CN112501155A - 一种应用于转基因小鼠基因鉴定的dna提取试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒，包括：组织裂解液、蛋白酶K、结合液、吸附微球、洗涤液、洗脱液，所述吸附微球为直径50～100μm的二氧化硅微球。与传统的试剂盒相比，本发明试剂盒价格低廉、操作步骤少、提取纯度高，所使用的试剂无毒害且安全稳定，适合用于大批量提取小鼠尾尖及脚趾DNA。还公开了使用上述试剂盒进行小鼠组织基因组DNA的高通量提取的方法。所提供的提取方法简化了操作流程、缩短了实验时间，所提取的DNA质量完全满足后续PCR的要求。显著提高转基因小鼠基因鉴定的效率。

Description

一种应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒。

背景技术

随着基因编辑技术发展成熟，转基因小鼠应运而生，目前国内外许多学者已经利用转基因小鼠开展研究工作。随着转基因技术的迅猛发展，转基因小鼠价格不再昂贵。因此，国内许多实验室转基因小鼠的品系和数量逐渐增加。而纯合子转基因小鼠的获得需要通过杂合子亲代杂交，所以转基因小鼠的基因鉴定工作——包括DNA提取和PCR扩增——就变成了乏味的重复性工作。

传统的DNA提取方法包括酚/氯仿提取法和磁珠吸附法等。这些方法虽然能够获得较高纯度的组织DNA，但是具有操作步骤多、使用试剂量大、成本高等缺点，并且使用的试剂可能存在挥发性大、对人体有毒害作用的问题。例如现有技术中提供了一种可应用于从动物组织中高通量提取基因组DNA的试剂盒及提取方法，该技术使用的裂解液成分包括异硫氰酸胍、Triton-100等对人体危害较大的试剂。另一份现有技术中，其结合液同样使用了异硫氰酸胍，也会对使用者带来危害。此外，部分现有技术的结合液包括PEG 8000和异丙醇，还添加了Brij58。Brij58是一种表面活性剂，不仅价格高，使用后还需要经过特殊处理才能排放，否则会污染环境。最重要的是，部分较新的技术方案使用的磁珠为商业化带有磁性的吸附微球，价格昂贵；又或者使用纳米二氧化硅微球作为吸附DNA的载体，使用的微球为纳米级别(5～100nm)，制备难度大，成本同样高昂。因此，急需开发简便、经济、通量高的DNA提取方法。

发明内容

本发明公开了一种应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。

一种应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒，包括：组织裂解液、蛋白酶K、结合液、吸附微球、洗涤液、洗脱液，所述吸附微球为直径50～100μm的二氧化硅微球。

进一步，所述裂解液主要由以下成分组成：0.5～2％SDS、0.1～1M NaCl、0.01～0.5M Tris-HCl、0.05～0.1M EDTA，pH值8.0。本试剂盒为保护操作人员，其裂解液中不含有异硫氰酸胍、Triton-100等对人体危害较大的试剂。

进一步，所述结合液主要由以下成分组成：1～1.5M NaCl、70～80％异丙醇，5～8％PEG 8000，pH值7.0。PEG 8000具有分散微球的作用，异丙醇则起到促进DNA结合作用，从而使得结合液具有更好的结合效果。

进一步，所述二氧化硅微球的浓度为0.4～0.6g/ml，pH值7.5。使用常规二氧化硅粉末(200～300目)自制的微球，成本非常低廉，提取1000个样品所需的微球成本约为10元。二氧化硅的原料来源广泛，常规的销售渠道均能获取，特别适合用于批量提取转基因小鼠组织DNA。

进一步，所述洗涤液主要由以下成分组成：10～15mM Tris、70～75％乙醇，pH值8.0。本试剂盒的洗涤液只需一步洗涤即可满足检测要求，节约时间，适合批量化的提取工作。

进一步，所述洗脱液为超纯水，pH值8.0。

另一方面，本发明公开了使用上述试剂盒进行小鼠组织基因组DNA的高通量提取的方法。包括以下步骤：

(1)裂解组织：取样本0.5～1g置于离心管中，5000rpm离心5min，然后加入裂解液100μl、蛋白酶K 150～200μg，于50～60℃水浴中裂解4～6h，得到混合液A；

(2)结合：向混合液A加入100～200μl结合液和10～20μl吸附微球，充分震荡混匀，置于室温静置30～60min，得到混合液B；

(3)洗涤：向混合液B加入洗涤液600～800μl，充分震荡混匀，5000rpm离心1min，弃去上清液，置于90℃金属浴中加热3～5min，待乙醇挥发完全，得到沉淀物C；

