CN112438912A - 含有松露蘑菇提取物的发酵物作为有效成分的化妆品组合物 - Google Patents

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Abstract

含有松露蘑菇提取物的发酵物作为有效成分的化妆品组合物。本发明涉及一种含有松露蘑菇提取物的发酵物作为有效成分的组合物，根据本发明的组合物促进FOXO3或SIRT1的活性以具有改善皱纹或增强皮肤弹性效果。本发明的松露蘑菇提取物的发酵物的用途，其特征在于，用于制备用于改善皱纹的化妆品。

Description

含有松露蘑菇提取物的发酵物作为有效成分的化妆品组合物
技术领域
本发明涉及一种含有松露蘑菇提取物的发酵物作为有效成分的化妆品组合物。
背景技术
作为皮肤表面的形状的皮肤纹理的特征在于由细线形成的三维微细结构，且根据年龄或部位而显着不同。根据线条的深度，将皮肤纹理分为一次(大约20至100μm)、二次(大约5至40μm)及三次(大约0.5μm)线条，皮肤越好，在每条线形成网状的网络结构时每条线交叉形成的多边形和星形(star formation)越明显(非专利文献1)。
然而，众所周知，随着年龄的增长或皮肤受损，细密的细线的网络结构崩溃，导致细线(二次、三次等)消失，一次线条变得更深，从而产生皱纹(非专利文献2、3)。换句话说，作为随着皮肤老化出现的代表性症状的皱纹是长期间发生的细微变化的累积。
直到今天，仍在努力寻找用于化妆品用途的、具有各种抗衰老效能的材料。
FOXO3基因是代表性长寿因子，也是被认为衰老的主基因的因子(非专利文献4)。作为调节其他基因表达的转录因子，FOXO3基因执行修复受损的DNA并调节排毒相关基因的表达的功能(非专利文献5)。
发现通常长寿的人中该基因被激活(非专利文献6)，并且在通过皮肤细胞进行的研究中，FOXO3的表达随着细胞的衰老而降低，且当人为地抑制FOXO3的表达时，细胞的衰老被加速(非专利文献7)。
迄今为止，在对FOXO3进行研究的过程中发现了如下的各种功能。在其功能中，代表性地有防止DNA突变产生的效果(非专利文献8)、促进衰老炎症抑制作用(非专利文献9)、女性荷尔蒙的正常调节作用和更年期延迟(非专利文献10)、去除活性氧的效果(非专利文献11)、肌肉产生和发育作用(非专利文献12)及皮肤胶原蛋白产生促进(非专利文献13)等。
除FOXO3之外，SIRT1也是关键长寿基因。随着发现SIRT1是酵母的寿命增加的现象的关键媒介体，SIRT1被认为‘延寿’的关键调节因子(非专利文献14),且参与如细胞存活、干细胞和新陈代谢等几乎所有生物作用(非专利文献15)。据报告，SIRT1在皮肤中调节炎症反应、伤口再生过程和皮肤屏障功能(非专利文献16、17)。并且，SIRT1起到通过提高FOXO3的表达量和活性来增强FOXO3的抗衰老效果的作用(非专利文献18)。
在真皮层中，胶原蛋白、弹性蛋白等提供刚性和弹性，但是表皮层缺乏弹性纤维，因此角质形成细胞(keratinocyte)的细胞骨架担当表皮层的物理性质(非专利文献19)。角质形成细胞(keratinocyte)的硬度是其他细胞的60至70倍，构成角质形成细胞的细胞骨架(肌动蛋白(actin)、角蛋白(keratin))在强度和弹性方面起重要作用，以保护皮肤(非专利文献20)。紫外线改变角质形成细胞的细胞骨架并诱导细胞凋亡(非专利文献21、22)。SIRT1基因通过激活F-肌动蛋白而有助于增强角质形成细胞的细胞骨架(非专利文献23、24)。
松露提取物的发酵物已被开发为化妆品组合物。但是，迄今为止尚未报告松露和其组合物的如FOXO3、SIRT1等的抗衰老基因的效能增进效果。
(现有文献)
(非专利文献)
(非专利文献1)Journal of the European Academy of Dermatology andVenereology.,12:103-114,1999.
(非专利文献2)The British journal of dermatology.,110:129-138,1984.
(非专利文献3)Skin research and technology.,5:189-194,1999.
(非专利文献4)Gerontol A Biol Sci Med Sci.,67(11):1132-1139,2012.
