CN112552422A - 玛咖多糖-锌(ⅱ)配合物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体公开了一种玛咖多糖‑锌(Ⅱ)配合物的制备方法及其应用。本发明通过玛咖多糖在pH为3~7、温度为50~65℃下与无机锌源反应60~100 min，得到玛咖多糖‑锌(Ⅱ)配合物。本发明的玛咖多糖‑锌(Ⅱ)配合物既可以作为补锌剂使用也可以应用于抗肿瘤活性药物的制备。

Description

玛咖多糖-锌(II)配合物的制备方法及其应用

【技术领域】

本发明属于生物医药领域，具体涉及玛咖多糖-锌(II)配合物的制备方法及其应用。

【背景技术】

作为人体必需的微量元素锌在人体生长发育、免疫等方面起着极其重要的作用。锌存在于众多的酶系中，如碳酸酐酶、呼吸酶、乳酸脱氢酶、超氧化歧化酶、碱性磷酸酶、DNA和RNA聚合酶等中，是核酸、蛋白质、碳水化合物的合成和维生素A利用的必需物质。锌具有维持身体正常生理功能、促进生长发育，提高免疫力，改善味觉的作用。在正常食物难以保证营养的状态下，世界卫生组织推荐采用锌盐来补充。锌盐多为无机锌，不利于吸收，且摄入过多对人体有毒害。目前研究表明：与无机锌相比，生物源有机锌更利于人体吸收且安全无毒。

玛咖具有改善性功能、提高生育力、调节内分泌、增强体力、抗疲劳、在改善贫血症状、降低血脂、美容、提高记忆力、抗癌、防止酒精中毒、缓解呼吸疾病、提高人体免疫功能、辅助治疗风湿症及抑郁症等多种功效。玛咖多糖具有抗衰老、提高生育能力、调节免疫力、抗氧化、抗疲劳及抗肝损伤等生理功能，且毒性极小，从而成为药物药效物质基础研究的热点。

当前未有玛咖多糖-锌(II)配合物及其抗肿瘤活性见诸报道，申请人研究了玛咖多糖-锌(II)配合物的合成及其生物活性，填补了现有技术的空白。

【发明内容】

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种玛咖多糖-锌(II)配合物的制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种玛咖多糖-锌(II)配合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)玛咖粗多糖的制备：采用水提醇沉法从玛咖粉中提取玛咖粗多糖；

(2)玛咖粗多糖的分离纯化：依次采用DEAE-52纤维素柱和SephadexG-50凝胶对玛咖粗多糖进行分离纯化，得到精制玛咖多糖；

(3)玛咖多糖-锌(II)配合物的制备：

将步骤(2)所得精制玛咖多糖配成水溶液，加入无机锌源(例如：硫酸锌、氯化锌、醋酸锌等)后，搅拌，调节溶液的pH为3～7，在50～65℃温度下反应60～100min，反应结束后，趁热离心，取上清液用3～6倍体积乙醇(优选4倍体积乙醇)醇沉过夜，离心得沉淀，烘干，即得玛咖多糖-锌(II)配合物。

进一步，所述步骤(1)中玛咖粉为云南丽江所产。

进一步，所述步骤(2)中所得精制玛咖多糖的重均分子量为7×10³～8×10³。

进一步，所述步骤(3)中无机锌源中锌的质量与精制玛咖多糖的质量比为1∶1～1∶20，优选质量比为1∶1～1∶5，最优选的，质量比为1∶1～1∶1.5。

优选的，所述步骤(3)中玛咖多糖与无机锌源发生配合反应的条件为：pH为3，反应温度为60℃，反应60min。

进一步，所述步骤(3)中玛咖多糖水溶液的浓度为8～15g/L，优选为10g/L。

进一步，所述步骤(3)中调节溶液的pH所用溶液为氢氧化钠溶液或盐酸；优选1～3mol/L氢氧化钠溶液或3～10wt％盐酸。

进一步，所述步骤(3)中烘干温度为25～40℃，优选30℃。

上述制备方法所得玛咖多糖-锌(II)配合物在制备具有抗肿瘤活性的药物中的应用。

上述制备方法所得玛咖多糖-锌(II)配合物作为补锌剂的应用。

与现有技术相比，本发明方法具有如下优点和有益效果：

采用本方法制得的玛咖多糖-锌(II)配合物中锌含量达0.2360μg/mg，能作为补锌剂使用。此外，玛咖多糖-锌(II)配合物具有DPPH·清除能力和ABTS·清除能力(与Vc接近)；还具有抗肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7及结肠癌细胞SW480毒株的活性，其抗结肠癌细胞SW480毒株的效果明显高于顺铂。因此，玛咖多糖-锌(II)配合物可以应用于抗肿瘤药物的制备，尤其是应用于抗结肠癌药物的制备。