(4)洗脱：向沉淀物C加入预热的洗脱液50～100μl，振荡混匀，室温静置10min，然后13000rpm离心5min，取上清即可。

本发明的有益效果是：

所提供的试剂盒使用强裂解液彻底裂解小鼠组织，释放出DNA，并使用二氧化硅微球吸附DNA，随后只需一次洗涤即可清除盐分及残余蛋白，在高效提取的同时保证DNA的纯度。二氧化硅微球具有价格低廉、吸附效果好的优点。与传统的试剂盒相比，本发明试剂盒价格低廉、操作步骤少、提取纯度高，所使用的试剂无毒害且安全稳定，适合用于大批量提取小鼠尾尖及脚趾DNA。

所提供的提取方法简化了操作流程、缩短了实验时间，所提取的DNA质量完全满足后续PCR的要求。显著提高转基因小鼠基因鉴定的效率。

附图说明

图1是实施例1中T-bet flox小鼠基因鉴定结果；

图2是实施例2中T-bet flox小鼠基因鉴定结果；

图3是实施例3中T-bet flox小鼠基因鉴定结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

下面通过具体实施案例对本发明作进一步说明，实验中所用转基因小鼠背景均为C57BL/6J，PCR引物及方法方法采用美国Jackson实验室推荐的方法，DNA Marker为DL2000，其自上而下带型分子量依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。本发明所采用的设备及试剂原料均为实验室常用的，无特殊要求。

实施例1：试剂盒1配制及应用于T-bet转基因小鼠脚趾DNA提取及基因鉴定。

试剂盒配方1：裂解液包含：0.5％SDS、0.1M NaCl、0.05M Tris-HCl、0.05M EDTA，调pH至8.0。蛋白酶K浓度为：15mg/ml，使用前加入裂解液中。结合液成分组成：1M NaCl、70％异丙醇、5％PEG 8000，调pH至7.0。二氧化硅微球浓度为0.4g/ml，pH为7.0，使用前加入至结合液中，形成微球悬液。洗涤液成分组成：10mM Tris、70％乙醇，调pH至8.0。洗脱液为pH 8.0的超纯水。

使用试剂盒1实施C57BL/6J背景的T-bet flox系列小鼠基因鉴定：

配对的T-bet^fl/+小鼠购于美国Jackson实验室，子代小鼠断奶后剪脚趾进行基因型鉴定。

采用实施例1配制的试剂盒提取幼鼠脚趾DNA，方法为：

(1)裂解液裂解组织：取小鼠脚趾(0.2cm)置于EP管中，5000rpm离心5min，加入裂解液100μl、蛋白酶K 150μg，于56℃水浴中裂解4h；

(2)加入100μl结合液，及10μl吸附微球，充分震荡混匀，置于室温静置30min；

(3)加入洗涤液800μl，充分震荡混匀，5000rpm离心1min，弃去上清液，置于90℃金属浴中加热3min，待乙醇挥发完全；

(4)加入预热的洗脱液100μl，振荡混匀，室温静置10min；

(5)13000rpm离心5min,上清即可用于后续PCR。

基因鉴定：

①引物合成(上海生工)：

F：AGTCCCCCTGGAAGAACACT(SEQ ID No.01)；

R：TGAAGGACAGGAATGGGAAC(SEQ ID No.02)；

②PCR加样：反应体系各为20μl，即2×Taq Master Mix 10μl、F 0.5μl、R 0.5μl、ddH₂O 8μl，模板1μl。

③PCR程序：95℃加热3min，95℃加热30s，60℃加热30s，72℃加热45s顺序进行38个循环，接着72℃加热5min，置4℃暂存，产物取出后可置于-20℃保存。

④PCR产物检测：2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电压为120V，时间为30min。

图1是本实施例小鼠基因鉴定结果，650bp单条带为T-bet^fl/fl小鼠，650bp和470bp双条带为T-bet^fl/+小鼠，470bp单条带为T-bet^+/+小鼠。泳道M为DNA Marker(DL2000)，泳道1为T-bet^fl/+，泳道2为T-bet^fl/+，泳道3为T-bet^fl/+，泳道4为T-bet^fl/+。