(非专利文献5)Medecine Sciences,20,10:856-859.2004.
(非专利文献6)Proc Natl Acad Sci U S A.2009Feb 24；106(8):2700–2705.
(非专利文献7)J Gerontol A Biol Sci Med Sci.2005Jan；60(1):4-9.
(非专利文献8)Science 296:530-534,2002.
(非专利文献9)Immunity.2004Aug；21(2):203-13.
(非专利文献10)Science.2003Jul 11；301(5630):215-8.
(非专利文献11)Cell 128,325–339,January 26,2007
(非专利文献12)Exp Gerontol.2010February；45(2):138–148.
(非专利文献13)J Invest Dermatol Symp Proc 2009；14:60-2.
(非专利文献14)Science.2000Sep 22；289(5487):2126-8.
(非专利文献15)Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.2010.5:253–95.
(非专利文献16)Scientific Reports,26Oct 2017,7(1):14110.
(非专利文献17)J Allergy Clin Immunol.2015Apr；135(4):936-45.e4.
(非专利文献18)J Neurosci.2015Feb 18；35(7):3100–3111.
(非专利文献19)Geerlings,M.:In vitro mechanical characterization ofhuman skin layers:stratum corneum,epidermis and hypodermis,TechnicalUniversity Eindhoven,The Netherlands 2006.
(非专利文献20)Ultramicroscopy(2010)110:1435-1442.
(非专利文献21)Ultrastruct Pathol.2013Aug；37(4):241-8.
(非专利文献22)Cell Death&Differentiation volume 9,pages598–608(2002).
(非专利文献23)J Am Soc Nephrol 26:1939–1959,2015.
(非专利文献24)Sci Rep.2017；7:14110.
发明内容
技术问题
为了达到上述目的，锐意努力的结果，本发明的发明人确认松露蘑菇提取物的发酵物激活作为代表性长寿因子的FOXO3和作为长寿基因的SIRT1来防止皮肤老化的效果，从而完成了本发明。
本发明的目的在于提供一种含有松露蘑菇提取物的发酵物作为有效成分的用于改善皱纹或增强皮肤弹性的组合物。
并且，松露蘑菇提取物的发酵物可以激活FOXO3或SIRT1。
本发明的另一目的在于提供一种用于制备用于改善皱纹的化妆品的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
本发明的另一目的在于提供一种用于制备用于改善皱纹的药学制剂的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
本发明的另一目的在于提供一种用于制备用于增强皮肤弹性的化妆品的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
本发明的另一目的在于提供一种用于制备用于增强皮肤弹性的药学制剂的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
本发明的另一目的在于提供一种用于改善皱纹或增强皮肤弹性的松露蘑菇发酵物的制备方法包括：第一步骤，通过提取松露蘑菇制备松露蘑菇提取物；及第二步骤，用选自由酵母和醋杆菌组成的组中的一种以上使在上述第一步骤中提取的松露蘑菇提取物发酵。
解决问题的方案
为了达到上述目的，本发明提供用于制备化妆品或药学组合物的、包含松露蘑菇提取物的发酵物作为有效成分的用于改善皱纹或增强皮肤弹性的组合物。
为了使皱纹改善或皮肤弹性增强成分在适用于实际皮肤时表现出优异的效果，上述成分优选在低浓度下表现出高活性的皱纹改善或皮肤弹性增强效果，具有出色的皮肤渗透和吸收能力，具有低挥发性，以便保留足够时间来显示出皱纹改善或皮肤弹性增强效果，活性成分稳定地保持在组合物或皮肤上，易于制造为药物、化妆品或食品等，对皮肤也安全。但是，在已知的成分中，满足所有上述特性的成分并不常见。例如，即使某些用于改善皱纹或增强皮肤弹性的成分在试管内试验时在低浓度下也具有优异的改善皱纹或增强皮肤弹性的活性，但皮肤渗透和吸收能力较低，因此很难适用于实际皮肤。其他活性成分具有低亲水性，因此难以配制成药物、化妆品或食品。另外，一些皮肤再生和皮肤纹理改善成分在暴露于热、光或氧气时，上述活性成分被分解或转化为其他化合物，从而其效果有时在适用于皮肤之前已消失。
