CN112535685A - 多聚adp核糖聚合酶抑制剂治疗乙肝病毒相关疾病的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)抑制剂的药物组合物、用其治疗或者预防肝炎病毒相关疾病的方法及其用途。更具体地，本发明涉及包含(1－(环丙甲酰基)－4－[5－[(3，4－二氢－4－氧代－1－酞嗪基)甲基]－2－氟苯甲酰]哌嗪)的药物组合物、用其治疗或者预防乙型肝炎病毒感染相关性疾病、尤其是乙型肝炎、肝癌、肝硬化的方法和用途。

Description

多聚ADP核糖聚合酶抑制剂治疗乙肝病毒相关疾病的新用途

技术领域

本发明总体上涉及作为治疗或者预防肝炎病毒相关性疾病的治疗剂的多聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)抑制剂。具体地说，本发明涉及用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染相关性疾病的酞嗪酮类化合物、包含其的组合物、治疗方法及其用途。更具体地，本发明涉及用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染相关性疾病的1－(环丙甲酰基)－4－[5－[(3，4－二氢－4－氧代－1－酞嗪基)甲基]－2－氟苯甲酰]哌嗪(又称Olaparib，中文奥拉帕尼)、包含该抑制剂的药物组合物、用其治疗乙型肝炎病毒(Hapatitis BVirus，以下简称HBV)感染相关性疾病、尤其是肝癌的方法及其用途。

背景技术

急性乙型肝炎病毒感染后常常转化为慢性感染，长期乙型肝炎病毒活动造成肝细胞损伤和坏死，并刺激局部免疫反应，引起肝脏病变，包括肝纤维化、肝硬化和肝癌等。

目前还没有对肝癌能稳定地保证一定程度疗效的标准治疗方法，肝癌对化学药物的抵抗性高，即使要达到暂时稳定肿瘤、延长生命的目标都很困难。并且由于动脉内注射的操作难度是临床治疗的重要障碍，因此开发新一代肝癌化学疗法的临床需求特别迫切，其关键是发现能够大力杀伤乙型肝炎病毒阳性肝癌细胞的化学药物。

酞嗪酮类PARP酶抑制剂(包括奥拉帕尼)是一种杂环聚芳醚衍生物，该类物质具有抑制多聚(ADP－核糖)聚合酶(PARP，poly(ADP－ribose)polymerase)家族酶活性的作用。多聚(ADP－核糖)聚合酶家族聚合酶目前有大约18种蛋白。

这些聚合酶蛋白上的催化区都具有一定程度上的同源相关性，但是其功能区则大相径庭(Ame et al.,BioEssays.,26(8):882-893,2004)，导致该家族不同蛋白参与多种生物学功能，其中PARP－1及PARP－2调节的核内多聚(ADP－核糖)链式结构非常重要(Althaus&Richter,ADP-Ribosylation of Proteins:Enzymology and BiologicalSignificance,Springer-Verlag,Berlin,1987)。与DNA关联的活化状态的PARP利用NAD+在目标核蛋白上合成聚ADP核糖链。酞嗪酮类PARP酶抑制剂奥拉帕尼可以应用于治疗或者预防乳腺癌/卵巢癌(US2014/01315973A1，公开日2014年10月23日)。

之前报道，PARP抑制剂可用于治疗与多聚(ADP－核糖)聚合酶(PARP)有关的多种疾病，包括神经退行性疾病(如老年痴呆症、亨廷顿舞蹈病、帕金森病)；糖尿病；缺血或缺血再灌注过程中的并发疾病，如心肌梗死和急性肾衰竭；循环系统疾病，如感染性休克；及炎症性疾病如慢性风湿病等(参见例如CN102964354A，公开日：2013年3月13日)。目前已公开了一系列酞嗪酮类PARP抑制剂的专利申请，包括WO2002036576、WO2004080976和WO200602，均认为酞嗪酮类及其衍生物可能用于以上代谢性、退行性、炎症性和肿瘤等疾病的治疗，但是到目前为止，还没有将酞嗪酮类PARP抑制剂应用到肝炎病毒感染相关性疾病的治疗和/或预防方面的发现。

