CN112430590A

CN112430590A - 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在提高再生稻再生率和再生季产量中的应用

Info

Publication number: CN112430590A
Application number: CN202011492983.7A
Authority: CN
Inventors: 丁在松; 黄素华; 周宝元; 孙雪芳; 赵明
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-12-17
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2040-12-17
Also published as: CN112430590B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在提高再生稻再生率和再生季产量中的应用。本发明首次发现C4型PEPC具有提高再生稻再生率和产量中的功能。通过在水稻中表达或过量表达来源于禾本科C4植物的C4型PEPC基因，可以促进碳水化合物特别是淀粉在茎秆中储存，为水稻再生季腋芽萌发提供充足的物质和能量供应，水稻再生芽萌发提前3‑5天，再生率提高50％以上。本发明为培育再生稻优良品种、增加再生稻再生季产量提供了理论支持，对于加快再生稻应用推广具有重要意义。

Description

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在提高再生稻再生率和再生季产量中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在提高再生稻再生率和再生季产量中的应用。

背景技术

再生稻是利用水稻头季收割后留桩的腋芽，采取一定的栽培管理措施，使稻桩上休眠的腋芽迅速萌发成苗、抽穗结实并进行二季收获的水稻种植方式。再生稻具有一种两收，轻简化和资源高效利用的特点。近年来，随着社会发展和城镇化，农村劳动力向城市转移，再生稻成为了一种南方稻区缓解劳动力紧张、提高种粮效益的重要稻作制度。

提高再生稻产量首先是增加再生稻有效穗数，其次是增加穗实粒数。再生季有效穗数取决于头季的有效穗数及单茎的再生芽发生数。研究表明，通过合理的肥水和化学调控措施是提高再生稻再生率的有效技术措施；例如齐穗后10-15天增施催芽肥、头季收获前10-15天喷施赤霉素、芸苔素等都可以促进再生腋牙的发育。头季灌浆期土壤干湿交替的水分管理可以通过促进再生季根系生长和腋芽萌发提高再生率(陈鸿飞等，2017)。选择高再生率品种是再生稻生产的另一项关键技术。强再生力品种头季稻的农艺性状主要表现为分蘖力强、有效穗多、穗粒数偏少、齐穗期叶粒比大的特征(徐富贤等，2002)；对大量水稻杂交组合再生力与农艺性状的通径分析表明成熟期单茎茎鞘干重对再生力的直接效应最大(任天举等，2006)；收获后稻桩的干物质量与再生率和再生季产量具有显著的相关性(Chen etal.,2018)。通过去除部分叶片和/或小穗对头季稻进行源库调节的研究也表明其对再生季再生率的影响也与稻桩的干物质及非结构性碳水化合物含量的改变有关(He et al.,2019)。可见，茎鞘干物质很可能是其中储藏的养分物质对再生芽的发育起着重要作用。因此，利用生物技术手段改变水稻碳水化合物合成、积累与分配过程以调控水稻腋芽再生成为一种可能的解决办法。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是广泛存在于植物、细菌和蓝藻中的一种蛋白。PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与CO₂的羧化反应，形成四碳酸草酰乙酸，在光合组织中用于CO2的固定，而在非光合组织中用于回补三羧酸循环中用于氨基酸合成所损失的碳骨架。现有的PEPC基因转C3型植物的研究主要集中于提高植物光合效率和耐旱性两方面。王丽媛等虽然在“植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究进展”中提到了植物PEPC在种子发芽和种子萌发中的作用，但是，水稻再生腋芽萌发与种子萌发是两种完全不同的生理过程，其调控机理完全不一样——再生腋芽萌发与发育由细胞分裂素、BR及生长素共同调控，而种子萌发则由GA和ABA的平衡来调控。

发明内容

本发明首次发现，C4型PEPC可以促进碳水化合物在水稻(C3型植物)茎秆中的积累，同时提高再生稻再生率和再生季产量。

基于上述发现，本发明提供了如下技术方案：

C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高再生稻再生率和再生季产量中的应用。

C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在促进水稻再生腋芽萌发中的应用。

C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在促进水稻茎秆碳水化合物积累中的应用。

优选地，所述碳水化合物为非结构性碳水化合物。

作为进一步说明，C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在促进茎秆的非结构性碳水化合物(特别是淀粉)的积累中具有尤为显著的作用。

