CN112461955A

CN112461955A - 一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法

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Publication number: CN112461955A
Application number: CN202011257443.0A
Authority: CN
Inventors: 李敬来; 彭俊; 张天宏
Original assignee: Guoke Excellent Beijing Pharmaceutical Science And Technology Research Co ltd
Current assignee: Guoke Excellent Beijing Pharmaceutical Science And Technology Research Co ltd
Priority date: 2020-11-12
Filing date: 2020-11-12
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-11-12
Also published as: CN112461955B

Abstract

本发明公开了一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法；采用滤纸采集给药前及给药后多时间点的动物口腔唾液样本，减重法测定唾液采样重量，干燥后放置于‑20℃存放待处理；对所述滤纸中加入饱和EDTAK₂溶液和沉淀剂，所述沉淀剂为甲醇：乙腈按照体积比1:1配置，超声提取10min，涡旋约30s，离心10min取上清液进行LC‑MS/MS分析；建立唾液中米诺环素检测的标准曲线；对所述滤纸中的米诺环素含量进行定量检测。本发明通过采用滤纸吸附唾液，EDTAK₂溶液消除滤纸的金属干扰，以达到降低基质效应的目的。本检测方法验证结果显示准确可靠，回收率高，并对给药后动物唾液样品中药物含量进行测定。

Description

一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法

技术领域

本发明涉及生物样品的检测技术领域，尤其涉及一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法。

背景技术

盐酸米诺环素也称二甲胺四环素盐酸盐，是一种广谱抗菌的四环素类抗生素，可用于治疗牙周炎。本研究拟建立一种快速、灵敏、易操作的检测家兔唾液中米诺环素的药物浓度的方法，以研究药物唾液中动力学过程，制定给药时间间隔并指导药物制剂的开发。

唾液中米诺环素浓度检测方法开发需要克服的障碍主要有1)唾液样品难以定量采集；2)米诺环素易与金属离子络合，影响定量；3)LC-MS/MS法检测中米诺环素易受到基质干扰。因此需要一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决动物唾液中米诺环素的药物浓度检测的方法中样品采集和基质中金属干扰等问题，建立快速、灵敏、易操作的方法，并将验证后的方法应用于家兔给药后米诺环素的唾液药代动力学研究。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明包括以下步骤：

A用滤纸采集给药前及给药后多时间点的服用过受试药物动物口腔唾液样本，减重法测定唾液采样重量，干燥后放置于-20℃存放；

B对所述滤纸中加入饱和EDTAK₂溶液和沉淀剂，所述沉淀剂为甲醇：乙腈按照体积比1:1配置，超声提取10min，涡旋约30s，离心10min取上清液进行LC-MS/MS分析；

C建立唾液中米诺环素检测的标准曲线；

D通过所述标准曲线对所述滤纸中的米诺环素含量进行定量检测，并利用对应的所述唾液样本的取样量，计算唾液中药物含量。

进一步地，所述校准曲线建立的方法包括采用甲醇稀释成系列浓度的米诺环素标准品工作溶液，在空白唾液滤纸滴加10μL各浓度标准曲线工作液(5，10，50，100，500，1000，5000ng/mL)以及50μL内标工作液，干燥后对所述滤纸中加入饱和EDTAK₂溶液和沉淀剂，所述沉淀剂为甲醇：乙腈按照体积比1:1配置，超声提取10min，涡旋约30s，离心10min取上清液进行LC-MS/MS分析，获得的不同唾液浓度的标准曲线样品用于标准曲线分析，以米诺环素含量为横坐标，待测物与内标峰面积比之为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，所得直线回归方程即为标准曲线。

进一步地，所述滤纸为层析滤纸。

进一步地，采集待检测动物的时间段为0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144、168h。

进一步地，待检测动物为中型动物或者大型动物。

与现有技术相比，本发明提供了一种定量检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法，具备以下有益效果：

1、该检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法：通过采用滤纸吸附唾液，减重法定量采样重量，解决了唾液准确采样的难题。以空白唾液建立标准曲线方法学验证，并对唾液样品中药物含量进行测定，用于家兔给药米诺环素后唾液药代动力学的研究；

2、该检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法：唾液样品采用甲醇直接沉淀蛋白的方法后测定米诺环素，回收率不满足方法学和检测灵敏度要求；本发明加入适量EDTAK₂，以减少滤纸、溶液及器皿中金属离子的干扰；采用甲醇：乙腈(1:1)作为沉淀剂对唾液中的米诺环素进行超声提取，减少K₂EDTA带来的基质效应，提高了检测灵敏度。