发明内容

本发明至少部分基于本发明人首次发现：PARP抑制剂酞嗪酮类、尤其是奥拉帕尼(1－(环丙甲酰基)－4－[5－[(3，4－二氢－4－氧代－1－酞嗪基)甲基]－2－氟苯甲酰]哌嗪，又称Olaparib)可显著抑制HBV阳性细胞的生长和增殖，例如其能够显著抑制乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转基因人肝细胞系HL02－H1和表达HBx(乙型肝炎病毒编码X基因)细胞的生长和增殖，对正常未感染乙型肝炎病毒的肝细胞没有药理学意义上的毒性或杀伤作用；此外，本发明人意外地发现，PARP抑制剂酞嗪酮类、尤其是奥拉帕尼可持续稳定地显著降低血清HBV－DNA拷贝数以及乙肝表面抗原(HBsAg)水平。HBV阳性肝癌细胞具有基因损伤修复缺陷，利用低剂量的奥拉帕尼单药能有效抑制HBV阳性肝细胞的增殖。发明人也在小鼠模型中证实奥拉帕尼有效抑制并清除HBV阳性的肝癌细胞。

奥拉帕尼能够在短期内清除活动性乙型肝炎病毒感染细胞，而对未感染HBV或静止期细胞没有明显影响，这使特异清除携带HBV病毒的细胞成为可能。这样既可以压制乙型肝炎病毒的活跃复制，也能避免引起大面积肝损伤。

因此，本发明提供PARP抑制剂酞嗪酮类、尤其是奥拉帕尼治疗或者预防肝炎病毒，特别是乙型肝炎病毒相关性肝病的新用途。

本发明人特别发现乙型肝炎病毒阳性的肝癌细胞对奥拉帕尼特异性地高度敏感，使奥拉帕尼成为乙型肝炎病毒相关肝癌的新一代化学药物。

因此，第一方面，本发明涉及PARP抑制剂酞嗪酮类、尤其是奥拉帕尼可以用于治疗和预防肝炎病毒感染引起的肝胆疾病，包括但不限于肝炎病毒携带者，肝炎病毒感染引起的急性肝炎、慢性肝炎、肝癌、胆管细胞癌。

再一方面，本发明涉及PARP抑制剂酞嗪酮类、尤其是奥拉帕尼可以用于治疗和预防乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的肝胆疾病，包括但不限于乙型肝炎病毒(HBV)携带者，HBV感染引起的急性肝炎、慢性肝炎、肝癌、胆管细胞癌、乙肝病毒(HBV)感染导致的生理异常(例如生理指标异常，循环系统症状，消化系统症状等)。

另一方面，本发明提供用于杀伤携带乙型肝炎病毒(HBV)宿主细胞的新型有效的化学药物酞嗪酮类PARP抑制剂、特别是1－(环丙甲酰基)－4－[5－[(3，4－二氢－4－氧代－1－酞嗪基)甲基]－2－氟苯甲酰]哌嗪，从而清除乙型肝炎病毒患者体内的被HBV感染的细胞。在相同药物浓度下，酞嗪酮类PARP抑制剂对未感染HBV的正常肝细胞没有毒性或杀伤作用。

本发明的另一目标是提供应用奥拉帕尼治疗或者预防慢性乙型肝炎病毒感染患者的方法，包括乙型肝炎病毒感染滴度和病毒载量的控制，所述方法包括给予所述患者有效量的奥拉帕尼。

本发明的再一目标是提供应用奥拉帕尼治疗或者预防肝炎病毒、尤其是乙肝病毒感染性肝纤维化、肝硬化患者的方法和用途，所述方法包括给予所述患者有效量的奥拉帕尼。

本发明再一目标是提供应用奥拉帕尼治疗或者预防晚期肝纤维化、肝硬化患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的奥拉帕尼。

本发明的特征还在于低剂量的奥拉帕尼在乙型肝炎病毒阳性的肿瘤治疗中的应用，包括乙型肝炎病毒阳性的肝细胞肝癌/胆管细胞癌等。

本发明的特征之一在于奥拉帕尼在乙型肝炎病毒阳性的肿瘤治疗中的联合用药，包括奥拉帕尼与放疗和铂类抗癌药物的联合应用。

本发明的目标之一提供一种包含多聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)抑制剂的组合物，其用于治疗或者预防肝炎病毒相关疾病。