如以下实施例中所确认，松露蘑菇提取物和提取物的发酵物在低浓度下表现出非常优异的FOXO3(实验例1)和SIRT1(实验例2)活性效果，从而适合用作用于改善皱纹或增强皮肤弹性的化妆品或药学制剂的有效成分。
因此，本发明提供含有松露蘑菇(下面可以称为松露)提取物的发酵物作为有效成分的用于改善皱纹或增强皮肤弹性的化妆品或药学组合物。
本发明提供一种用于制备用于改善皱纹的化妆品的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
本发明提供一种用于制备用于改善皱纹的药学制剂的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
本发明提供一种用于制备用于增强皮肤弹性的化妆品的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
本发明提供一种用于制备用于增强皮肤弹性的药学制剂的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
上述提取物可以为选自由水、C1-C4醇、1,3-丁二醇及乙酸乙酯组成的组中的一种以上溶剂的提取物。
上述发酵物可以为选自由松露蘑菇提取物的酵母和醋杆菌组成的组中的一种以上的发酵物。
上述提取物的发酵物可以促进FOXO3或SIRT1的活性。
在本发明中，松露蘑菇提取物的发酵物可以是用酵母和醋杆菌发酵松露蘑菇而得的提取物的发酵物。
在另一实施方式中，松露蘑菇提取物的发酵物提供促进FOXO3或SIRT1的活性的用于改善皱纹或增强皮肤弹性的化妆品或药学组合物。
本发明的化妆品或药学组合物的增强皮肤弹性和改善皱纹效果卓越。
本发明的“松露(truffle)”又称为西洋松露，是可食用的蘑菇之一，被认为是高级食材。它属于块茎属(Tuber)。松露的种类包括黑松露(也称为来自法国的佩里哥松露，学名：黑孢块菌(Tuber melanosporum)、意大利白松露(学名：意大利白块菌(Tuber magnatumpico))、勃艮第松露(钩块菌(Tuber uncinatum))、卡拉哈里松露(沙漠块菌(Terfeziapfeilii))、狮松露(Trefezia leonis)、夏季松露(夏眠块菌(Tuber aestivum))、冬季松露(冬季块菌(Tuber brumale))、中国松露(中国块菌(Tuber sinensis)或印度块菌(Tuberindicum))和比安凯托或发白的松露(Tuber borchii)等。
本发明的“改善皱纹”是指预防、抑制或阻碍皮肤上产生皱纹，或缓解已经产生的皱纹，但不限于此。
本发明的“增强弹性”是指通过如促进胶原蛋白合成等增加皮肤脂肪组织的体积来带来收缩松弛的皮肤组织的效果并维持或增加皮肤弹性。
本发明的“改善”是指缓解状态或至少减轻与治疗相关的参数，例如症状程度的所有行动。
本发明的“增强”是指在积极的方向上增加的所有行动，例如力量、能力和状况等比以前更好且增加。
本发明的“提取物”包含对上述松露进行提取处理而获得的提取液、上述提取液的稀释液或浓缩液、干燥上述提取液而获得的干燥物、上述提取液的粗提纯物或提纯物、及/或者它们的混合物等、提取液自身以及通过使用提取液可形成的所有剂型的提取物。具体而言，本发明的上述提取物可以在提取后制成干粉形式而被使用。
用于提取上述松露的提取溶剂的类型没有特别限制，而可以使用本领域中已知的任何溶剂。上述提取溶剂的非限制性实例包括水(或蒸馏水)；如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇等的C1至C4的低级醇；如甘油、丁二醇和丙二醇等的多元醇；以及如乙酸乙酯、丙酮、己烷、乙醚和二氯甲烷等的烃类溶剂；或其混合物。
可以通过使用上述溶剂提取松露一次以上来制备溶剂提取物。
在本发明中，通过对上述制备的经过上述分级过程获得的分级物进行过滤、浓缩或干燥过程可以去除溶剂，也可以进行上述过滤、浓缩和干燥这些所有过程。具体而言，在上述过滤时可以使用过滤纸或使用减压过滤器，在浓缩时可以使用减压浓缩机等来进行减压浓缩，在干燥时可以进行冻结干燥法。
并且，通过使用硅胶色谱(silica gel column chromatography)、薄层色谱(thinlayer chromatography)或高效液相色谱(high performance liquid chromatography)等各种色谱对上述制备的经过上述分级过程获得的分级物进行纯化来能够获得进一步纯化的分级物。