附图说明

图1为本发明的米诺环素在空白唾液中的标准曲线；

图2为本发明的家兔给药米诺环素后唾液药物浓度-时间曲线图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：家兔给药米诺环素后唾液动力学研究

主要包括以下步骤：

S1、制备米诺环素储备液：

精密称定米诺环素，用甲醇配制内标储备液浓度为1mg/mL，标准品米诺环素为批号IF1800730A，纯度89.9％，广东利玮医药有限公司提供；

制备内标溶液：

精密称定内标七氘代米诺环素，用甲醇配制内标储备液浓度为1mg/mL，精密量取储备液，用甲醇逐步稀释成浓度为1000ng/mL的内标溶液备用；内标七氘代米诺环素为批号36936，纯度95％，广东谱恩科学仪器有限公司提供；

S2、滤纸采集唾液样品：

将1只家兔编号并称重，米诺环素给药剂量：1mg/只。给药前禁食12～18小时，自由饮水。唾液采集时间点为：于给药前及给药后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144、168h。取干燥的层析滤纸片称重，沾取唾液后再次称重，减重法称量唾液重量，并将采样滤纸置于EP管中，浓缩离心仪挥干(25℃)后放置于-20℃冰箱存放待处理。

S3、标准曲线绘制

取米诺环素标准品储备液，用甲醇稀释成系列浓度的米诺环素标准品工作溶液，取上述标准曲线工作液各10μL于沾有空白家兔唾液的滤纸上，获得Minocycline的不同唾液浓度的标准曲线样品(0.05，0.1，0.5，1，5，10，50ng)，用于标准曲线分析，再分别滴加50μL的内标溶液(1000ng/mL)后继续置于离心浓缩仪中挥干(25℃)，然后向EP管中加入30μLEDTAK₂饱和溶液和400μL沉淀剂(甲醇：乙腈(1:1))，涡旋约30s，将EP管置于超声波清洗机中超声提取10min；离心10min(4℃，20200g)，取100μL上清液进行LC-MS/MS分析。

以米诺环素含量为横坐标，待测物与内标峰面积比之为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，所得直线回归方程即为标准曲线；

结果显示唾液中米诺环素含量在0.05～50ng范围时，含量与相应比呈良好的线性关系参照图1，相关系数r为0.9977，定量下限为0.05ng；

S4、未知唾液样品处理：

取出S2获得的样品，向滤纸上滴加50μL内标工作液(1000ng/mL IS工作液)后继续置于离心浓缩仪中挥干(25℃)，然后向EP管中加入30μL EDTAK₂饱和溶液和400μL沉淀剂(甲醇：乙腈(1:1))，涡旋约30s，将EP管置于超声波清洗机中超声提取10min，涡旋约30s，离心10min(4℃，20200g)，取100μL上清液进行LC-MS/MS分析。

S5、根据S3的LC-MS/MS分析结果获得的标准曲线，分别对步骤S4中的唾液样品中的米诺环素进行定量；所得到的结果分别除以各自唾液重量，获得该时刻唾液中药物浓度，唾液药物浓度计算见公式(1)。图2为家兔给药米诺环素(1mg/只)后唾液中药物含量的动力学曲线。实验结果证明此技术方法灵敏，可用于评价药物的唾液分布。

C＝M/m (1)

C：唾液中药物浓度；

M：经标准曲线计算得到的唾液中的药物含量；

m：滤纸减重法得到的唾液实际重量；

在本实施例子中，所述滤纸为层析滤纸。分别对沾取空白唾液的定量滤纸、定性滤纸、层析滤纸进行低、高两个浓度的加标回收实验。实验结果见表1，由于层析滤纸所含的灰分含量最低，使得米诺环素收到金属离子影响最小，且回收率对待测化合物浓度无依赖性，因此选择层析滤纸作为实验沾取唾液的滤纸。

表1.沾取家兔唾液样品滤纸的选择

为了进一步表明滤纸中加入过量EDTAK₂对唾液中米诺环素测定的影响，分别对加入EDTAK₂与不加入EDTAK₂的唾液样本进行低、中、高三个浓度的加标实验，结果见表2。通过比较样品中米诺环素的峰面积响应，可以看出加入EDTAK₂后的米诺环素的响应远远高出不加EDTAK₂的样品。