在本发明方案中，所述PARP抑制剂为酞嗪酮类化合物。

在本发明中，所述酞嗪酮类化合物是奥拉帕尼(1－(环丙甲酰基)－4－[5－[(3，4－二氢－4－氧代－1－酞嗪基)甲基]－2－氟苯甲酰]哌嗪)或其药学上可接受的盐或酯。

在本发明药物组合物中，其包含1－45mg低单位剂量的PARP抑制剂。

在本发明方案中，PARP抑制剂酞嗪酮类化合物用于制备用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染性相关疾病的药物。

在本发明方案中，其中所述乙型肝炎病毒感染性相关疾病是急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌、胆管细胞癌、乙肝病毒感染导致的生理异常(例如生理指标异常，循环系统症状，消化系统症状等)。

在本发明方案中，所述PARP抑制剂酞嗪酮类药物用于治疗或者预防肝炎病毒感染性相关疾病，更优选乙型肝炎病毒感染性疾病，更优选乙型肝炎病毒携带者，再优选乙型肝炎病毒感染，最优选乙型肝炎病毒感染相关性急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌、胆管细胞癌。

在本发明方案中，其中所述药物可以通过口服或者胃肠外途径给予。

在本发明方案中，其中所述药物与其它治疗肝炎病毒感染性相关疾病的药物联合应用。

在本发明方案中，其中所述其它药物选自抗癌药物，优选所述抗癌药物为铂类、喜树碱或HDAC(组蛋白去乙酰化酶，histone deacetylase)抑制剂。

本发明还提供一种治疗或者预防肝炎病毒感染性相关疾病的方法，其包括给予有效量的包含所述PARP抑制剂酞嗪酮类的组合物。

在本发明中，肝炎病毒感染包括但不限于乙型肝炎病毒(HBV)感染。

在本发明中，肝炎病毒感染性相关疾病指的是所述肝炎病毒感染引起的各种疾病，包括但不限于肝炎病毒携带者、急慢性感染、肝纤维化、肝硬化、肝癌等。

在本发明中，肝炎病毒感染性相关疾病为乙型肝炎病毒感染性疾病，更优选乙型肝炎病毒携带者，再优选乙型肝炎病毒感染，最优选乙型肝炎病毒感染相关性急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌、胆管细胞癌。

在本发明中，其还包括进一步给予其它肝炎病毒感染性相关疾病药物，优选铂类、喜树碱或HDAC抑制剂。

在人－裸小鼠的HBV阳性肝细胞、肝硬化、肝纤维化、肝癌等模型中，奥拉帕尼具有显著的治疗和预防效果。

进一步地，针对HBV阳性的转基因肝细胞的增殖进行奥拉帕尼单药及与放疗、铂类、喜树碱、HDAC抑制剂、或者它们的组合联合用药。在人－裸小鼠模型中进行奥拉帕尼单药及与放疗、铂类、喜树碱、HDAC抑制剂等联合用药，检测模型中乙型肝炎病毒阳性的肝细胞的增殖达到显著抑制。

在针对HBV阳性肝细胞的增殖进行奥拉帕尼单药及与放疗、铂类、喜树碱、HDAC抑制剂、或者它们的组合联合用药。奥拉帕尼单药在终浓度1.5μM浓度即可达到存活率低于1‰。