【附图说明】

图1为葡萄糖溶液的标准工作曲线；

图2为反应温度对玛咖多糖-锌(II)配合物中锌含量的影响图；

图3为溶液pH对玛咖多糖-锌(II)配合物中锌含量的影响图；

图4为反应时间对玛咖多糖-锌(II)配合物中锌含量的影响图；

图5为玛咖多糖和玛咖多糖-锌(II)配合物的红外光谱图；

图6为玛咖多糖-锌(II)配合物在4 1区(A)和4 2区(B)的电子能谱图；

图7为玛咖多糖(左)和玛咖多糖-锌(II)配合物(右)的扫描电镜图；

图8为玛咖多糖和玛咖多糖-锌(II)配合物的X-射线粉末衍射图；

图9为玛咖多糖和玛咖多糖-锌(II)配合物清除DPPH自由基的能力与浓度的关系图；

图10为玛咖多糖和玛咖多糖-锌(II)配合物清除ABTS自由基的能力与浓度的关系图；

图11为玛咖多糖和玛咖多糖-锌(II)配合物对肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7及结肠癌细胞SW480等毒株的抑制活性的影响图。

【具体实施方式】

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明的技术方案进行进一步的说明。

实施例1精制玛咖多糖的制备

本实验所用玛咖为采购于云南丽江的玛咖粉末。

(1)玛咖粗多糖的制备：

采用水提醇沉法制备了玛咖多糖。

称取玛咖粉末5g于圆底烧瓶中，按料液比1∶20(g/mL)加蒸馏水，在70℃下提取1h，离心分离上清液。上清液浓缩至其体积的1/5(60r/min，温度70℃)，用0.2mol/L pH为7.4的PBS调节pH＝6，并在60℃下水浴酶(a-淀粉酶：0.4g，初始活性为3700活力单位/g)解2h，后迅速加热至100℃灭酶5min，离心分离。上清液加入其4倍体积的无水乙醇，在4℃冰箱中醇析18h，弃去醇层，得棕黄色沉淀。用20mL蒸馏水溶解沉淀，并用Sevag法(用氯仿：丁醇，以体积比4∶1混合，加入到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去)除蛋白质，再次醇析。所得沉淀依次用乙醚、丙酮各洗涤两次后，置于50℃的真空干燥箱中干燥36h，即得玛咖粗多糖。

(2)玛咖粗多糖的分离纯化

步骤A(DEAE-52纤维素柱分离纯化玛咖粗多糖)：将步骤(1)所得玛咖粗多糖配制成50mg/mL玛咖粗多糖水溶液，湿法上样，依次用蒸馏水和0.1、0.2、0.3mol/L NaCl进行洗脱，每12mL收集一管，用苯酚-硫酸法检测多糖含量，收集并合并多糖含量相同组分(即吸光度相同的组分)、浓缩后透析48h，得到的多糖重均分子量为7.966×10³、冷冻干燥；

步骤B(SephadexG-50凝胶纯化玛咖多糖)：将步骤A得到的多糖组分配制成10mg/mL溶液，缓慢上样，用水进行洗脱，每12mL收集一管，用苯酚-硫酸法检测多糖含量，收集并合并多糖含量相同组分(即吸光度相同的组分)、浓缩冷冻干燥，即得到精制玛咖多糖。

步骤(2)所述苯酚-硫酸法如下：

a.葡萄糖储备液的配制

精确称取0.0100g葡萄糖用水溶解后定容至100mL，配制成0.100mg/mL的葡萄糖储备液，于4℃保存备用。

分别吸取葡萄糖储备液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，补充水分至2mL，加入6wt％的苯酚1mL，迅速加入95.5wt％浓硫酸5mL，混匀，放置5min，置沸水浴中加热15min，冷水中冷却。以蒸馏水为空白对照，测定490nm的吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，浓度(c)为横坐标绘制工作曲线。如图1，在0.02～0.06mg/mL浓度范围内，线性回归方程为A＝14.6167c+0.04621，相关系数R²＝0.9997。

b.玛咖多糖含量的测定

精确称取玛咖多糖0.0050g定容至10mL。精密吸取1mL溶液于10mL比色管中，并补充水分至2mL，加入6wt％的苯酚溶液1mL，加入5mL 95.5wt％浓硫酸，煮沸15min后冷却，在490nm测定吸光度，通过工作曲线算出浓度，进而算出玛咖多糖含量。