作为优选，所述禾本科C4植物选自玉米、甘蔗、高粱、谷子、稗草中的一种。

更优选的，所述禾本科C4植物为玉米、甘蔗、高粱、谷子、稗草中的一种。

作为优选，所述C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶具有以下任意一种氨基酸序列：

1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，

2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

所述C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因可以是CDS序列，也可以是基因组DNA序列。

作为优选，C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.2-4中任一所示的核苷酸序列，或，

(2)SEQ ID NO.2-4中任一所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，

(3)在严格条件下可以与SEQ ID NO.2-4中任一所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

其中，SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为玉米C4型PEPC的基因组基因(gDNA)；SEQID No.3所示的核苷酸序列为甘蔗C4型PEPC的CDS序列；SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为谷子C4型PEPC的CDS序列。

作为优选，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

本发明进一步提供一种构建再生稻再生率和产量高的水稻的方法，通过转基因，使水稻表达或过表达C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因。

其中，C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其编码基因的优选方案同上。

作为优选，当C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列时，表达载体为pCAMBIA1301；

当C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列时，表达载体为pCB1301-Pubi。

作为优选方案，表达或过表达SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的方案如下：

将含有玉米PEPC基因(包含启动子，外显子、内含子和终止信号)的质粒pUC-Zmppc用限制性内切酶酶切，将目的基因片段连接入植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点中获得重组表达载体pCB1301-Zmppc，并用重组表达载体pCB1301-Zmppc转化水稻。

作为优选方案，表达或过表达SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的方案如下：

提取甘蔗叶片总RNA，反转录成cDNA，依据SEQ ID No.3序列，设计引物，PCR扩增出甘蔗的C4型PEPC基因的CDS序列，并将所述的CDS序列构建到植物表达载体pCB1301-Pubi上获得植物表达载体pCB1301-Pubi:Soppc，并用重组表达载体pCB1301-Pubi:Soppc转化水稻。

作为优选方案，表达或过表达SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的方案如下：

提取谷子叶片总RNA，反转录成cDNA，依据SEQ ID No.4序列，设计引物，PCR扩增出谷子的C4型PEPC基因的CDS序列，并将所述的CDS序列构建到植物表达载体pCB1301-Pubi上获得植物表达载体pCB1301-Pubi:Sippc，并用重组表达载体pCB1301-Pubi:Sippc转化水稻。

可供选择的，所述转基因包括：利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导的方法将包含C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因的重组表达载体导入水稻，获得转基因水稻株系。

基于上述方案，本发明的有益效果如下：

本发明首次发现C4型PEPC具有提高再生稻再生率和再生季产量中的功能。通过在水稻中表达或过量表达来源于禾本科C4植物的C4型PEPC基因，促进非结构性碳水化合物特别是淀粉在茎秆中储存，为水稻再生季腋芽萌发提供充足的物质和能量供应，水稻再生芽萌发提前3-5天，再生率提高50％以上。本发明为培育再生稻优良品种、增加再生稻再生季产量提供了理论支持，对于加快再生稻应用推广具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组表达载体的结构示意图。

图2为本发明实施例2中重组表达载体的结构示意图。

图3为本发明实施例3中重组表达载体的结构示意图。

图4为本发明实施例4中重组表达载体pCB301-Zmppc、pCB1301-Pubi:Soppc和pCB1301-Pubi:Sippc转化水稻中花8后可显著提高再生腋芽的萌发；其中，A图为转基因水稻的PCR检测，B图为转基因水稻的再生腋芽萌发情况。

图5为实施例5中过表达的C4PEPC在水稻叶片、鞘和茎中的活性显著提高。

图6为实施例6中过表达的C4PEPC在水稻的净光合速率(A图)，单株产量(B图)和非结构性碳水化合物含量(C图)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

为了便于比对效果，以下具体实施方式中以水稻品种中花8号为受体材料，实际上，根据大量试验结果，其他的水稻品种均可以获得与以下实例相当的效果。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J Russell DW，Molecular cloning:Laboratory Manual,2001))，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1玉米C4型PEPC基因重组表达载体pCB1301-Zmppc的构建

采用基因重组(Infusion)的方法进行载体和目的片段之间的连接。限制性内切酶XbaI分别酶切含有如SEQ ID No.2所示的玉米PEPC全长gDNA基因的质粒pUC-Zmppc和植物表达载体pCAMBIA1301，并用CIAP对pCAMBIA1301的酶切产物进行去磷酸化处理；电泳后回收目的片段，采用T4DNA连接酶连接目的片段和载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落LB培养后提取质粒进行酶切鉴定，获得含有重组表达载体pCB1301-Zmpp质粒的单菌落。构建好的重组表达载体pCB1301-Zmpp如图1所示。以含有重组表达载体的大肠杆菌DH5α菌株，农杆菌LBA4404以及含有助动质粒pRK2013的大肠杆菌HB101为材料，采用三亲杂交的方法将重组表达载体转入农杆菌LBA4404中。