在HBV阳性肝细胞、肝癌的人－裸小鼠模型中进行奥拉帕尼单药及与与放疗、铂类、或者它们的组合联合用药是显著有效的。

本领域技术人员认为可与奥拉帕尼联合用药的种类包括各种干扰DNA代谢、复制和修复的药物，包括铂类(但不限于顺铂和卡铂)、喜树碱类、阿霉素、蒽环类抗肿瘤药物等。

在本申请中，低单位剂量的PARP抑制剂酞嗪酮类(例如奥拉帕尼)是指1－40mg低单位剂量(本发明中动物学实验所涉及的奥拉帕尼单药剂量根据药剂学标准体重动物剂量换算系数进行小鼠－人剂量换算后为每日用药量为639mg，比奥拉帕尼药物使用说明书中推荐每日应服剂量800mg低近20％；同样经过换算后在双药动物模型实验中奥拉帕尼的最低有效使用剂量为156.5mg，比奥拉帕尼药物使用说明书中推荐每日应服剂量800mg低80％以上。本发明中正在进行中的后续动物实验更进一步暗示奥拉帕尼有更低剂量的应用，因此本发明中有极佳理由申请小于市面已存在的50mg规格胶囊的更低剂量药物规格)，优选1－40mg、更优选5－35mg、更优选10－30、再优选15－20mg在本发明中，1－40mg低单位剂量的PARP抑制剂包括所述范围内任何单个剂量，例如1mg和40mg单位剂量。

附图说明

图1.奥拉帕尼诱导乙型肝炎病毒全基因组转基因人肝细胞系HL02－H1细胞和表达HBx(乙型肝炎病毒编码X基因)肝细胞的染色体断裂，但对非乙肝阳性的人肝细胞株HL－7702细胞没有明显影响。上图显示HL02－H1与人肝细胞株HL－7702在奥拉帕尼处理细胞24小时后，制备的中期染色体。箭头所示为明显的星状染色体和畸变染色体。下图是上述实验的统计结果，显示奥拉帕尼显著提高HL02－H1和HL－7702－HBx细胞中星状染色体的发生数量。

图2.奥拉帕尼对HL02－H1细胞模型的药理实验。HBV显著提高HL02－H1细胞对奥拉帕尼的敏感度。奥拉帕尼对HBV阳性细胞(HL02－H1)的杀伤效率较HL－7702细胞的杀伤效率高近500倍左右。奥拉帕尼与常规化疗药物顺铂、卡铂双药联用的情况下，呈现出高度协同效应。

图3.MTT法检测奥拉帕尼对乙肝阳性肝癌细胞系HepG2.2.15的影响，奥拉帕尼可显著抑制HepG2.2.15生长。

图4.奥拉帕尼单药及与铂类联合用药均可显著抑制人－无胸腺裸鼠肿瘤模型中由乙型肝炎病毒全基因组转基因人肝细胞系HL02－H1细胞所形成的移植瘤生长。

图5.使用奥拉帕尼有效降低乙肝病毒小鼠模型中的血清病毒水平，并能奥拉帕尼停药后20天仍然保持病毒水平在阳性临界值以下的低水平状态。

图6.使用奥拉帕尼有效降低乙肝病毒小鼠模型中的血清病毒抗原水平，并且奥拉帕尼停药后20天仍然保持病毒水平在阳性临界值以下的低水平状态。

具体实施方式

以下非限制性实施例用来阐明本发明的选定实施方案。应当理解的是，所示组分的比例变化和备选要素对本领域技术人员而言是显而易见的，因此是落入本发明实施方案的范围内的。

下列实施例中HL－7702细胞系(人肝细胞，又名L－02，中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，编号：GNHu6)，HepG2(人肝癌细胞，或名HEPG2，ATCC保藏号为HB－8065)，HepG2.2.15(HBV全基因组转染受体细胞HepG2所得稳定细胞系)，裸鼠(BALB/c－Nude，SPF级，雌性，来源于四川大学实验动物中心)为本发明中实验用，不作为其他用途。实施例中使用的奥拉帕尼(KU0059436，Selleck)、顺铂(cisplatin，131102，Supertrack Bio－pharmaceutical)、卡铂(carboplatin，H20020180，齐鲁制药有限公司)，乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(S10910113，上海科华生物工程股份有限公司)，乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒(S20030059，海科华生物工程股份有限公司)。各种抗体和各种化学试剂均为商购产品，为本发明中实验用，不作为其他用途。