实施例2玛咖多糖-锌(II)配合物的制备

取实施例1所得的精制玛咖多糖，用蒸馏水配制成10g/L玛咖多糖水溶液，移取20mL10g/L玛咖多糖水溶液，加入等体积4％(质量体积百分比，即：4g/100mL)的七水合硫酸锌溶液(以七水合硫酸锌为溶质计量)，搅拌，用3mol/L氢氧化钠溶液或5wt％盐酸调节pH，加热该反应。反应完毕后，趁热以6000r/min离心5min。上清液用4倍体积乙醇醇沉过夜，离心得沉淀，并将沉淀在30℃烘干，即得玛咖多糖-锌(II)配合物。

我们分析了玛咖多糖与七水合硫酸锌发生反应的温度、溶液pH及反应时间对玛咖多糖-锌(II)配合物中锌含量的影响(如图2-4)。通过正交试验(如表1-2)对反应条件进行优化，根据K值最大来选择反应条件，得到反应温度为60℃，pH为3，反应60min时，制得的玛咖多糖-锌(II)配合物中锌含量最高，可达0.2360μg/mg。在实际应用时，选择制备条件：反应温度为50～65℃，pH为3～7，反应时间为60～100min，制得的玛咖多糖-锌(II)配合物中锌含量大于0.050μg/mg，能作为补锌剂使用。

表1因素水平表

表2正交实验结果表

实施例3

对实施例2中以“反应温度为60℃，pH为3，反应时间为60min”为条件制得的玛咖多糖-锌(II)配合物(锌含量0.2360μg/mg)进行结构表征：

玛咖多糖和玛咖多糖-锌(II)配合物的红外光谱图如图5，玛咖多糖在556cm^-1的吸收峰对应于C-O单键的伸缩振动及各种基团的面内变形振动；在1040cm^-1处存在很强的C-O-C单键不对称伸缩振动吸收峰；在1684cm^-1处的峰是-COO^-的反对称伸缩振动吸收峰；在3419cm^-1处有很宽的O-H单键的伸缩振动吸收峰。对比玛咖多糖和玛咖多糖-锌(II)配合物的红外光谱图发现：玛咖多糖在556cm^-1的吸收峰在玛咖多糖-锌(II)配合物的红外光谱图移动到619cm^-1处，表明多糖上的C-O参与了与Zn²⁺的配位；玛咖多糖在1040cm^-1的吸收峰在玛咖多糖-锌(II)配合物的红外光谱图分裂成位于1154cm^-1和1107cm^-1处两个尖锐的峰，进一步表明多糖上的C-O-C参与了与Zn²⁺的配位；玛咖多糖在1632cm^-1和1684cm^-1的吸收峰在玛咖多糖-锌(II)配合物的红外光谱图合并成位于1619cm^-1处的峰，进一步表明多糖上的-COO^-参与了与Zn²⁺的配位；玛咖多糖在3419cm^-1的吸收峰在玛咖多糖-锌(II)配合物的红外光谱图移动到3539cm^-1处，表明多糖上的OH参与了与Zn²⁺的配位。

玛咖多糖-锌(II)配合物的电子能谱图(图6)显示，在A图中4 1区域锌元素和氧元素在玛咖多糖-锌(II)配合物上为主要元素，硫元素和碳元素次之；在B图中4 2区域氧元素和锌元素在玛咖多糖-锌(II)配合物上为主要元素，硫元素和碳元素次之(4 1区、4 2区为玛咖多糖-锌(II)配合物的电镜图中的两个不同点位)。硫元素来自于反应物七水合硫酸锌。上述结果表明：锌和玛咖多糖的配合物已成功合成。

通过分析玛咖多糖和玛咖多糖-锌(II)配合物的扫描电镜图(图7)发现：玛咖多糖呈不规则的薄片状，并且表面光滑致密、无空隙；玛咖多糖-锌(II)配合物呈分散的颗粒状。

