CN112426433B - 一种抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体及制备方法 - Google Patents

一种抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物技术领域，具体是涉及到一种抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体及制备方法，包括如下步骤，1)取卵磷脂、胆固醇共同溶于石油醚与无水乙醇的混合液中，得悬液；2)将步骤1)所述悬液进行超声震荡，搅拌，减压蒸发，形成半透明的薄膜；3)加入含有当归多糖、冰片的缓冲液，将薄膜洗脱分散，得悬液；4)将步骤3)得到的悬液于进行超声分散，得悬液；5)将步骤4)得到的悬液过滤，制得冰片当归多糖脂质体；本发明的冰片当归多糖脂质体，粒径低，抗炎效果好。

Description

一种抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体及制备方法
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体是涉及到一种抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体及制备方法。
背景技术
在中西医防治方面，人们不断探究脑缺血的药物防治措施，以提高疾病治疗水平。大量研究发现依达拉奉、阿司匹林等西药对于脑缺血治疗有着良好的临床实用价值。中医药方面，当归是我国传统的活血化瘀药，其可降低血小板聚集，改善血液流变学，有显著的改善血液循环及抗血栓形成等作用。当归多糖是从当归中提取的多糖成分，当归多糖具有保护脑缺血再灌注损伤的作用，该作用与其具有抗炎作用有关。用当归多糖干预脑缺血再灌注模型，其内TNF-α和IL-1β含量均显著性降低，当氧化应激水平异常升高时，可以增加TLR-4的表达凋亡，从而对脑缺血再灌注损伤起保护作用，但是当归多糖不易透过血脑屏障，难以有效作用，使其充分发挥抗炎作用。
脂质体(liposome)是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。脂质体的组成一般为磷脂和胆固醇。
脂质体在制备成药物时，一个重要的性能指标数据为粒径，粒径越低，其越容易透过细胞膜等屏障，进入靶细胞中，作用于目的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体及制备方法，本发明的冰片当归多糖脂质体，粒径低，抗炎效果好。
本发明的内容包括一种抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法，包括如下步骤，
1)取卵磷脂、胆固醇共同溶于石油醚与无水乙醇的混合液中，得悬液；
2)将步骤1)所述悬液进行超声震荡，搅拌，减压蒸发，形成半透明的薄膜；
3)加入含有当归多糖、冰片的缓冲液，将薄膜洗脱分散，得悬液；
4)将步骤3)得到的悬液于进行超声分散，得悬液；
5)将步骤4)得到的悬液过滤，制得冰片当归多糖脂质体。
所述卵磷脂和胆固醇的重量比为1:1。
所述石油醚和无水乙醇的体积比为3:1。
所述卵磷脂、胆固醇的总重量与石油醚、无水乙醇的总体积比为3mg:1ml。
所述步骤2)和步骤4)的超声的功率为300w，温度为40℃。
所述步骤2)的搅拌的温度为50℃，转速为80r/min。
所述当归多糖和冰片的重量比为9:1。
所述卵磷脂、胆固醇的总重量和当归多糖、冰片的总重量比为12:5。
步骤5)的过滤为过0.45μm过滤器。
本发明还提供一种冰片当归多糖脂质体，采用上述方法得到。
本发明的有益效果是，冰片可以作为药物使用，具有一定的药用价值，但是生物利用度较差，难以被人体吸收。本发明将冰片加入到当归多糖制备的脂质体中，有效的降低了脂质体的粒径，有效提高了当归多糖在血脑屏障处的浓度，在冰片的联合下，能够促进更多的当归多糖透过病理性血脑屏障，提高药物的利用率，解决了当归多糖难以透过血脑屏障的问题。
脂质体粒径在100-200nm内有较高的透膜性，脂质体透膜性随粒径的增加而减少，粒径越小，透膜性越好，达到特定组织的药物浓度越高，本发明的粒径要明显高于对比例，说明本发明更有利于透膜，达到特定组织的药物浓度更高。
附图说明
图1为对比例1的粒径分布图。
图2为对比例2的粒径分布图。
图3为葡萄糖标准曲线图。
图4为实施例1的粒径分布图。
图5为不同组的TTC染色显示效果图。
图6为不同组的Western-Blot技术分析结果图。
图7为不同组的NF-KB蛋白表达分析结果图。
图8为不同组的TLR4蛋白表达分析结果图。
具体实施方式
实施例1
一种抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法，其工艺步骤如下：
1)取卵磷脂60mg、胆固醇60mg共同溶于30ml石油醚与10ml无水乙醇的混合液中，得悬液。
2)将步骤1)所述悬液置于于探头超声水浴下300W，40℃超声5min，再将悬液于50℃恒温水浴下，转速为80r/min，减压蒸发形成淡黄色半透明薄膜。
3)加入含有当归多糖45mg、冰片5mg的20ml的pH为7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)将薄膜洗脱分散，温和水化10min。
4)将步骤3)中的悬液于探头超声水浴下300W，40℃超声15min。
5)将步骤4)中的悬液用0.45μm水系过滤器过滤，整粒3次制得冰片-当归多糖脂质体，得混悬液，即得冰片当归多糖脂质体混悬液，4℃冰箱冷藏备用。
对比例1
和实施例1相比，区别在于，步骤3)中不加入冰片，其他和实施例1相同。测得包封率为80.7％，平均粒径为214.5nm，且分布均匀，表面Zeta电位为-17.8mv。对比例1粒径图见图1。
对比例2
和实施例1相比，区别在于，步骤1)中将石油醚30ml改为氯仿30ml，其他和实施例1相同。测得包封率为80.3％，平均粒径为227.6nm，且分布不均匀，表面Zeta电位为-18.2mv。对比例2粒径图见图2。
本发明采用如下方法对各项试样的包封率进行测定：
