发热的严重亚急性脑病，通常表现为喂养困难、易激惹、精神运动倒退或发展迟缓。部分患者新生儿期表现为肝脾大、血小板减少。症状要经过数月的发展才会稳定下来。尽管大多数患儿的症状在出生后1年内快速发展，但部分患儿也呈缓慢发展过程，主要症状包括张力障碍、运动障碍或认知发育迟缓。

该病多为常染色体隐性遗传，少数为常染色体显性遗传。文献研究表示，至今已发现7个致病基因，包括TREX1(AGS1)、RNASEH2B(AGS2)、RNASEH2C(AGS3)、RNASEH2A(AGS4)、SAMHD1(AGS5)、ADAR1(AGS7)和IFIH1(AGS7)基因，这些基因发生基因突变分别会引起AGS1-7型对应疾病的发生。其中TREX1突变会引起AGS1的发生。

TREX1基因位于3号染色体3p21.31，共2个外显子，第一外显子不编码氨基酸。该基因编码一个具有3'外切酶活性的核蛋白，包括位于核酸外切酶DnaQ家族活性部位4个高度保守的酸性残基，这些残基在协调两个Mg²⁺催化作用中有重要作用。在每个TREX1蛋白中毗邻活性部位和二聚体的结构为PPII，其可能在和SET复合体的相互作用中有重要角色。TREXl蛋白有延伸的C-羟基端跨膜结构域，其涉及到在细胞质内质网中TREXl蛋白的亚细胞定位。最后在每一个活性部位附近有一个和DNA结合的柔软环状结构。TREX1基因的突变会导致AGS综合征、红斑狼疮、Cree脑炎和其他免疫系统疾病。可变剪接也会导致多个转录子变异。TREXl基因突变时核蛋白表达减少、功能障碍甚至功能丧失，导致了DNA双链降解中间体的堆积而激活自身免疫系统，从而引起自身免疫系统疾病。目前已报道的基因突变形式多样，包括碱基的置换、缺失、插入。已发现与AGS相关的TREX1基因突变多达32种。李慧娟的研究指出第一外显子c.460insA插入突变，使得第154-156位氨基酸发生移码突变，第156位提前出现终止密码子TAG，从而导致TREXl蛋白的截短，截去了部分起催化作用的两个Mg+配位结合区域和C-羟基端的跨膜区结构域，影响了蛋白功能。Lee-Kirsch等人的研究表明，大多数有狼疮表现的患儿TREX1基因检测为杂合突变且位于C’羟基功能端，但该研究结果有待于进一步实验证实。郭洪伟等人的研究指出c.45G＞T、c.139G＞A和c.459_460insA单独携带时并不致病，三个突变同时由一个人携带时会引起疾病。

TREX1突变分析对AGS遗传咨询及产前诊断具有重要意义，AGS的遗传方式为常染色体隐性遗传，TREXl突变分析对于双亲为杂合突变的家庭有重要意义。且该病病人发病年龄较小，对该病的预防需要控制在产前阶段，父母(突变携带者)任何一方没有疾病症状，他们的每一个后代都有四分之一的可能得到两个有缺陷的基因，从而遗传AGS。所以，先证者如致病基因明确，父母决定妊娠应及时进行相关遗传咨询，在妊娠早期阶段进行产前分子诊断，最大限度减少异常胎儿的出生，提高新生儿人口素质。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测TREX1基因突变的试剂盒，采用PCR技术，可用于快速检测患者体内TREX1基因的突变情况。

检测TREX1基因突变的引物，其特征在于，包括扩增TREX1基因的引物，其碱基序列为：

TREX1-1F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGGAACGGATGGTGGTGA

TREX1-1R：AACAGCTATGACCATG AGGGTGAGGTGGTTTCCTTAG

TREX1-2F1：TGTAAAACGACGGCCAGT TCGCAGACAGGGCAGGATTG

TREX1-2R1：AACAGCTATGACCATG CACTGGTGAGGCCCAGCATAG

TREX1-2F2：TGTAAAACGACGGCCAGT CCAACCTGCTCCTAGCCTTCC

TREX1-2R2：AACAGCTATGACCATG GACAAACACTGTGCCCTCCTC。

进一步地，所述引物还包括检测TREX1基因的测序引物，其碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG。