在本发明中，“发酵”或“发酵物”是指通过利用微生物(例如，乳酸菌)具有的效能来分解有机物的过程或据此的产物。通过相似的过程进行发酵和腐烂，但是当分解产生对我们生活有用的物质时，就称为发酵，而当分解产生难闻的气味或有害物质时，就称为腐烂。因此，当使用微生物对生药材进行发酵时，提取物的毒性降低，或者提取物被低分子化以促进消化，或者当涂布于皮肤时，促进经皮吸收等来提高生物利用度。另外，天然成分可以自身表现出药理作用，但是通过发酵可以进一步增强药理效果，或者可以通过微生物的代谢发挥现有发酵之前的提取物中未发现的药理作用。
发酵可以使用乳酸菌，优选地，可以使用选自由酵母和醋杆菌组成的组中的一种以上。
上述酵母是用松露提取物作为底物发酵的酵母，作为酵母的类型，可以使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)及鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)中的一种以上，优选地，可以使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
上述醋酸菌是用松露提取物的酵母发酵物作为底物发酵的醋酸菌，作为醋酸菌的类型，可以使用醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterliquefaciens)及氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)中的一种以上，优选地，可以使用醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)。
上述发酵可以与提取同时进行。例如，可以通过在将松露浸入溶剂中来制备提取物的同时添加发酵菌株来制备发酵物。
上述发酵物可以是酵母和醋酸菌发酵物，更优选地，在使用酵母(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)进行一次发酵之后，通过醋杆菌(醋化醋杆菌，Acetobacteraceti)对上述一次发酵物进行二次发酵。
通过上述方法发酵的发酵物与松露提取物、松露提取物的酵母发酵物及松露提取物的醋杆菌发酵物相比呈现更优异的FOXO3或SIRT1活性效果(实验例1至2)。
在根据本发明的化妆品组合物、药学组合物及食品组合物中，相对于化妆品组合物、药学组合物及食品组合物的总重量，上述松露蘑菇提取物的发酵物的含量优选为0.00001至10重量百分比。
一个实施方式提供包含松露蘑菇提取物的发酵物的用于改善皱纹或增强弹性的化妆品组合物。
一个实施方式提供用于制备用于改善皱纹的化妆品的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
一个实施方式提供用于制备用于增强皮肤弹性的化妆品的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
上述松露蘑菇提取物的发酵物通过促进FOXO3或SIRT1的活性而具有改善皱纹或增强皮肤弹性的效果。
根据本发明的化妆品组合物可以制备成选自如下的剂型：溶液、外用软膏、乳霜、泡沫、营养润肤剂、柔软润肤剂、套装、软水、乳液、化妆底霜、精华素、肥皂、洗涤剂、沐浴露、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、润肤液、粉末、含表面活性剂的清洁剂、油、粉底、乳浊液粉底、蜡粉底、贴剂及喷雾剂，优选地，可以制备成化妆水、精华素、润肤液、乳霜、套装、凝胶、粉末、液粉底或洗涤剂，但剂型不限于此。
上述化妆品组合物还可以包含配合于一般皮肤化妆品中的一种或多种化妆品可接受的载体，作为常用成分，例如可以适当地混合油分、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、颜料、防腐剂、香料等，但不限于此。
当本发明的剂型是粉末或喷雾剂时，乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末或它们的混合物可用作载体成分，尤其，当剂型是喷雾剂时，可以进一步包含如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等的推进剂。
当本发明的剂型是溶液或乳浊液时，溶剂、增溶剂或乳化剂用作载体成分，例如，载体成分包含水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇油，尤其，包含棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇脂肪酸酯。
当本发明的剂型是悬浮液时，如水、乙醇或丙二醇等的液体稀释剂、如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇醋和聚氧乙烯脱水山梨醇醋等的悬浮剂、微晶纤维素、偏氨氧化侣、膨润土、琼脂或黄著胶等可以用作载体成分。
