CN112410254A - 一种促进植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复菌株及修复方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业和环境污染治理技术领域，具体涉及一种促进植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复菌株及修复方法，所述菌株分类命名为葡萄球菌(Staphylococcus sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年9月14日，菌株保藏号为CCTCC NO.M2020491。Staphylococcus sp.具有植物促生效果，改善了植物修复中因生物量小而效果受限的不足，同时该菌株可以活化土壤中的重金属，增强了植物对土壤重金属的提取能力。
Description
技术领域
本发明属于农业和环境污染治理技术领域，具体涉及一种促进植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复菌株及修复方法。
背景技术
近20年来，随着现代化工业的快速发展，土壤重金属污染已成为普遍又难以治理的环境问题。重金属可以被作物富集并通过食物链，直接或间接危害着人类健康。因此对于重金属污染土壤的修复，特别是污染农田的修复，受到越来越多的关注。
传统的土壤重金属污染修复方法主要有客土、电动、淋洗等物理化学方法，但这些方法存在成本高、易引起二次污染、破坏土壤结构等缺点，在实际推广应用中受到限制。植物修复技术作为一种新兴的土壤修复技术，操作方便，且具有保护土表、防止水土流失、美化环境等优点，是现阶段最重要的土壤修复技术之一。
用于植物修复的重金属超富集植物普遍存在生物量小、生长缓慢、地域性强等缺点，从而制约了植物修复技术的发展。数量庞大、种类繁多的微生物是生物地球化学循环的参与者，在土壤重金属的形态转化过程中扮演重要角色。采用微生物修复法操作简单、经济且环境友好。
植物与其生长环境中的微生物关系密切，单独的微生物修复技术或植物修复技术效果不足，且略显单一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：将植物修复与微生物修复联合作用，利用植物促生菌促进植物的生长，增大植物生物量，同时活化土壤重金属，从而增强植物对重金属的提取。
具体来说，本发明提出了如下技术方案：
一种促进植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复试剂菌株，所述菌株分类命名为葡萄球菌(Staphylococcus sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年9月14日，菌株保藏号为CCTCC NO.M2020491，保藏地点为中国武汉。
本发明还提供上述菌株在修复重金属污染土壤中的应用。
本发明还提供上述菌株在修复镉污染土壤中的应用。
一种重金属污染土壤修复方法，将上述菌株制备为重悬液，用重悬液浇灌重金属污染土壤。
进一步的，所述重金属为镉。
进一步的，所述重悬液的OD600等于1。
进一步的，所述重悬液的制备方法为：用LB液体培养基摇床培养权利要求1所述的菌株，培养时间为12h，5000rpm离心5min，去上清，用去离子水重悬至OD600等于1。
进一步的，浇灌频率为每10天浇灌一次，共浇灌4次。
进一步的，重悬液的用量为每千克土壤100mL。
本发明还提供一种植物促生方法，将上述菌株制备成OD600＝1的重悬液，将移栽前的植物根系浸泡接种在重悬液菌液中2小时，之后移栽植株。
有益效果
Staphylococcus sp.具有植物促生效果，改善了植物修复中因生物量小而效果受限的不足，同时该菌株可以活化土壤中的重金属，增强了植物对土壤重金属的提取能力。而且该菌株是在重金属高度污染的土壤中分离纯化而来的，在污染土壤中具有一定的活性。因此具有植物促生和活化重金属双重作用的Staphylococcus sp.与植物联合作用可提高对重金属污染土壤的修复效果。
附图说明
图1为Staphylococcus sp.对植物的促生特性；