本发明还提供了一种检测TREX1基因突变情况的方法，包括以下步骤：

(1)抽提血液中的组织DNA；

(2)对步骤(1)中提取的DNA进行PCR扩增，获得扩增引物；其中PCR扩增引物的碱基序列为：

TREX1-1F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGGAACGGATGGTGGTGA

TREX1-1R：AACAGCTATGACCATG AGGGTGAGGTGGTTTCCTTAG

TREX1-2F1：TGTAAAACGACGGCCAGT TCGCAGACAGGGCAGGATTG

TREX1-2R1：AACAGCTATGACCATG CACTGGTGAGGCCCAGCATAG

TREX1-2F2：TGTAAAACGACGGCCAGT CCAACCTGCTCCTAGCCTTCC

TREX1-2R2：AACAGCTATGACCATG GACAAACACTGTGCCCTCCTC。

(3)利用一对测序引物对步骤(2)中的扩增产物进行测序，所述一对测序引物的碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG；

(4)对测序结果进行判断，确定TREX1基因是否发生突变。

本发明还提供了一种检测TREX1基因突变位点的试剂盒，包括：

(i)血液DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR扩增反应液；包括扩增TREX1基因的引物，其碱基序列为：

TREX1-1F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGGAACGGATGGTGGTGA

TREX1-1R：AACAGCTATGACCATG AGGGTGAGGTGGTTTCCTTAG

TREX1-2F1：TGTAAAACGACGGCCAGT TCGCAGACAGGGCAGGATTG

TREX1-2R1：AACAGCTATGACCATG CACTGGTGAGGCCCAGCATAG

TREX1-2F2：TGTAAAACGACGGCCAGT CCAACCTGCTCCTAGCCTTCC

TREX1-2R2：AACAGCTATGACCATG GACAAACACTGTGCCCTCCTC。

(iii)测序体系试剂；包括检测TREX1基因的测序引物，其碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG。

有益效果：本发明设计了扩增TREX1全部2个外显子序列的引物。通过加接头，使3对引物的PCR产物均可以用一种测序引物进行测序。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。TREX1基因的突变类型种类繁多且遍布整个基因，因此本发明所述引物既能将所述TREX1全外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量PCR法，本发明降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。

附图说明

图1为TREX1基因在染色体上定位图。

图2、3、4分别为利用引物TREX1-1F\1R、TREX1-2F1\2R1、TREX1-2F2\2R2扩增后的扩增产物的电泳图，M为Marker DL 2000，引物TREX1-1F\1R、TREX1-2F1\2R1、TREX1-2F2\2R2扩增有效，条带明亮。

图5显示是TREX1 1号外显子突变型测序截图，说明样本的1号外显子c.-68发生部分突变T＞TC。

图6显示是TREX1 1号外显子突变型测序截图，说明样本的1号外显子c.-60发生部分突变C＞CT。

图7显示是TREX1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.266发生部分突变C＞CT。

图8显示是TREX1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.531发生部分突变T＞TC。

图9显示是TREX1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.531发生完全突变T＞C。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测TREX1基因突变位点的引物，该引物的设计是针对TREX1全外显子设计的扩增引物，包括：

扩增TREX1基因全外显子序列的引物，其碱基序列为：

TREX1-1F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGGAACGGATGGTGGTGA

TREX1-1R：AACAGCTATGACCATG AGGGTGAGGTGGTTTCCTTAG

TREX1-2F1：TGTAAAACGACGGCCAGT TCGCAGACAGGGCAGGATTG

TREX1-2R1：AACAGCTATGACCATG CACTGGTGAGGCCCAGCATAG

TREX1-2F2：TGTAAAACGACGGCCAGT CCAACCTGCTCCTAGCCTTCC

TREX1-2R2：AACAGCTATGACCATG GACAAACACTGTGCCCTCCTC。

检测TREX1基因突变的试剂盒，包括：

(i)血液DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FXDNAPolymerase(1U/μl)；TREX1基因2个外显子序列的上、下游引物引物TREX1-1F/1R、TREX1-2F1/2R1、TREX1-2F2/2R2引物浓度均为10μM。

测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测TREX1基因全外显子序列的上、下游引物分别为M13F(3.2μm)、M13R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。其中，图1是TREX1基因在染色体上定位图。

实施例2

血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的组织DNA：

1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀；

2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；

3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液；

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：

X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系PCR反应液中1μl DNA；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：