实施例1奥拉帕尼提高HL02－H1细胞中染色体断裂几率

1.乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转基因人肝细胞系HL02－H1

HL－7702细胞在5cm×5cm培养瓶中培养至密度达90％。经胰酶消化后，重新铺盘至6cm培养皿中共3盘，过夜培养。每盘细胞转入10μg pcDNA3.1－HBV－wholeGenome质粒，转染过程如下：将10μg质粒与TurboFect转染试剂(Thermo，#R0531)加入Opti－MEM无血清培养基，混匀，静置20min。将混合液加入过夜培养的细胞中，48小时后加入G418进行筛选(终浓度800μg/ml)。持续筛选一个月，将存活下来的细胞消化，用完全培养基稀释至4个/ml，将稀释好的细胞培养物加入96孔板中，每孔200μl，保证96孔板内每孔均为单克隆。培养2－3周，待单克隆细胞长满，取100μl上清培养基，用酶联反应试剂盒测定乙肝表面抗原水平，选取OD值测定最高的一孔细胞。消化，放入细胞瓶中扩增，获取HL02－H1稳转细胞系。所述HL02－H1细胞系已经于2015年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Centerfor Type Culture Collection，简称CCTCC，武汉市武昌珞珈山，邮编：430072)，保藏号为：CCTCCC201554。

2.HL－7702－HBx细胞株及其对照细胞株通过慢病毒感染来建立

HL－7702细胞在5cm×5cm培养瓶中培养至密度达90％。胰酶消化后，并重新铺盘至3.5cm培养皿中共铺12盘。密度约25％。37℃，5％CO2培养箱过夜培养。次日用携带HBx基因和空载体的对照(pLV)慢病毒进行感染(HBx及空质粒对照(PLV)慢病毒根据吉凯基因慢病毒包装转染试剂盒中说明进行包装)，建立HL－7702－pLV，HL－7702－HBx细胞系。空质粒对照(PLV)慢病毒根据吉凯基因慢病毒包装转染试剂盒中说明进行包装，将病毒液感染HL－7702细胞系。

3.奥拉帕尼对HBV阳性细胞HL02－H1和HL－7702－HBx的特异性细胞毒性作用。

取HL－7702、HL02－H1、HL－7702－pLV及HL－7702－HBx细胞，分别接种至2个6cm培养皿，待细胞贴壁，每个细胞系中取一盘加入1μM奥拉帕尼，另一盘用于加药对照加入等体积的DMSO，处理过夜。次日加入终浓度200ng/ml的秋水仙素。处理1.5小时，根据以下步骤固定细胞制片：胰酶消化，PBS清洗1次。去除废液，剩余200μl混匀细胞。加入6ml37℃预热的75mMKCl，加入过程中轻摇样品以免细胞结块。37℃温育16－25min。温育后的样品中加入200μl甲醇与冰醋酸混合固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)，混匀，1000rpm，离心10min。去上清，用剩余50μl残余液混匀细胞，继续加入甲醇与冰醋酸固定液5ml，轻混，4℃静置20min。1000rpm，离心10min，剩余少许固定液，重悬细胞。重复步骤3－5固定细胞3次。最后一次离心后留取500μl固定液，4℃静置保存(样品可保存一周)。将载玻片用酒精侵泡冲洗处理2－3次，加少许双蒸水置于－20℃冰冻10min。将固定好的细胞液从＞20cm处滴落至预先处理好的冰片上，晾干玻片。晾干的玻片用吉姆萨染色液染色染色10min。冲掉多余染色液，晾干玻片，滴加树脂封片。封片用正置显微镜100倍下观察拍照并进行计数。

实验结果：图1显示HL－7702、HL02－H1、HL－7702－pLV及HL－7702－HBx细胞在DMSO和奥拉帕尼处理后的染色体异常状况及其统计结果。HL02－H1、HL－7702－HBx细胞中星状染色体和畸变染色体的数目远高于对照组HL－7702、HL－7702－pLV，这种异常是由于细胞在遭遇DNA断裂时倾向将断裂的末端简单地重新连接在一起形成，具有极高的细胞毒性，大量积累可以造成细胞死亡。在加入奥拉帕尼后HL02－H1、HL－7702－HBx细胞中星状染色体和畸变染色体的数目与对照组之间的差距更加显著(统计学检验＊＊＊：p＜0.001)。可见奥拉帕尼可明显提高HL02－H1和HBx细胞中星状染色体的发生数量，因此可预期奥拉帕尼具有特异性有效杀死HBV阳性增殖细胞的作用。

