CN112390807A

CN112390807A - 一种同时制备补骨脂素和异补骨脂素的方法

Info

Publication number: CN112390807A
Application number: CN202011312328.9A
Authority: CN
Inventors: 顾生松; 孙芙蓉
Original assignee: Ningxia Houze Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Ningxia Houze Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-11-20
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2021-02-23

Abstract

本发明公开了一种同时制备补骨脂素和异补骨脂素的方法，包括粗提物的制备、溶剂体系的配制、样品溶液的配制和HSCCC分离步骤。本发明提供的从墨旱莲中采用HSCCC一步同时制备补骨脂素和异补骨脂素的方法无需依赖繁琐的柱色谱，补骨脂素和异补骨脂素的纯度均在98％以上；该方法以墨旱莲为原料，充分发挥了墨旱莲来源丰富的优势，提高了墨旱莲的利用价值。

Description

一种同时制备补骨脂素和异补骨脂素的方法

技术领域

本发明属于化学领域，具体涉及一种同时制备补骨脂素和异补骨脂素的方法。

背景技术

补骨脂素和异补骨脂素是天然药物领域非常重要的两个化学成分，研究表明其具有丰富多样的生物活性。补骨脂素和异补骨脂素的化学结构式如下。

高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography，简写HSCCC)，是Yoichiro Ito教授在20世纪80年代研发的一种结合液-液萃取和分配色谱两者优点的新型色谱技术。我国、日本以及欧美国家较早开展HSCCC应用研究，为该色谱技术广泛应用奠定结实基础，并在天然产物的分离制备方面取得了显著效果。HSCCC无需固体载体，不涉及样品被不可逆吸附，因而样品的利用率显著高于其他色谱技术；同时HSCCC拥有较大的进样量，色谱仪器价格低廉、性能可靠、分析成本低、易于操作；近年来广泛应用于天然产物成分的分离。

中国科学院化学研究所唐亚林课题组采用高速逆流色谱技术，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7:3:5:5)作为两相溶剂体系，经一步逆流分离可以从补骨脂粗提物中分离得到补骨脂素和异补骨脂素，二者纯度分别达到99.4％、99.1％(白鸽等，高速逆流色谱法对补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的分离纯化研究，世界科学技术-中医药现代化，2009年06期)。

墨旱莲为菊科植物鳢肠Ecliptaprostrata L.的全草，在我国江南各省均有分布，为常用中草药，具有滋补肝肾，止血凉血的功效。由于墨旱莲对环境适应能力很强，繁殖生长速度快，产量大，但是市场需求有限。有些年份，大量墨旱莲无人采收，实为可惜。

北京大学药学院的研究表明，墨旱莲中也含有补骨脂素和异补骨脂素(中药墨旱莲化学成分研究，中国中药杂志，第43卷第17期，2018年)。因此，如能开发出简单有效的方法从墨旱莲中分离制备得到高纯度补骨脂素和异补骨脂素，有利于植物资源的充分利用。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种同时制备补骨脂素和异补骨脂素的方法。

本发明上述目的通过如下方案实现：

一种同时制备补骨脂素和异补骨脂素的方法，包括步骤：

(1)粗提物的制备

将墨旱莲粉碎后用无水乙醇热回流提取，无水乙醇提取液减压浓缩得浸膏；取适量浸膏，先用水搅拌溶解，再用氯仿萃取，氯仿萃取液减压浓缩得粗提物；

(2)溶剂体系的配制

以体积比为6:4:4:6:0.5的正己烷-氯仿-正丁醇-水-四氢呋喃为溶剂体系：将正己烷、氯仿、正丁醇、水和四氢呋喃按照体积比6:4:4:6:0.5混合，充分振摇，静置分层；将上下相分开，超声脱气，静置待用；