实施例2甘蔗C4型PEPC基因重组表达载体pCB1301-Pubic:Soppc的构建

采用基因重组(Infusion)的方法进行载体和目的片段之间的连接。限制性内切酶PstI酶切含有玉米Ubiquitin基因启动子的质粒pUCk9-Pubi，回收1.5KB的含有Ubiquitin基因启动子序列的片段，然后用T4DNA聚合酶处理使酶切片段末端平滑化；同时限制性内切酶KpnI酶切含有如SEQ ID No.3所示的甘蔗C4型PEPC的全长cDNA的质粒pBluscript-Soppc，回收目的片段后用T4DNA聚合酶处理使酶切片段末端平滑化，再用CIAP将其末端去磷酸化；将两个片段用T4DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落LB培养基过夜培养后提取质粒进行酶切鉴定，获得含有重组表达载体pCB1301-Pubic:Soppc质粒的单菌落。构建好的重组表达载体pCB1301-Pubic:Soppc如图2所示。以含有重组表达载体的大肠杆菌DH5α菌株，农杆菌LBA4404以及含有助动质粒pRK2013的大肠杆菌HB101为材料，采用三亲杂交的方法将重组表达载体转入农杆菌LBA4404中。

实施例3谷子C4型PEPC基因重组表达载体pCB1301-Pubic:Sippc的构建

采用基因重组(Infusion)的方法进行载体和目的片段之间的连接。限制性内切酶PstI酶切含有玉米Ubiquitin基因启动子的质粒pUCk9-Pubi，回收1.5KB的含有Ubiquitin基因启动子序列的片段，然后用T4DNA聚合酶处理使酶切片段末端平滑化；同时限制性内切酶NotI酶切含有如SEQ ID No.4所示的谷子C4型PEPC的全长cDNA的质粒pUCm-Sippc，回收目的片段后用T4DNA聚合酶处理使酶切片段末端平滑化，再用CIAP将其末端去磷酸化；将两个片段用T4DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落LB培养基过夜培养后提取质粒进行酶切鉴定，获得含有重组表达载体pCB1301-Pubic:Sippc质粒的单菌落。构建好的重组表达载体pCB1301-Pubic:Sippc如图3所示。以含有重组表达载体的大肠杆菌DH5α菌株，农杆菌LBA4404以及含有助动质粒pRK2013的大肠杆菌HB101为材料，采用三亲杂交的方法将重组表达载体转入农杆菌LBA4404中。

实施例4重组表达载体的在水稻中的遗传转化

以水稻品种中花8号为受体材料，按照农杆菌介导的方法进行水稻的遗传转化，具体步骤如下：

1)水稻成熟胚愈伤组织准备：将水稻成熟种子去颖壳，在超净台内用70％的酒精浸泡45秒，然后用25％(体积比)的次氯酸钠浸泡30分钟，其间摇动几次，最后用无菌蒸馏水冲洗6-7次，在滤纸上吸干种子表面的水分。将灭菌的种子接种到诱导培养基NBD上，每个培养皿(直径90mm)上接种25-30粒，然后在30℃的光照培养箱内进行愈伤组织的诱导，诱导出愈伤组织后，切除芽和胚乳，转入新的培养基继续进行愈伤组织继代培养，每10天更换培养基。

2)水稻愈伤组织的转化：将愈伤组织切成1-2mm左右的小块，放在新的诱导培养基上培养4天。另挑取含有植物表达载体的根癌农杆菌LBA4404的单菌落，接种到YEP培养基中，28℃黑暗振荡培养48小时，离心收集菌体，重悬于AAM培养基中，使660nm吸光值约为0.6-0.9。将培养四天的愈伤组织放在重悬了农杆菌的AAM中，平缓摇动20分钟后，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面的菌液。然后将愈伤组织转移到铺有一层滤纸的共培养基上，28℃黑暗培养3天。将共培养后的愈伤组织用含500mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗干净，吸干水分后转移到含有筛选培养基NBS1(含有25mg/L的潮霉素和500mg/L羧苄青霉素)上，30℃照光培养20天，更换至筛选培养基NBS2(含有50mg/L的潮霉素和500mg/L羧苄青霉素)，大约筛选3-5周。将在筛选培养基上新长出的愈伤组织放在干燥的滤纸上干燥一天，然后转入预分化培养基上，30℃黑暗培养一周。预分化结束后，将愈伤组织转移到分化培养基上，30℃照光培养进行芽的分化。将分化的幼苗转移到MS壮苗培养基上，30℃照光培养。待再生苗生长到10cm以上，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至温室或大田中。