1、校准曲线的制备：标准曲线绘制，精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品10mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml，即得1mg/mL的储备液，从中吸取10mL加水稀释定容至100ml，即得0.1mg/mL的标准液。分别吸取标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL至比色管中加纯水适至2mL，再各加入5％苯酚溶液1mL，加入浓硫酸5mL，混匀，沸水浴15min，流动水冷却，冷却后用紫外分光光度仪在490nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度(C)对吸光度(A)进行回归，得回归方程Y＝0.041X+0.12，R2＝0.998，结果表明葡萄糖在2.5～15μg/mL之间线性关系良好。以葡聚糖标准品和蒽酮-浓硫酸显色法建立当归多糖校准曲线，并采用蒽酮-浓硫酸显色法测定样品中各项指标的吸光度。根据建立的校准曲线回归方程换算出所需各项指标的质量，从而计算出包封率。葡萄糖标准曲线图见图3。
2、包封率的测定：将制备好的冰片-当归多糖脂质体悬液取4ml分别放入冷冻超速离心机内进行离心(4℃，10000r/min，30min)，吸出上清液，置于容量瓶，用纯水将其定容至50ml，混匀。精密吸取4ml置于10ml离心管中，再往其中加入5％的苯酚1ml，5ml 80％浓硫酸，混匀在沸水中加热15分钟，流动水冷却。冷却后滴入96孔板，每个100微升，再加入100微升纯水稀释，放入酶标仪中进行检测，然后代入标准曲线中计算浓度，求得游离的当归多糖的含量，再计算包封率。
包封率＝(1-C游离/C总)×100％，其中C游离为游离多糖含量，C总为制备冰片当归多糖脂质体时加入的当归多糖含量。
采用上述方法，测量得到实施例1的冰片当归多糖脂质体的包封率为80.4％，平均粒径为179.1nm，且分布均匀，表面Zeta电位为-17.2mv(粒径分布图见图4)。与对比例1和对比例2相比，本申请的冰片当归多糖脂质体粒径更小，性能更优。
冰片当归多糖脂质体抗脑缺血再灌注炎症反应的研究
以脑缺血再灌注大鼠模型为研究对象。给予脑缺血再灌注的大鼠以冰片-当归多糖脂质体尾静脉给药，应用TTC染色、Western-Blot技术研究冰片当归多糖脂质体发挥抗脑缺血再灌注炎症反应。将模型大鼠分为6组：1.冰片当归多糖脂质体组(脑缺血再灌注造模，并进行冰片-当归多糖脂质体混悬液给药)；2.当归多糖脂质体组(脑缺血再灌注造模，并进行冰片当归多糖混合给药)；3.当归多糖组(脑缺血再灌注造模，并进行当归多糖给药)；4.模型组(进行脑缺血再灌注造模，并进行生理盐水给药)；5.假手术组(仅游离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,不做结扎、插线处理,并进行生理盐水给药)；6.另以正常SD大鼠组成空白组(生理盐水给药)，共6组，每组15只。缺血2h再灌注24h后，再尾静脉注射(本实验中分别按当归多糖0.03g/Kg单剂量注射冰片-当归多糖脂质体混悬液、当归多糖脂质体混悬液、当归多糖)。
通过TTC染色显示冰片当归多糖脂质体组脑梗死面积较当归多糖脂质体组和当归多糖组更小，保护缺血再灌注脑组织疗效更明显。
研究结果表明，本发明的冰片-当归多糖脂质体组脑组织TLR-4和NF-κB蛋白表达明显降低，且低于当归多糖脂质体组和当归多糖组，说明其抗炎作用优于当归多糖脂质体组和当归多糖组，表明冰片当归多糖脂质体能够携带有效药物冰片、当归多糖充分发挥较好的抗炎作用。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法，其特征是，包括如下步骤，
1)取卵磷脂、胆固醇共同溶于石油醚与无水乙醇的混合液中，得悬液；
2)将步骤1)所述悬液进行超声震荡，搅拌，减压蒸发，形成半透明的薄膜；
3)加入含有当归多糖、冰片的缓冲液，将薄膜洗脱分散，得悬液；
4)将步骤3)得到的悬液于进行超声分散，得悬液；
5)将步骤4)得到的悬液过滤，制得冰片当归脂质体。
2.如权利要求1所述的抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法，其特征是，所述卵磷脂和胆固醇的重量比为1:1。
3.如权利要求1所述的抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法，其特征是，所述石油醚和无水乙醇的体积比为3:1。
4.如权利要求1-3任一项所述的抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法，其特征是，所述卵磷脂、胆固醇的总重量与石油醚、无水乙醇的总体积比为3mg:1ml。
5.如权利要求1所述的抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法，其特征是，所述步骤2)和步骤4)的超声的功率为300w，温度为40℃。
6.如权利要求1所述的抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法，其特征是，所述步骤2)的搅拌的温度为50℃，转速为80r/min。
7.如权利要求1-3任一项所述的抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法，其特征是，所述当归多糖和冰片的重量比为9:1。
8.如权利要求1-3任一项所述的抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法，其特征是，所述卵磷脂、胆固醇的总重量和当归多糖、冰片的总重量比为12:5。
9.如权利要求1-3任一项所述的抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法，其特征是，步骤5)的过滤为过0.45μm过滤器。
10.一种如权利要求1-9任一项的抗脑缺血炎症反应的冰片当归多糖脂质体的制备方法得到的冰片当归多糖脂质体。
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