实施例2奥拉帕尼显著抑制乙型肝炎病毒全基因组转基因人肝细胞系HL02－H1细胞增殖

为了进一步证实奥拉帕尼对HBV阳性细胞增殖的抑制作用，利用克隆形成实验测试奥拉帕尼对HBx阳性恶性肝细胞HL02－H1的抑制作用。

将作为对照组的细胞HL－7702以及HBV阳性的HL02－H1细胞接种进10cm直径培养皿中，待细胞贴壁后加入药物或相同体积的DMSO作为对照。37℃，5％CO₂培养10天，之后用甲醇固定细胞，根据吉姆萨染液试剂盒说明书染色，并计算克隆数。所需铺盘总数按照药物梯度浓度需要确定。奥拉帕尼单药终浓度为0、0.25、0.5、1、1.5μM，与之联合用药的顺铂剂量为终浓度0.1、0.05、0.025、0.001、0.005μM，卡铂剂量为0.25、0.5、0.75、1μM。奥拉帕尼为0.25μM，对照组中为0μM。其中奥拉帕尼为持续给药，顺铂及卡铂为24小时给药处理。

计数结果见图2.

实验结：通过以上数据可以看出本实验中无论单药还是双药联合使用，奥拉帕尼对HL02－H1细胞在低剂量下具有明显抑制作用。本实验中奥拉帕尼在1.5μM浓度时对HL02－H1细胞杀死率达99％以上，而目前文献报道中乙肝病毒阴性细胞系的同类型实验用药剂量达2μM时，细胞存活率仍高达20％以上(J Biol Chem,2011,286:12157-12165，2010)；双药实验中奥拉帕尼浓度为0.25μM，剂量比单药使用剂量进一步降低；顺铂用量低于目前大多数文献报道同类型细胞毒实验所用剂量中最低浓度(1-10μM，MatrixStiffness Modulates Proliferation,Chemotherapeutic Response and Dormancy in

Hepatocellular Carcinoma Cells

Schrader,Timothy T Gordon-WalkerHepatology.2011April；53(4)；Aurora-A promotes chemoresistance in hepatocelluarcarcinoma by targeting NF-kappaB/microRNA-21/PTEN signaling pathway；KaiZhang,Jing Chen,Oncotarget.2014Dec；5(24):12916–12935)的1－10％的浓度下，即0.1μM的浓度，即可以对HL02－H1细胞达到99.9％以上的抑制率。卡铂剂量在绝大多数文献中，只有至少达到5μM以上才能产生明显的抑制效果(抑制率60－90％)。而本实验中卡铂剂量达到0.5μM即可达到抑制率90％，当剂量进一步达到1μM，抑制率可达到99％以上，这种情况在目前所有卡铂相关的细胞毒实验中是非常罕见的，说明卡铂在与奥拉帕尼共用时对乙肝病毒细胞株HL02－H1具有高度协同杀伤作用(根据CI公式计算二者为高度协同作用)。而作为对照组的HBV阴性的正常肝细胞在单药和双药实验中同等用药浓度下存活率在药剂学意义上处于不受影响的范围内。根据我们的结果，要获得99.8％以上的HL02－H1细胞抑制率，需奥拉帕尼单药用药浓度：ICX，A＝1200nM，顺铂单药用药浓度：ICX，B＝600nM；而联合用药下奥拉帕尼用药浓度为DA＝250nM，顺铂用药浓度为DB＝100nM。根据以上数据计算药理学实验中联合作用指数(combinedindex，CI)：CI0＝DA/ICX，A+DB/ICX，B＝250/1200+100/600＝0.375,0.2≤CI0＜0.4，由此可确定两种药物之间为强协同作用。

实施例3.奥拉帕尼对乙肝病毒阳性肝癌细胞(HepG2.2.15)的杀伤作用实验方法

收集对数期肝癌细胞HepG2及HepG2.2.15细胞，利用细胞计数板计数，调整细胞悬液浓度，将两种细胞分别加入两板96孔板，每孔加入100ul，调整细胞调密度1000个/孔，边缘孔用无菌PBS填充。5％CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入梯度浓度的奥拉帕尼，使每孔中药物终浓度为0、2、2.5、3.5、4.5μM。每孔设3个复孔。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)。在5％CO2，37℃条件下孵育16－48小时后，在每孔中加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD值490nm处测量各孔的吸光值。酶标读数，根据HepG2及HepG2.2.15细胞的标准生长曲线方程将OD值换算为存活细胞数，绘制在不同浓度的奥拉帕尼作用下细胞存活率图表。