实施例5C4型PEPC转基因水稻收割后腋芽萌发加快，再生率增加

对重组表达载体pCB1301-Zmppc，pCB1301-Pubic:Soppc和pCB1301-Pubic:Soppc转化后获得转基因T3代纯合株系各4株进行了PCR鉴定，选取C4型PEPC基因最保守区段设计引物进行PCR扩增。

正向引物(SEQ ID No.5)：

5’-AATTCCTCCAAACGAGCCCTACC-3’；

反向引物(SEQ ID No.6)：

5’-ACCCTGAAGAATGGCCACTCGTTGTA-3’。

结果显示3个重组载体的转基因株系均可以扩增出目的大小的片段，而野生型中则无该片段(图4中的A图)。这说明载体已经插入转基因株系ZM系列(1-4)、SO系列(1-4)和SI系列(1-4)中，为阳性株系。

进一步分析了ZM-1、SO-1和SI-1株系头季收割10天后的再生腋芽的萌发情况，发现ZM-1、SO-1和SI-1这三个转基因株系的腋芽明显大于野生型，且再生腋芽的数量也明显多于野生型(图4中的B图)。

头季收割后20天进一步对再生腋芽数量和再生率进行统计，结果如表1所示。转基因株系ZM-1、SO-1和SI-1的再生腋芽数量都显著高于野生型，按照大于10cm腋芽数量计算的再生率分别比野生型增加了82.2％、53.3％和35.6％。这说明C4型PEPC对水稻的腋芽再生具有明显的正向调控作用。

表1 过表达C4型PEPC对水稻再生腋芽萌发的影响

株系	母茎数	腋芽数	总腋芽再生率	>10cm腋芽数	>10cm腋芽再生率
						WT	10.5a	12.7a	1.21a	9.5a	0.90a
ZM-1	11.1a	24.5c	2.21c	18.2c	1.64c
						SO-1	10.8a	21.8c	2.02c	14.9c	1.38b
SI-1	10.9a	17.2b	1.58b	13.3b	1.22b

实施例6C4型PEPC转基因水稻茎秆PEPC活性

为了进一步确认转基因株系ZM-1、SO-1和SI-1再生腋芽萌发增强的表型是过表达的C4型PEPC所致，对转基因水稻叶片、鞘和茎秆中的PEPC活性进行了分析。成熟期取水稻叶片、叶鞘和茎秆0.2g，在研钵中用液氮研磨成粉末，研磨时加入石英砂少许；然后加入1.0mL冷的提取缓冲液[50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl₂，1mM EDTA，10％(m/V)Glycerol，14mM巯基乙醇]，并加入1％(质量/体积)PVP，在冰上继续研磨至匀浆状态。将匀浆转移至1.5mL微量离心管中，4℃，13 000g离心15分钟，取上清，转移到新的离心管中，4℃，15 000g再次离心30分钟，此时上清即为酶粗提物。PEPC酶活测定采用分光光度计法。反应体系为100mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM MgCl₂，3mM PEP，0.2mM NADH，10mM NaHCO₃，10U MDH，反应总体积为1mL，以加入20μL酶粗提物来启动反应，检测340nm的吸光值下降的速率。可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法进行测定，以单位质量可溶性蛋白来标定PEPC活性。结果如图5所示，叶、鞘和茎器官中，转基因株系ZM-1、SO-1和SI-1的PEPC活性比野生型均有明显的增加，而且PEPC的活性与再生芽萌发具有一定的正相关性。