图2为Staphylococcus sp.对植株生物量的影响；
图3为Staphylococcus sp.对叶片镉含量的影响。
具体实施方式
实施例1
1.实验方法
1.1菌种筛选
称取重金属污染土样0.5g放到含有50mL无菌去离子水的摇瓶内，摇瓶内含有5颗玻璃珠，150rpm，震荡30min，然后取1mL菌悬液梯度稀释成10-4和10-5涂布于LB固体平板上，30℃培养3d。
3d后从长出来的菌落中依据菌落大小、边缘形状和颜色等指标挑取菌落，然后进行纯化和保藏。
1.2促生特性的测定
植物生长素(IAA)的测定：首先配制含有色氨酸的浓度为0.5mg/mL的YN液体培养基，分装到试管中，每管4mL。将供试菌株接种于上述培养液中，25℃、150rpm摇床培养3d。6000rpm离心10min，取离心后的1mL上清液，加50μL10 mM的正磷酸，再加2mL Sackowski’s显色剂，充分混合，25℃避光显色反应30min，测定530nm波长下的吸光值。根据标准曲线计算发酵液中IAA的浓度。
铁载体的测定：所有器皿需用5％HNO3浸泡24h，进行脱铁处理。取活化培养后的菌液6000rpm离心10min，取1.5mL上清液加1.5mL CAS检测液，然后避光培养1h，用分光光度计测定630nm波长处的吸光值(A)。另取1.5mL未接菌的LB培养基添加1.5mL CAS检测液充分混匀，同法测定吸光值即为参比值(Ar)，用A/Ar比值表示菌株产铁载体能力。
ACC酶的测定：收集菌体，分别等量接种到SMN液体培养基、SM液体培养基和SMA液体培养基中，28℃、150rpm振荡培养48h，用分光光度计比色法测定OD600值。在SM培养基中不长，在SMA和SMN培养基中良好生长的细菌具有ACC酶活性。
溶磷能力测定：在LB液体培养基上活化菌株后，将细菌菌液点在Pikovskaya(NBRIP)固体培养基上。在30℃的恒温培养箱中孵育7天，如果在菌落周围有明显的明亮圆圈，则说明该菌株为溶磷菌。
固氮能力检测：用灭菌的牙签将分离得到的细菌接种于低氮培养基中，28℃培养7d，转接三次观察是否生长，结果表明该菌株在缺氮培养基上生长良好。
1.3盆栽实验
取适量萝卜种子置于培养皿，加适量水泡两天，生根后穴播。前期每盆5-6棵萝卜苗，200g镉污染土(镉含量4.32mg/kg)，后期稀疏至每盆2棵苗。待萝卜苗生长至二叶一心期开始用菌液处理。
用LB液体培养基摇床培养细菌12h，5000rpm离心5min，去上清，用去离子水重悬至OD600等于1。每盆(200g土)取20ml重悬液浇灌处理，每10天浇灌一次，培养45天后收样测定。
2.结果与讨论
2.1Staphylococcus sp.对植物的促生作用
图1和表结果显示，Staphylococcus sp.具有产铁载体、生长素、ACC酶的能力。铁载体对三价铁离子具有络合作用，除了与铁结合之外，还能够与金属产生作用，形成复合物。此外，由于铁载体的作用，大量植物对土壤中的可利用铁产生作用，进而获取到发育进程所需要的铁元素。细菌产生的生长素能够诱导植物侧根和不定根的产生，促进对矿物质和营养的吸收和根系分泌物的产生，同时植物促生菌合成的生长素可以降低压力环境下的有害影响。乙烯是植物正常生长发育所必需的激素，作为胁迫应答分子，可以抑制根伸长、生长素的运输，加速老化，促进衰老和脱落。有些PGPR可以产生ACC酶，ACC酶可以裂解乙烯的前体物质ACC，降低植物的乙烯水平，从而为植物提供保护，防止各种胁迫的抑制作用，被广泛应用于土壤重金属修复。
同时，Staphylococcus sp.还具有解磷、固氮能力，可以提高植物对土壤磷的利用并增加土壤的肥力，从而促进植物的生长。
图2的盆栽结果显示，与未接菌对照相比，接种Staphylococcus sp.萝卜的生物量显著增加，证明Staphylococcus sp.可以促进植物的生长，增大植物的生物量，从而增强植物对土壤中重金属的萃取作用。
2.2Staphylococcus sp对土壤重金属的活化作用
图3的盆栽结果表明，与未接菌对照相比，接种Staphylococcus sp.细菌可以显著提高萝卜体内镉的浓度，因此Staphylococcus sp.对于土壤中的重金属具有活化作用，从而有利于植物对土壤重金属的提取。