PCR扩增体系试剂配制方法如下：

引物F/R选自TREX1-1F/1R、TREX1-2F1/2R1和TREX1-2F2/2R2。

其中，引物相关信息如下所示，引物序列如实施例1所示：

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。

(6)Sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与TREX1野生型参考序列(Genbank：NG_041782)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取24例的临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份检测体系PCR反应液中加入样本1μl。图2、3和4分别为血液样本以TREX1-1F/1R、TREX1-2F1/2R1、TREX1-2F2/2R2为引物扩增后所得扩增产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度分别为337bp、587bp、768bp，通过电泳图的分析表明本发明所述引物TREX1-1F/1R、TREX1-2F1/2R1、TREX1-2F2/2R2扩增有效，且条带单一。

24例样本的测序结果显示存在5个突变位点，各突变位点及数量如下表所示：

图5显示是TREX1 1号外显子突变型测序截图，说明样本的1号外显子c.-68发生部分突变T＞TC。

图6显示是TREX1 1号外显子突变型测序截图，说明样本的1号外显子c.-60发生部分突变C＞CT。

图7显示是TREX1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.266发生部分突变C＞CT。

图8显示是TREX1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.531发生部分突变T＞TC。

图9显示是TREX1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.531发生完全突变T＞C。

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出TREX1基因2个外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出TREX1基因全外显子，无论是野生型还是突变型。

序列表

<110> 济南艾迪康医学检验中心有限公司

<120> 检测TREX1基因突变的引物、试剂盒和方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtaaaacga cggccagtgg gaacggatgg tggtga 36

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacagctatg accatgaggg tgaggtggtt tccttag 37

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtaaaacga cggccagttc gcagacaggg caggattg 38

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacagctatg accatgcact ggtgaggccc agcatag 37

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtaaaacga cggccagtcc aacctgctcc tagccttcc 39

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aacagctatg accatggaca aacactgtgc cctcctc 37

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacagctatg accatg 16

Claims (4)

1.检测TREX1基因突变的引物，其特征在于，包括扩增TREX1基因的引物，其碱基序列为：

TREX1-1F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGGAACGGATGGTGGTGA

TREX1-1R：AACAGCTATGACCATG AGGGTGAGGTGGTTTCCTTAG

TREX1-2F1：TGTAAAACGACGGCCAGT TCGCAGACAGGGCAGGATTG

TREX1-2R1：AACAGCTATGACCATG CACTGGTGAGGCCCAGCATAG

TREX1-2F2：TGTAAAACGACGGCCAGT CCAACCTGCTCCTAGCCTTCC

TREX1-2R2：AACAGCTATGACCATG GACAAACACTGTGCCCTCCTC。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括检测TREX1基因的测序引物，其碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG。

3.检测TREX1基因突变情况的方法，包括以下步骤：

(1)抽提血液中的组织DNA；

(2)对步骤(1)中提取的DNA进行PCR扩增，获得扩增引物；其中PCR扩增引物的碱基序列为：

TREX1-1F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGGAACGGATGGTGGTGA

TREX1-1R：AACAGCTATGACCATG AGGGTGAGGTGGTTTCCTTAG

TREX1-2F1：TGTAAAACGACGGCCAGT TCGCAGACAGGGCAGGATTG

TREX1-2R1：AACAGCTATGACCATG CACTGGTGAGGCCCAGCATAG

TREX1-2F2：TGTAAAACGACGGCCAGT CCAACCTGCTCCTAGCCTTCC

TREX1-2R2：AACAGCTATGACCATG GACAAACACTGTGCCCTCCTC；

(3)利用一对测序引物对步骤(2)中的扩增产物进行测序，所述一对测序引物的碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG；

(4)对测序结果进行判断，确定TREX1基因是否发生突变。

4.检测TREX1基因突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(i)血液DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR扩增反应液；包括扩增TREX1基因的引物，其碱基序列为：

TREX1-1F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGGAACGGATGGTGGTGA

TREX1-1R：AACAGCTATGACCATG AGGGTGAGGTGGTTTCCTTAG

TREX1-2F1：TGTAAAACGACGGCCAGT TCGCAGACAGGGCAGGATTG

TREX1-2R1：AACAGCTATGACCATG CACTGGTGAGGCCCAGCATAG

TREX1-2F2：TGTAAAACGACGGCCAGT CCAACCTGCTCCTAGCCTTCC

TREX1-2R2：AACAGCTATGACCATG GACAAACACTGTGCCCTCCTC；

(iii)测序体系试剂；包括检测TREX1基因的测序引物，其碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG。

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