实验结果：实验结果显示当奥拉帕尼作用终浓度达到2.5μM以上，HepG2.2.15细胞系存活率与HepG2有明显差异(＊＊＊P＜0.001)，如图3所示。这个结果证明奥拉帕尼针对于HBV阳性的肝癌细胞有极为有效的抑制效果。

实施例4单独使用奥拉帕尼或与铂类化疗药物联合使用都能显著抑制裸鼠中由HL02－H1细胞所形成的移植瘤生长

随机挑选4－8周龄的无胸腺雌性裸鼠20只，分为4组，接种HL02－H1细胞于双腋下和双腹股沟处，每个注射点大约4x10⁶个细胞。待HL02－H1诱导成瘤体积约3－4mm³时开始注射药物。药物用量参照临床剂量后适当降低(根据药理学换算系数进行人－小鼠换算后确定)，药物剂量如下：奥拉帕尼单药用量为131.5mg/kg/天。与铂类等具DNA损伤作用的基因毒性化疗药物联合用药实验中奥拉帕尼32mg/kg/天)，顺铂(0.21mg/kg/4天)。对照组DMSO体积与奥拉帕尼组相同。单药实验连续注射9天，在注射药物3、6、7、8、9天测量肿瘤体表处的长、宽、高；双药实验连续注射14天，在0、7、9、12、14天测量肿瘤长、宽、高。根据椭圆体计算公式：椭圆体积＝长×宽×高×3.14/6计算肿瘤体积大小。并根据肿瘤抑制率＝(对照组肿瘤体积－用药组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100％计算出各用药组的抑制率，绘制图表。图4是不同药物处理下肿瘤体积的变化。

实验结果：在单药组，HL02－H1诱导的肿瘤一直被抑制，甚至有消退现象。而在双药实验中，顺铂日均用量约为其他动物学实验模型中用药量的约1/5(顺铂腹腔注射小鼠用药量通常为2mg/kg/2天，间日给药，参见李山平等，脉血康联合顺铂对荷MHCC97H人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响，《中华中医药学刊》2010年第28卷009期；或用药量为：4mg/kg/4天，参见The Role of Proline Rich Tyrosine Kinase 2(Pyk2)on CisplatinResistance in Hepatocellular Carcinoma，Wei Geng,Kevin T.P.Ng,Chris K.W.PLoSOne.2011；6(11))，奥拉帕尼为45％左右的低剂量情况下(根据ToC，等人小鼠实验模型中，奥拉帕尼的有效剂量为200mg/kg/d，而奥拉帕尼临床用药量为800mg/kg，参见To&Kim，ThePARP inhibitors,veliparib and olaparib,are effective _chemo preventive agentsfor delaying mammary tumor development in B RCA1-deficient mice，CancerPrevention Research 7:698-707,2014；Kaufman&Shapira-Frommer,Olaparibmonotherapy in patients with ad vanced cancer and a germline BRCA1/2mutation.Journal of Clini cal Oncology 33(3):244-250,2015)，依然可以有效的抑制HL02－H1诱导的肿瘤，根据实验数据进行方差分析，确定奥拉帕尼1.64mg/只/天，顺铂0.015mg/只/天的剂量下，两种药物具有协同作用。

实施例5.使用奥拉帕尼能有效降低乙肝病毒小鼠模型中的血清病毒水平，并在停止用药后也能抑制病毒水平回升

实验方法：小鼠随机分为4组，每组5只。每只小鼠注射带有HBV全基因组的HepG2.2.15细胞(注射4个点，腋下腹股沟分别注射4x10⁶个细胞)。随后每隔4天抽取尾静脉血100μl，利用荧光定量PCR确定血液中HBV拷贝数，当HBV－DNA拷贝数至10⁵开始用药。按人体推荐剂量，每只小鼠用药量如下：奥拉帕尼，168mg/kg/天；恩替卡韦(entecavir)，0.07mg/kg/天；拉夫米定(lamivudine)，1.6mg/kg/天。对照组注射与奥拉帕尼相同体积的DMSO。连续10天给药，每天抽取约200μl尾静脉血，通过用荧光定量PCR确定血液中HBV拷贝数，第11天停药。以给药起始日作为0天算起。在第15、20、25、28、30天各抽尾静脉血200μl利用荧光定量PCR确定血液中HBV拷贝数，确定小鼠血液中HBV拷贝数的改变情况。