当本发明的剂型是肥皂时，脂肪酸碱金属盐、脂肪酸半醋盐、脂肪酸蛋白水解产物、羟乙基磺酸盐、羊毛脂衍生物、脂肪醇、植物油、甘油、糖等可以用作载体成分。
本发明还提供包括将包含松露蘑菇提取物的发酵物的组合物涂布于个体的皮肤上的步骤的改善皱纹或增强弹性的方法。上述个体不受限制地包括包含人、牲畜和大鼠等的哺乳动物。
一个实施方式提供包含松露蘑菇提取物的发酵物的用于改善皱纹或增强弹性的药学组合物。
一个实施方式提供用于制备用于改善皱纹的药学制剂的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
一个实施方式提供用于制备用于增强皮肤弹性的药学制剂的松露蘑菇提取物的发酵物的用途。
上述松露蘑菇提取物的发酵物通过促进FOXO3或SIRT1的活性而具有改善皱纹或增强皮肤弹性的效果。
本发明中使用的术语“药学组合物”可以用作包括“准药物”或“药物”含义的概念。
本发明的药学组合物当包含有效量的松露蘑菇提取物的发酵物时可以提供优选的改善皱纹或增强弹性效果。在本发明中，“有效量”是指可以充分呈现改善皱纹或增强弹性效果的提取物的量。
本发明的组合物中所含的松露蘑菇提取物的发酵物的有效量将根据组合物的产品化形式、将上述松露蘑菇提取物的发酵物适用于皮肤的方法及留在皮肤上的时间等而不同。例如，当将上述组合物产品化为药物时，其所含的上述松露蘑菇提取物的发酵物的浓度比产品化为通常适用于皮肤的化妆品的情况相比更高。因此，基于上述松露蘑菇提取物的发酵物，日剂量为0.1至500mg/kg，并且可以每天给药1至6次。
本发明的包含松露蘑菇提取物的发酵物的组合物可被不同的口腔或肠胃外剂型，但优选地，可以是肠胃外剂型。在制剂化时，使用常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来配制。用于口腔给药的固形制剂包括片剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固形制剂可通过将至少一种化合物与如淀粉、碳酸钙，蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶等的至少一种赋形剂混合获得。并且，除了基本的赋形剂之外，还使用如硬脂酸镁、滑石粉等的润滑剂。用于口腔给药的液体制剂相当于悬浮液、内装液剂、乳剂、糖浆剂等，其实例可包括常用的基本稀释剂即水、液体石蜡以及各种赋形剂，例如，润湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等。用于胃肠外给药的制剂的实例可以包括灭菌的水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂。作为非水溶剂和悬浮溶剂，可以使用丙二醇(propyleneglycol)、聚乙二醇、如橄榄油等的植物油和如油酸乙酯等的可注射酯。
当本发明的松露蘑菇提取物的发酵物以准药物组合物被提供时，上述准药物组合物包括选自羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，除此之外，根据需要还可以包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。只要不损害本发明的效果，上述药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂就不受限制，其实例可以包括填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等。
上述准药物组合物的实例可以包括消毒清洁剂、淋浴泡沫、软膏溶液、湿纸巾、包衣剂等，优选地，制备成如外用软膏、润肤液等的半固体剂型，但不限于此。上述准药物的配制方法、容量、使用方法、组分等可以从本领域已知的常规技术中适当选择。
上述提取物的发酵物可以促进FOXO3或SIRT1的活性。
本发明的“活性”是指靶基因或蛋白质的表达频率或表达量的增加。至于FOXO3的活性，通过测定上述提取物的发酵物中FOXO3蛋白质的定量增加来确定促进活性，并且，当SIRT1(NAD依赖性组蛋白脱乙酰基酶)切断底物肽时发出荧光，此时测定荧光的强度，若强度强，则确定SIRT1的活性被促进。
一个实施方式提供一种用于改善皱纹或增强皮肤弹性的松露蘑菇发酵物的制备方法包括：第一步骤，通过提取松露蘑菇制备松露蘑菇提取物；及第二步骤，用选自由酵母和醋杆菌组成的组中的一种以上使在上述第一步骤中提取的松露蘑菇提取物发酵。
上述第一步骤的提取可以是通过用选自由水、C1-C4醇、1,3-丁二醇及乙酸乙酯组成的组中的一种以上溶剂浸渍150小时至180小时而提取的，优选地，浸渍160小时至170小时，更优选地，浸渍168小时而提取。
上述第二步骤的发酵可以通过用选自由酵母和醋杆菌组成的组中的一种以上实现，优选地，可以在使用酵母的一次发酵后进行使用醋杆菌的二次发酵。发酵时间可以是60小时至120小时，优选地，使用酵母的一次发酵时间可以是60小时至84小时，更优选地，66小时至78小时，最优选地，可以是72小时，使用醋杆菌的二次发酵可以是72小时至120小时，更优选地，可以是84小时至108小时，最优选地，可以是96小时。