实施例7C4型PEPC转基因水稻光合速率和茎秆非结构性碳水化合物(NSC，Non-structural carbonhydrate)含量

为了进一步明确过表达C4型PEPC的转基因株系ZM-1、SO-1和SI-1再生腋芽萌发增强生理机制，对转基因水稻净光合速率以及叶片、鞘和茎秆中的非结构性碳水化合物含量进行了分析。净光合速率采用LI6400在花后每15天进行一次测定，结果如图6中的A图所示，在开花期，转基因水稻光合速率与对照没有明显差异，但是花后转基因水稻光合速率下降速度缓慢，比对照有更高的净光合速率，这是因为PEPC在提高水稻抗逆性、延缓叶片衰老中起着重要作用。说明转基因水稻在花后可能积累更多的光合产物，然而转基因株系的单株产量并没有显著的变化(图6中的B图)；进一步分析了齐穗期和成熟期的叶、鞘和茎中的NSC含量，结果如图6中的C图所示，齐穗期和成熟期，叶、鞘和茎中NSC含量在不同株系以及野生型之间均存在显著的差异；尤其是转基因株系茎秆的非结构性碳水化合物含量极显著的高于野生型，其中ZM-1的茎秆中NSC含量是野生型的1.98倍。

实施例8C4型PEPC转基因水稻头季和再生季产量

为了进一步明确过表达C4型PEPC对转基因株系ZM-1、SO-1和SI-1的产量的影响，对转基因水稻头季和再生季单株产量进行了测定，结果如表2所示。头季转基因株系与野生型产量无显著差异，甚至略有降低，而再生季由于具有更多的有效穗数，产量比对照增加12.4-33.6％。

表2 过表达C4型PEPC对水稻头季和再生季产量的影响

表2中，a、b、c、d表示具有显著性差异。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在提高再生稻再生率和再生季产量中的应用

<130> KHP201118602.1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 970

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ser Thr Lys Ala Pro Gly Pro Gly Glu Lys His His Ser Ile

1 5 10 15

Asp Ala Gln Leu Arg Gln Leu Val Pro Gly Lys Val Ser Glu Asp Asp

20 25 30

Lys Leu Ile Glu Tyr Asp Ala Leu Leu Val Asp Arg Phe Leu Asn Ile

35 40 45

Leu Gln Asp Leu His Gly Pro Ser Leu Arg Glu Phe Val Gln Glu Cys

50 55 60

Tyr Glu Val Ser Ala Asp Tyr Glu Gly Lys Gly Asp Thr Thr Lys Leu

65 70 75 80

Gly Glu Leu Gly Ala Lys Leu Thr Gly Leu Ala Pro Ala Asp Ala Ile

85 90 95

Leu Val Ala Ser Ser Ile Leu His Met Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala

100 105 110

Glu Glu Val Gln Ile Ala His Arg Arg Arg Asn Ser Lys Leu Lys Lys

115 120 125

Gly Gly Phe Ala Asp Glu Gly Ser Ala Thr Thr Glu Ser Asp Ile Glu

130 135 140

Glu Thr Leu Lys Arg Leu Val Ser Glu Val Gly Lys Ser Pro Glu Glu

145 150 155 160

Val Phe Glu Ala Leu Lys Asn Gln Thr Val Asp Leu Val Phe Thr Ala

165 170 175

His Pro Thr Gln Ser Ala Arg Arg Ser Leu Leu Gln Lys Asn Ala Arg

180 185 190

Ile Arg Asn Cys Leu Thr Gln Leu Asn Ala Lys Asp Ile Thr Asp Asp

195 200 205

Asp Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ala Leu Gln Arg Glu Ile Gln Ala Ala

210 215 220

Phe Arg Thr Asp Glu Ile Arg Arg Ala Gln Pro Thr Pro Gln Asp Glu

225 230 235 240

Met Arg Tyr Gly Met Ser Tyr Ile His Glu Thr Val Trp Lys Gly Val

245 250 255

Pro Lys Phe Leu Arg Arg Val Asp Thr Ala Leu Lys Asn Ile Gly Ile

260 265 270

Asn Glu Arg Leu Pro Tyr Asn Val Ser Leu Ile Arg Phe Ser Ser Trp

275 280 285

Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn Pro Arg Val Thr Pro Glu Val Thr

290 295 300

Arg Asp Val Cys Leu Leu Ala Arg Met Met Ala Ala Asn Leu Tyr Ile

305 310 315 320

Asp Gln Ile Glu Glu Leu Met Phe Glu Leu Ser Met Trp Arg Cys Asn

325 330 335

Asp Glu Leu Arg Val Arg Ala Glu Glu Leu His Ser Ser Ser Gly Ser

340 345 350

Lys Val Thr Lys Tyr Tyr Ile Glu Phe Trp Lys Gln Ile Pro Pro Asn

355 360 365

Glu Pro Tyr Arg Val Ile Leu Gly His Val Arg Asp Lys Leu Tyr Asn

370 375 380

Thr Arg Glu Arg Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Gly Val Ser Glu Ile