实验结果：血清中HBV－DNA的拷贝数检测是评估各类HBV相关性肝病治疗药物效果最直接可靠的方法。根据《2000年拉米夫定临床应用指导意见》，中国慢性乙型肝炎病毒感染病人治疗的目的主要就是降低血清HBVDNA，使谷丙转氨酶(ALT)正常化，改善肝脏组织学病变，降低肝硬化和肝癌的发生率。如图5所示，在小鼠模型的血清HBV－DNA含量达到临床规定的临界阳性时(HBV－DNA拷贝数至10⁵时)开始用药，奥拉帕尼及现在临床上最为常用的核苷类肝病药物恩替卡韦(entecavir)和拉夫米定(lamivudine)均可以在10天内将血清HBV－DNA的水平控制在临床阴性范围之内。但是停药后20天内，恩替卡韦和拉夫米定用药组小鼠的血清HBV－DNA水平逐步回升到了阳性水平；而奥拉帕尼组小鼠的的血清HBV－DNA水平则一直处于稳定的阴性范围之内。DMSO对照组中血清HBV－DNA含量一直处于阳性临界值以上。这表明奥拉帕尼在治疗HBV阳性的各类肝病中克服了目前用于乙型肝炎病毒感染相关性疾病的所有核苷类抗病毒临床药物的最大弱点：虽然能降低病毒复制，但不能清除感染细胞，稳定降低机体感染水平。

实施例6.使用奥拉帕尼能有效降低乙肝病毒小鼠模型中的血清病毒抗原水平，并在停止用药后也能抑制病毒抗原回升

实验方法：小鼠随机分为4组每组5只。每只小鼠注射HepG2.2.15细胞(注射4个点，腋下腹股沟分别注射4x10⁶个细胞)。之后每隔4天抽取尾静脉血100μl，利用荧光定量PCR确定血液中HBV拷贝数，当HBV－DNA拷贝数至10⁵开始用药。小鼠给药后第1－5、15、20天的血样200μl，室温静置2－3小时候后3000rpm离心20min，取血清，根据乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒说明书进行检测HBV抗原HBsAg水平。根据所得OD值绘制图表。

实验结果：图6显示，通过小鼠尾静脉采血分离血清进行ELISA连续监测血清中HBsAg水平，发现用药后，奥拉帕尼及现在临床上最为常用的核苷类肝病药物恩替卡韦(entecavir)和拉夫米定(lamivudine)均可以在5天内使HBsAg下降到临床HBsAg阴性临界水平。在停药后20天内，恩替卡韦和拉夫米定用药组小鼠的HBsAg水平逐步回升，但奥拉帕尼组小鼠的HBsAg水平则一直处于稳定的阴性范围之内。这也表明与恩替卡韦和拉夫米定的短期药效不同，奥拉帕尼能清除感染细胞，稳定降低机体感染水平。

Claims (7)

1.一种包含多聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)抑制剂的组合物，在制备治疗或者预防肝炎病毒感染疾病药物中的用途。

2.如权利要求1所述的组合物，所述肝炎病毒感染疾病为乙型肝炎病毒感染疾病。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述PARP抑制剂为酞嗪酮类化合物。

4.如权利要求3的组合物，所述酞嗪酮类化合物是(1－(环丙甲酰基)－4－[5－[(3，4－二氢－4－氧代－1－酞嗪基)甲基]－2－氟苯甲酰]哌嗪)。

5.如权利要求1－5所述任一项的组合物，为包含1－40mg低单位剂量的PARP抑制剂单位剂型。

6.如权利要求2所述的组合物，所述乙型肝炎病毒感染疾病，进一步包含乙型肝炎病毒感染性相关疾病。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒感染性相关疾病选自急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌和胆管细胞癌。

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