通过上述方法制备的松露提取物的发酵物可以促进FOXO3或SIRT1的活性。
除非另外指出，本说明书中记载的数值应当被解释为包括等效范围。
发明的效果
根据本发明的含有松露蘑菇提取物的发酵物作为有效成分的组合物通过使用微生物发酵松露蘑菇来可以表现出更优异的皮肤老化抑制效能。
附图说明
图1为示出松露发酵物的F-肌动蛋白表达增进效果实验结果的图。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，以下实施例仅用于示例本发明，本发明的内容不限于以下实施例。
比较例1.松露提取物的制备
向松露中添加水并将其浸渍168小时后，将蘑菇原物除去并过滤，最终制备提取物。
比较例2.松露提取物的酵母发酵物的制备(松露+酵母)
向松露中添加水，接种酵母(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)并培养72小时，然后通过过滤过程去除蘑菇原物和菌体，最终制备‘松露+酵母’提取物的发酵物。
比较例3.松露提取物的醋杆菌发酵物的制备(松露+醋杆菌)
向松露中添加水，接种醋杆菌(醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)KCTC 12290)并培养96小时，然后通过过滤过程去除蘑菇原物和菌体，最终制备‘松露+醋杆菌’提取物的发酵物。
实施例1.松露提取物的酵母发酵物的醋杆菌发酵物的制备(松露+酵母+醋杆菌)
向松露中添加水，接种酵母(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)并培养72小时，然后再接种醋杆菌(醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)KCTC 12290)并培养96小时。上述培养物经过过滤过程去除蘑菇原物和菌体，最终制备‘松露+酵母+醋杆菌’提取物的发酵物。
实验例1.FOXO3活性促进效果实验
在本发明中评价FOXO3活性促进，以测定化妆品组合物的抗衰老效果。
(1)方法
向人皮肤成纤维细胞(Human dermal fibroblast)照射25mJ紫外线，用每种浓度的上述样品进行处理48小时。使用人类FOXO3/FOXO3A ELISA试剂盒(夹心(Sandwich)ELISA)法评价FOXO3活性，并使用以下公式计算FOXO3活性。
<式1>
FOXO3活性(％)＝样品处理组吸光度-未处理组吸光度/未处理组吸光度×100
未处理组：正常细胞
阴性对照组：向正常细胞照射紫外线(25mJ)
(2)结果
上述测定结果如下述表1所示。
表1
Figure BDA0002657716960000121
由上述表1的结果可知，当向正常细胞照射紫外线时，FOXO3活性大大降低，并且当用松露和松露提取物的发酵物对紫外线照射细胞进行处理时，FOXO3活性增加。
此时，当对松露同时接种酵母和醋杆菌并发酵时，FOXO3活性增加率最大。
实验例2.SIRT1活性促进效果实验
在本发明中评价SIRT1活性促进，以测定化妆品组合物的抗衰老效果。
(1)方法
向人皮肤成纤维细胞(Human dermal fibroblast)照射25mJ紫外线，用每种浓度的上述样品进行处理48小时。SIRT1活性测定试剂盒(荧光)法评价SIRT1活性，并使用以下公式计算SIRT1活性。
<式2>
SIRT1活性(％)＝样品处理组吸光度-未处理组吸光度/未处理组吸光度×100
未处理组：正常细胞
阴性对照组：向正常细胞照射紫外线(25mJ)
(2)结果
上述测定结果如下述表2所示。
表2
Figure BDA0002657716960000131
由上述表2的结果可知，当向正常细胞照射紫外线时，SIRT1活性大大降低，并且当用松露和松露提取物的发酵物对紫外线照射细胞进行处理时，SIRT1活性增加。此时，当对松露同时接种酵母和醋杆菌并发酵时，SIRT1活性增加率最大。
实验例3.胶原蛋白合成增进效果实验
(1)方法
用每种浓度的上述样品处理人皮肤成纤维细胞(Human dermal fibroblast)48小时。使用I型前胶原蛋白(PIP)ELISA试剂盒法来测定胶原蛋白合成率。相对于阴性对照组(含有0％serum的DMEM)计算样品的胶原蛋白合成效能并测定数值。
(2)结果
上述测定结果如下述表3所示。
表3
Figure BDA0002657716960000141
由上述表3的结果可知，当用松露和松露发酵物处理正常细胞时，胶原蛋白合成率增加。此时，当对松露同时接种酵母和醋杆菌并发酵时，胶原蛋白合成率的增加率最大。
实验例4.F-肌动蛋白发达增进效果实验
(1)方法