综上，Staphylococcus sp.是一株植物促生菌，能够增加植物的生物量，且可以活化土壤中的重金属，有利于植物对土壤重金属的提取。Staphylococcus sp.可以与植物联合作用，强化植物修复的效果。
实施例2
选择大小一致的龙葵种子用5％的次氯酸钠消毒15分钟，之后在蛭石上萌发，挑选生长一致的幼苗进行镉污染土(镉含量4.32mg/kg)的盆栽培养，每盆1棵苗。待第8-10片叶完全展开后进行菌液处理。
用LB液体培养基摇床培养细菌12h，5000rpm离心5min，去上清，用去离子水重悬至OD600等于1。每盆(200g土)取20ml重悬液浇灌处理，每10天浇灌一次，共浇灌4次，培养45天后收样测定。
结果显示，与未接菌对照相比，接种Staphylococcus sp.的龙葵生物量显著增加，并显著提升了龙葵地上部的镉浓度，证明Staphylococcus sp.可以促进植物的生长，增大植物的生物量，从而增强植物对土壤中重金属的萃取作用。
实施例3
选择大小一致的美洲商陆种子用5％的次氯酸钠消毒15分钟，之后在蛭石上萌发，挑选生长一致的幼苗进行镉污染土(镉含量4.32mg/kg)的盆栽培养，每盆1棵苗。待幼苗长至四叶一心时后进行菌液处理。
用LB液体培养基摇床培养细菌12h，5000rpm离心5min，去上清，用去离子水重悬至OD600等于1。每盆(200g土)取20ml重悬液浇灌处理，每10天浇灌一次，共浇灌4次，培养45天后收样测定。
结果显示，与未接菌对照相比，接种Staphylococcus sp.的美洲商陆生物量显著增加，并显著提升了美洲商陆地上部的镉浓度，证明Staphylococcus sp.可以促进植物的生长，增大植物的生物量，从而增强植物对土壤中重金属的萃取作用。
实施例4
选择大小一致的籽粒苋种子用5％的次氯酸钠消毒15分钟，之后在蛭石上萌发，挑选生长一致的幼苗进行镉污染土(镉含量4.32mg/kg)的盆栽培养，每盆2棵苗。待幼苗长至四叶一心时后进行菌液处理。
用LB液体培养基摇床培养细菌12h，5000rpm离心5min，去上清，用去离子水重悬至OD600等于1。每盆(200g土)取20ml重悬液浇灌处理，每10天浇灌一次，共浇灌4次，培养45天后收样测定。
结果显示，与未接菌对照相比，接种Staphylococcus sp.的籽粒苋生物量显著增加，并显著提升了籽粒苋地上部的镉浓度，证明Staphylococcus sp.可以促进植物的生长，增大植物的生物量，从而增强植物对土壤中重金属的萃取作用。
Claims (10)
1.一种促进植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复试剂菌株，其特征在于，所述菌株分类命名为葡萄球菌(Staphylococcus sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年9月14日，菌株保藏号为CCTCC NO.M2020491。
2.权利要求1所述的菌株在修复重金属污染土壤中的应用。
3.权利要求1所述的菌株在修复镉污染土壤中的应用。
4.一种重金属污染土壤修复方法，其特征在于，将权利要求1所述的菌株制备为重悬液，用重悬液浇灌重金属污染土壤。
5.根据权利要求4所述的重金属污染土壤修复方法，其特征在于，所述重金属为镉。
6.根据权利要求4所述的重金属污染土壤修复方法，其特征在于，所述重悬液的OD600等于1。
7.根据权利要求6所述的重金属污染土壤修复方法，其特征在于，所述重悬液的制备方法为：用LB液体培养基摇床培养权利要求1所述的菌株，培养时间为12h，5000rpm离心5min，去上清，用去离子水重悬至OD600等于1。
8.根据权利要求4所述的重金属污染土壤修复方法，其特征在于，浇灌频率为每10天浇灌一次，共浇灌4次。
9.根据权利要求4所述的重金属污染土壤修复方法，其特征在于，重悬液的用量为每千克土壤100mL。
10.一种植物促生方法，其特征在于，将权利要求1所述菌株制备成OD600＝1的重悬液，将移栽前的植物根系浸泡接种在重悬液菌液中2小时，之后移栽植株。
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