表2.EDTA对家兔唾液样品中米诺环素的影响

唾液样品采用甲醇或乙腈直接超声提取的方法后测定米诺环素，不满足方法学和检测灵敏度要求；本发明考察了不同沉淀剂的提取效率，结果(见表3)显示，采用甲醇：乙腈(1:1)超声提取后，减少EDTAK₂的色谱共流出干扰，提高样品提取处理效率，进而提高了检测灵敏度。

表3.沉淀剂对家兔唾液样品中米诺环素的影响

在本实施例子中通过对唾液样本进行不同处理，进行了基质效应和回收率的考察：

回收率处理方法A：取装有沾取家兔空白唾液滤纸EP管，向滤纸上滴加低、中、高三个浓度的工作液(15，150，4000ng/mL)各10μL和50μL的内标溶液(1000ng/mL)后继续置于离心浓缩仪中挥干(25℃)，然后向EP管中加入30μL EDTAK₂饱和溶液和400μL沉淀剂(甲醇：乙腈(1:1))，涡旋约30s，超声提取10min后，离心10min(4℃，20200g)，取上清液进行LC-MS/MS分析。

回收率/基质效应处理方法B：取装有沾取家兔空白唾液滤纸EP管加入30μL饱和EDTAK₂溶液和400μL甲醇：乙腈(1:1)，涡旋(约1min)后超声提取10min，再分别加入低、中、高三个浓度的工作液(15，150，4000ng/mL)各10μL和50μL的内标溶液(1000ng/mL)，涡旋约30s，离心10min(4℃，20200g)，取上清液进行LC-MS/MS分析。

基质效应处理方法C：取装有沾取空白水溶液滤纸的EP管加入30μL饱和EDTAK₂溶液和400μL甲醇：乙腈(1:1)，涡旋(约1min)后超声提取10min，再分别加入低、中、高三个浓度的工作液(15，150，4000ng/mL)各10μL和50μL的内标溶液(1000ng/mL)，涡旋约30s，离心10min(4℃，20200g)，取上清液进行LC-MS/MS分析。

比较B、C两种处理方式下，Minocycline和IS的峰面积比值。计算Minocycline在低(L)、中(M)、高(H)三个浓度下经内标校正的基质因子。结果见表4.

在本实施例子中唾液样本的制备方法：以每一浓度A、B两种处理方法的峰面积比值计算回收率。结果见表5，采用该技术发明方法处理样品，回收率高，基质干扰弱，可用于唾液中米诺环素的定量检测。

表4唾液中米诺环素的基质效应

表5唾液中米诺环素的回收率

针对以上问题，本发明采用滤纸取样法采集家兔唾液；加入EDTAK₂消除金属络合；优化有机溶剂处理过程，获得满意的检测方法，验证后的方法成功应用于家兔给药后米诺环素的唾液药代动力学研究。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

B对所述滤纸中加入饱和EDTAK2溶液和沉淀剂，所述沉淀剂为甲醇：乙腈按照体积比1:1配置，超声提取10min，涡旋约30s，离心10min取上清液进行LC-MS/MS分析；

C建立唾液中米诺环素检测的标准曲线；

2.根据权利要求1所述的一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法，其特征在于，所述校准曲线建立的方法包括采用甲醇稀释成系列浓度的米诺环素标准品工作溶液，在空白唾液滤纸滴加10μL各浓度标准曲线工作液(5，10，50，100，500，1000，5000ng/mL)以及50μL内标工作液，干燥后对所述滤纸中加入饱和EDTAK₂溶液和沉淀剂，所述沉淀剂为甲醇：乙腈按照体积比1:1配置，超声提取10min，涡旋约30s，离心10min取上清液进行LC-MS/MS分析，获得的不同唾液浓度的标准曲线样品用于标准曲线分析，以米诺环素含量为横坐标，待测物与内标峰面积比之为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，所得直线回归方程即为标准曲线。

3.根据权利要求1所述的一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法，其特征在于，所述滤纸为层析滤纸。

4.根据权利要求1所述的一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法，其特征在于，采集待检测动物的时间点为给药后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144、168h。

5.根据权利要求1所述的一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法，其特征在于，受试个体为中大型动物。

6.根据权利要求1所述的一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法，其特征在于，所述受试药物为易与金属络合的化合物，包括四环素类抗生素。