向角质形成细胞(keratinocyte)照射25mJ紫外线，用每种浓度的上述样品进行处理48小时。通过染色(ActinRedTM555ReadyProbesTM试剂，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，美国)将细胞骨架丝(肌动蛋白)可视化，以通过荧光显微镜(CELENATMS数字成像系统，LOGOS生物系统(Logos Biosystems)，韩国)设备评价细胞骨架保护效果。
(2)结果
上述测定结果如图1所示。
参照图1，当向正常细胞照射紫外线时，细胞骨架被大大削弱，当对紫外线照射细胞用松露和松露发酵物进行处理时，细胞骨架得到改善。此时，当对松露同时接种酵母和醋杆菌并进行发酵时，细胞骨架的改善率最大。
实验例5.眼边弹性改善和面部提升效果(人体适用测试)实验
(1)方法
使用下述表4的组合物制备人体适用测试产品。
表4
Figure BDA0002657716960000151
制备方法如下。
i)将成分1至8一起称重并加热至80度。
ii)将成分9至12一起称重并加热至80度。
iii)在成分13中添加成分14至15。
iv)混合ii)和iii)并保持80度。
v)将i)加入iv)并乳化10分钟。
vi)冷却至50度后，添加成分16至18并混合5分钟。
vii)冷却至30度后排放。
通过使用根据上述表4制备的试制品和对照组进行如下的人体适用测试。
1.研究对象：22名(最终20名结束测试，平均51.15±5.01岁，女性)
2.测试期间：4周(测定时间点：在适用产品之前、适用2周后、适用4周后)
3.测试部位：脸面部
4.产品适用方法：每天(早上、晚上)洗两次脸后，在乳霜步骤取适量(约100韩元硬币的大小)，从内到外沿皮肤纹理轻轻涂抹，然后用两手掌轻轻按压整个面部以吸收。
5.评价方法
1)使用皮肤弹性测定仪(Cutometer)的眼边皮肤弹性评价
使用皮肤弹性测定仪(Cutometer)(MPA580，Courage+Khazaka electronic公司，德国)评价研究对象眼边部位的皮肤弹性。作为测定弹性的皮肤弹性测定仪(Cutometer)使用以下原理来测定皮肤弹性：以持续负压(minus pressure)在测定时间内将皮肤吸入探头(probe)后，在去除负压时，皮肤恢复到原始形状。其测定方法如下：将连接到设备的直径为2mm的探头与皮肤紧密接触，通过非侵入性方法进行测定。在本测试中，作为测定条件使用模式1(Mode 1)，在450mbar的恒定负压、2秒的抽吸时间(suction time)和2秒的松弛时间(relaxation time)的条件下连续测定三次之后，求出算术平均值，获得测定结果。与皮肤弹性有关的参数(parameter)是R2、R5、R7，并且该参数的说明和增加率如下。
R2:Ua/Uf(总弹性(gross elasticity))
R5:Ur/Ue(净弹性(net elasticity))
R7:Ur/Uf(生物弹性(biological elasticity))
如果弹性变量R2、R5、R7中一个以上的测定值增加，就意味着皮肤弹性得到改善。
皮肤弹性测定值R2、R5、R7的增加率(％)＝(适用产品后测定值-产品适用前测定值)/(产品适用前测定值)×100
表5
Figure BDA0002657716960000171
使用皮肤弹性测定仪(Cutometer)来分析眼边部位的按皮肤弹性变量的测定值，结果，R2值与在适用产品之前相比，在适用2周后和适用4周后增加至统计学上的显着水平(p<0.01)，增加率分别为1.186％和3.147％，R5值与在适用产品之前相比，在适用2周后和适用4周后增加至统计学上的显着水平(p<0.05)，增加率分别为1.879％和2.188％，R7值与在适用产品之前相比，在适用2周后和适用4周后增加至统计学上的显着水平(p<0.01)，增加率分别为2.483％和3.820％。
2)使用莫尔纹(Moire)方法测定仪的嘴边颊部位的面部提升评价
使用莫尔纹(Moire)方法评价嘴边颊部位的面部下垂角度R测定值。使用莫尔纹(Moire)方法测定仪、照明套装和高分辨率数码相机在与室内照明亮度相同的条件下拍摄图像。为了标准化，由同一位研究人员进行拍照，并通过特制设备固定拍摄条件(测定方向和位置)来进行测定。在测试部位中，选择观察到皮肤下垂现象的嘴边周围颊部位作为分析部位。分析方法如下：在通过莫尔纹(Moire)方法拍摄的图像中，在嘴边颊部位的情况下在嘴唇末端绘制水平线，还绘制与嘴唇末端相遇的轮廓线的垂直相交线(接线)，将由这些线形成的角度R使用图像分析程序(Image-Pro Plus，USA)进行分析。
R值的减少率(％)＝(适用产品后测定值-产品适用前测定值)/产品适用前测定值×100
使用莫尔纹(Moire)方法测定仪和图像分析程序来分析嘴边颊部位的面部下垂角度R测定值，结果，R值与在适用产品之前相比，在适用4周后减少至统计学上的显着水平(p<0.01)，减少率为0.396％。