实施例2：试剂盒2配制及应用于T-bet转基因小鼠脚趾DNA提取及基因鉴定。

试剂盒配方2：裂解液包含:1％SDS、0.5M NaCl、0.07M Tris HCl、0.08M EDTA。调pH至8.0。蛋白酶K浓度为：17mg/ml，使用前加入裂解液中；结合液成分组成：1.2M NaCl、75％异丙醇、6％PEG 8000，调pH至7.0。二氧化硅微球浓度为0.5g/ml,pH为7.0，使用前加入至结合液中，形成微球悬液；洗涤液成分组成：12mM Tris、72％乙醇，调pH至8.0；洗脱液为pH 8.0的超纯水。

使用试剂盒2实施C57BL/6J背景的T-bet flox系列小鼠基因鉴定步骤与实施例1相同。

图2是本实施例小鼠基因鉴定结果，650bp单条带为T-bet^fl/fl小鼠，650bp和470bp双条带为T-bet^fl/+小鼠，470bp单条带为T-bet^+/+小鼠。泳道M为DNA Marker(DL2000)，泳道1为T-betf^l/+，泳道2为T-bet^+/+，泳道3为T-bet^+/+，泳道4为T-bet^+/+。

实施例3：试剂盒3配制及应用于T-bet转基因小鼠脚趾DNA提取及基因鉴定

试剂盒配方3：裂解液包含：2％SDS、1M NaCl、0.1M Tris-HCl、0.1M EDTA.调pH至8.0。蛋白酶K浓度为：20mg/ml，使用前加入裂解液中；结合液成分组成：1.5M NaCl、80％异丙醇、8％PEG 8000，调pH至7.0。二氧化硅微球为0.6g/ml，pH为7.0，使用前加入至结合液中，形成微球悬液；洗涤液成分组成：15mM Tris、75％乙醇，调pH至8.0；洗脱液为pH 8.0的超纯水。

使用试剂盒3实施C57BL/6J背景的T-bet flox系列小鼠基因鉴定步骤与实施例1相同。

图3是本实施例小鼠基因鉴定结果，650bp单条带为T-bet^fl/fl小鼠，650bp和470bp双条带为T-bet^fl/+小鼠，470bp单条带为T-bet^+/+小鼠。泳道M为DNA Marker(DL2000)，泳道1为T-bet^fl/+，泳道2为T-bet^fl/+，泳道3为T-bet^+/+，泳道4为T-bet^+/+。

以上结果说明配方一、二、三均适用于提取转基因小鼠脚趾和尾尖DNA，提取的DNA质量满足后续PCR鉴定。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学顺德医院（佛山市顺德区第一人民医院）

<120> 一种应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒

<130> 2020

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agtccccctg gaagaacact 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgaaggacag gaatgggaac 20

Claims (7)

1.一种应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒，其特征在于，包括：组织裂解液、蛋白酶K、结合液、吸附微球、洗涤液、洗脱液，所述吸附微球为直径50～100μm的二氧化硅微球。

2.根据权利要求1所述的应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液主要由以下成分组成：0.5～2％SDS、0.1～1M NaCl、0.01～0.5M Tris-HCl、0.05～0.1M EDTA；优选地，所述裂解液的pH为8.0。

3.根据权利要求1所述的应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述结合液主要由以下成分组成：1～1.5M NaCl、70～80％异丙醇，5～8％PEG 8000；优选地，所述结合液的pH为7.0。

4.根据权利要求1所述的应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述二氧化硅微球的浓度为0.4～0.6g/ml，pH为7.5。

5.根据权利要求1所述的应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液主要由以下成分组成：10～15mM Tris、70～75％乙醇；优选地，所述洗涤液的pH为8.0。

6.根据权利要求1所述的应用于转基因小鼠基因鉴定的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为超纯水，pH值8.0。

7.一种小鼠组织基因组DNA的高通量提取方法，其特征在于，使用如权利要求1至6任一项所述的试剂盒按如下步骤进行提取：

(1)裂解组织：取样本0.5～1g置于离心管中，5000rpm离心5min，然后加入裂解液100μl、蛋白酶K 150～200μg，于50～60℃水浴中裂解4～6h，得到混合液A；

(2)结合：向混合液A加入100～200μl结合液和10～20μl吸附微球，充分震荡混匀，置于室温静置30～60min，得到混合液B；

(3)洗涤：向混合液B加入洗涤液600～800μl，充分震荡混匀，5000rpm离心1min，弃去上清液，置于90℃金属浴中加热3～5min，待乙醇挥发完全，得到沉淀物C；

(4)洗脱：向沉淀物C加入预热的洗脱液50～100μl，振荡混匀，室温静置10min，然后13000rpm离心5min，取上清即可。

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