385 390 395 400

Ser Ala Glu Ser Ser Phe Thr Ser Ile Glu Glu Phe Leu Glu Pro Leu

405 410 415

Glu Leu Cys Tyr Lys Ser Leu Cys Asp Cys Gly Asp Lys Ala Ile Ala

420 425 430

Asp Gly Ser Leu Leu Asp Leu Leu Arg Gln Val Phe Thr Phe Gly Leu

435 440 445

Ser Leu Val Lys Leu Asp Ile Arg Gln Glu Ser Glu Arg His Thr Asp

450 455 460

Val Ile Asp Ala Ile Thr Thr His Leu Gly Ile Gly Ser Tyr Arg Glu

465 470 475 480

Trp Ser Glu Asp Lys Arg Gln Glu Trp Leu Leu Ser Glu Leu Arg Gly

485 490 495

Lys Arg Pro Leu Leu Pro Pro Asp Leu Pro Gln Thr Glu Glu Ile Ala

500 505 510

Asp Val Ile Gly Ala Phe His Val Leu Ala Glu Leu Pro Pro Asp Ser

515 520 525

Phe Gly Pro Tyr Ile Ile Ser Met Ala Thr Ala Pro Ser Asp Val Leu

530 535 540

Ala Val Glu Leu Leu Gln Arg Glu Cys Gly Val Arg Pro Ala Val Pro

545 550 555 560

Val Val Pro Leu Phe Glu Arg Leu Ala Ser Leu Gln Ser Ala Pro Ala

565 570 575

Ser Val Glu Arg Leu Phe Ser Val Asp Trp Tyr Met Asp Arg Ile Lys

580 585 590

Gly Lys Gln Gln Val Met Val Gly Tyr Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala

595 600 605

Gly Arg Leu Ser Ala Ala Trp Gln Leu Tyr Arg Ala Gln Glu Glu Met

610 615 620

Ala Gln Val Ala Lys Arg Tyr Gly Val Lys Leu Thr Leu Phe His Gly

625 630 635 640

Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro Thr His Leu Ala Ile

645 650 655

Leu Ser Gln Pro Pro Asp Thr Ile Asn Gly Ser Ile Arg Val Thr Val

660 665 670

Gln Gly Glu Val Ile Glu Phe Cys Phe Gly Glu Glu His Leu Cys Phe

675 680 685

Gln Thr Leu Gln Arg Phe Thr Ala Ala Thr Leu Glu His Gly Met His

690 695 700

Pro Pro Val Ser Pro Lys Pro Glu Trp Arg Lys Leu Met Asp Glu Met

705 710 715 720

Ala Val Val Ala Thr Glu Glu Tyr Arg Ser Val Val Val Lys Glu Ala

725 730 735

Arg Phe Val Glu Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu Thr Glu Tyr Gly

740 745 750

Arg Met Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg Pro Gly Gly Gly

755 760 765

Ile Thr Thr Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ser Trp Thr Gln Thr

770 775 780

Arg Phe His Leu Pro Val Trp Leu Gly Val Gly Ala Ala Phe Lys Phe

785 790 795 800

Ala Ile Asp Lys Asp Val Arg Asn Phe Gln Val Leu Lys Glu Met Tyr

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Leu Glu Gly Asp Pro Phe Leu Lys Gln Gly Leu Val Leu Arg Asn Pro

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Tyr Ile Thr Thr Leu Asn Val Phe Gln Ala Tyr Thr Leu Lys Arg Ile

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<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aattcctcca aacgagccct acc 23

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accctgaaga atggccactc gttgta 26

Claims

1.C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高再生稻再生率和再生季产量中的应用。

2.C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在促进水稻再生腋芽萌发中的应用。

3.C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在促进水稻茎秆中碳水化合物积累中的应用。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶为禾本科C4植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；

所述禾本科C4植物优选为玉米、甘蔗、高粱、谷子、稗草中的一种。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶具有以下任意一种氨基酸序列：

1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，

6.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.2-4中任一所示的核苷酸序列，或，

7.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

8.构建再生稻再生率和产量高的水稻的方法，其特征在于，通过转基因，使水稻表达或过表达C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶为禾本科C4植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；

优选所述禾本科C4植物选自玉米、甘蔗、高粱、谷子、稗草中的一种；

优选所述C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶具有以下任意一种氨基酸序列：

1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.2-4中任一所示的核苷酸序列，或，