因此，含有松露发酵物的化妆品产品被判断为在适用2周后和适用4周后有助于眼边部位的皮肤弹性改善和在适用4周后嘴边颊部位的面部下垂改善。
表6
Figure BDA0002657716960000181
3)由研究对象进行的主观问卷评价
通过研究对象进行的问卷调查结果，在研究期间未观察到与皮肤异常反应有关的特定症状。
4)由研究人员和研究对象进行的对皮肤异常反应的评价
由研究人员进行的异常反应评价结果，在研究期间未观察到与皮肤异常反应有关的特定症状。

Claims (21)

1.一种松露蘑菇提取物的发酵物的用途，其特征在于，用于制备用于改善皱纹的化妆品。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，
上述提取物为选自由水、C1-C4醇、1,3-丁二醇及乙酸乙酯组成的组中的一种以上溶剂的提取物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，上述发酵物为选自由松露蘑菇提取物的酵母和醋杆菌组成的组中的一种以上的发酵物。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，上述化妆品的剂型为化妆水、精华素、乳液、乳霜、套装、凝胶、粉末、液粉底或洗涤剂。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，上述提取物的发酵物促进FOXO3或SIRT1的活性。
6.一种松露蘑菇提取物的发酵物的用途，其特征在于，用于制备用于改善皱纹的药学制剂。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，上述提取物为选自由水、C1-C4醇、1,3-丁二醇及乙酸乙酯组成的组中的一种以上溶剂的提取物。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，上述发酵物为选自由松露蘑菇提取物的酵母和醋杆菌组成的组中的一种以上的发酵物。
9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，上述提取物的发酵物促进FOXO3或SIRT1的活性。
10.一种松露蘑菇提取物的发酵物的用途，其特征在于，用于制备用于增强皮肤弹性的化妆品。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，上述提取物为选自由水、C1-C4醇、1,3-丁二醇及乙酸乙酯组成的组中的一种以上溶剂的提取物。
12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，上述发酵物为选自由松露蘑菇提取物的酵母和醋杆菌组成的组中的一种以上的发酵物。
13.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，上述化妆品的剂型为化妆水、精华素、乳液、乳霜、套装、凝胶、粉末、液粉底或洗涤剂。
14.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，上述提取物的发酵物促进FOXO3或SIRT1的活性。
15.一种松露蘑菇提取物的发酵物的用途，其特征在于，用于制备用于增强皮肤弹性的药学制剂。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，上述提取物为选自由水、C1-C4醇、1,3-丁二醇及乙酸乙酯组成的组中的一种以上溶剂的提取物。
17.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，上述发酵物为选自由松露蘑菇提取物的酵母和醋杆菌组成的组中的一种以上的发酵物。
18.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，上述提取物的发酵物促进FOXO3或SIRT1的活性。
19.一种用于改善皱纹或增强皮肤弹性的松露蘑菇发酵物的制备方法，其特征在于，包括：
第一步骤，通过提取松露蘑菇制备松露蘑菇提取物；及
第二步骤，用选自由酵母和醋杆菌组成的组中的一种以上使在上述第一步骤中提取的松露蘑菇提取物发酵。
20.根据权利要求19所述的用于改善皱纹或增强皮肤弹性的松露蘑菇发酵物的制备方法，其特征在于，第一步骤的提取是通过用选自由水、C1-C4醇、1,3-丁二醇及乙酸乙酯组成的组中的一种以上溶剂浸渍150小时至180小时而提取的。
21.根据权利要求19所述的用于改善皱纹或增强皮肤弹性的松露蘑菇发酵物的制备方法，其特征在于，第二步骤的发酵是通过接种选自由酵母和醋杆菌组成的组中的一种以上并培养60小时至120小时而发酵的。
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