通过对比玛咖多糖和玛咖多糖-锌(II)配合物的X-射线粉末衍射图(图8)发现玛咖多糖为无定型，而玛咖多糖-锌(II)配合物是晶体。这一结果和其扫描电镜的分析结果吻合。总之，上述表征结果表明：采用此法能够成功制备玛咖多糖-锌(II)配合物。

实施例4

对实施例2中以“反应温度为60℃，pH为3，反应时间为60min”为条件制得的玛咖多糖-锌(II)配合物(锌含量0.2360μg/mg)进行抗氧化性及抗癌性等生物活性评价：

采用二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力和过硫酸铵氧化产生的单阳离子自由基(ABTS·)清除能力评价玛咖多糖-锌(II)配合物的抗氧化性(如图9-10)；采用MTS法(2-对磺酸基苯基-3-(4，5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲氧基苯基)-二氢四唑嗡盐法)评价玛咖多糖-锌(II)配合物抗肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7及结肠癌细胞SW480毒株的活性(如图11及表3)。

MTS为一种全新的MTT类似物，全称为3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成可溶性的甲臜(Formazan)化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。

实验方法：

1.接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM)配成单个细胞悬液，以每孔3000～15000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，细胞提前12～24小时接种培养。

2.加入待测化合物溶液：化合物用去离子无菌水溶解，化合物以100ug/mL浓度初筛，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔。

3.显色：37℃培养48h后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加2mg/mL MTS溶液20μL和培养液100μL；悬浮细胞HL-60弃100μL培养上清液，每孔加20μL的MTS溶液；设3个空白复孔(MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液)，继续孵育2～4h，使反应充分进行后测定光吸收值。

4.比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以化合物编号为横坐标(从左至右依次为：SMMC-7721、MCF-7、SW480)，细胞抑制率为纵坐标绘制玛咖多糖-锌(II)配合物、玛咖多糖对细胞的抑制率图，见图11。

5.阳性对照化合物：每次实验均设顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol)两个阳性化合物，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC₅₀值，见图11及下表3。

结果表明：玛咖多糖-锌(II)配合物对DPPH·的清除能力较Vc弱，但对ABTS·的清除能力与Vc接近；玛咖多糖-锌(II)配合物的抗肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7及结肠癌细胞SW480毒株的活性明显优于玛咖多糖的抗上述癌细胞的能力，其抗结肠癌细胞SW480毒株的效果明显优于阳性对照品顺铂。

表3顺铂、紫杉醇及玛咖多糖-锌(II)配合物对抗肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7及结肠癌细胞SW480等毒株的活性半数生长抑制浓度

Claims (9)

1.玛咖多糖-锌(Ⅱ)配合物在制备抗肿瘤药物和/或补锌剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤活性药物为抗肝癌药物、抗乳腺癌药物或抗结肠癌药物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述玛咖多糖-锌(Ⅱ)配合物的制备方法包括以下步骤：

（1）玛咖粗多糖的制备：采用水提醇沉法从玛咖粉中提取玛咖粗多糖；

（2）玛咖粗多糖的分离纯化：依次采用DEAE-52纤维素柱和SephadexG-50凝胶对玛咖粗多糖进行分离纯化，得到精制玛咖多糖；

（3）玛咖多糖-锌(Ⅱ)配合物的制备：

将步骤（2）所得精制玛咖多糖配成水溶液，加入无机锌源后，搅拌，调节溶液的pH为3~7，在50~65℃温度下反应60~100 min，反应结束后，趁热离心，取上清液用3~6倍体积乙醇醇沉过夜，离心得沉淀，烘干，即得玛咖多糖-锌(Ⅱ)配合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中无机锌源中锌的质量与精制玛咖多糖的质量比为1：1~20；所述无机锌源为硫酸锌、氯化锌或醋酸锌。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中所得精制玛咖多糖的重均分子量为7×10³~8×10³。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中调节溶液的pH所用溶液为氢氧化钠溶液或盐酸。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中烘干温度为25~40℃。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中玛咖多糖水溶液的浓度为8~15g/L。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中：无机锌源中锌的质量与玛咖多糖的质量比为1：1~5；玛咖多糖与无机锌源发生配合反应的条件为：pH为3，反应温度为60 ℃，反应60 min。

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