(3)样品溶液的配制

取粗提物用溶剂体系的下相溶解配制成浓度为50mg/mL的溶液。

(4)HSCCC分离过程

以溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相，采用头进尾出、正转的模式，泵入固定相，待固定相完全充满螺旋管后，打开色谱仪，设置转速850r/min、流速3mL/min、检测波长280nm、温度30℃，将流动相泵入螺旋管中，待流动相开始从检测器尾端持续流出时，表明螺旋管内两相溶剂达到流体动力学平衡。取适量样品溶液通过进样阀口注入HSCCC，同时启动检测器采集信号记录色谱图，收集195～240min色谱峰Ⅰ对应的流份和248～292min色谱峰Ⅱ对应的流份，浓缩干燥，色谱峰Ⅰ对应的流份获得补骨脂素，色谱峰Ⅱ对应的流份获得异补骨脂素。

进一步地，无水乙醇提取3次，每次2h。

进一步地，氯仿等体积萃取3次。

进一步地，静置24h分层。

进一步地，样品溶液的浓度为50mg/mL。

有益效果：

本发明提供了一种从墨旱莲中采用HSCCC一步同时制备补骨脂素和异补骨脂素的方法，该方法无需依赖繁琐的柱色谱，补骨脂素和异补骨脂素的纯度均在98％以上；该方法以墨旱莲为原料，充分发挥了墨旱莲来源丰富的优势，提高了墨旱莲的利用价值。

附图说明

图1为HSCCC色谱图；

图2为色谱峰Ⅰ化合物和补骨脂素对照品的HPLC色谱图；

图3为色谱峰Ⅱ化合物和异补骨脂素对照品的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。

一、试验材料

墨旱莲购买自安徽亳州中药材市场，为菊科植物鳢肠的干燥地上部分。

TBE-300C高速逆流色谱仪为上海同田生物技术股份有限公司产品。

二、方法和结果

1、粗提物的制备

将5kg墨旱莲粉碎后用30L无水乙醇热回流提取2h×3次，合并无水乙醇提取液，减压浓缩得浸膏。取200g浸膏，先用5L水搅拌溶解(可边搅拌边超声)，再用5L氯仿萃取3次，合并氯仿萃取液，减压浓缩得粗提物约80g。

2、溶剂体系的配制

以体积比为6:4:4:6:0.5的正己烷-氯仿-正丁醇-水-四氢呋喃为溶剂体系：将正己烷、氯仿、正丁醇、水和四氢呋喃按照体积比6:4:4:6:0.5混合，充分振摇，静置24h分层。将上下相分开，超声脱气，静置待用。

3、样品溶液的配制

取粗提物用溶剂体系的下相溶解配制成浓度为50mg/mL的溶液。

4、HSCCC分离过程

以溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相，采用头进尾出、正转的模式，泵入固定相，待固定相完全充满螺旋管后，打开色谱仪，设置转速850r/min、流速3mL/min、检测波长280nm、温度30℃，将流动相泵入螺旋管中，待流动相开始从检测器尾端持续流出时，表明螺旋管内两相溶剂达到流体动力学平衡。取10mL样品溶液通过进样阀口注入HSCCC，同时启动检测器采集信号记录色谱图，收集195～240min色谱峰Ⅰ对应的流份和248～292min色谱峰Ⅱ对应的流份，浓缩干燥，确证其结构和HPLC纯度。HSCCC色谱图如图1中b所示。

色谱峰Ⅰ：根据高分辨质谱提供的分子量确定分子式为C₁₁H₆O₃。¹³C-NMR(CDCl₃，125MHz)δ：160.7(C-2)，114.6(C-3)，143.8(C-4)，115.2(C-4a)，119.8(C-5)，125.0(C-6)，156.2(C-7)，99.8(C-8)，152.0(C-8a)，146.8(C-2')，106.5(C-3')。与补骨脂素核磁信息一致。HPLC色谱图如图2所示，与补骨脂素对照品具有一致的色谱保留行为，纯度98.7％。色谱条件同文献(白鸽等，高速逆流色谱法对补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的分离纯化研究，世界科学技术-中医药现代化，2009年06期)。

色谱峰Ⅱ：根据高分辨质谱提供的分子量确定分子式为C₁₁H₆O₃。¹³C-NMR(CDCl₃，125MHz)δ：160.7(C-2)，114.3(C-3)，144.6(C-4)，113.6(C-4a)，123.8(C-5)，108.7(C-6)，157.5(C-7)，117.2(C-8)，148.5(C-8a)，145.9(C-2')，104.2(C-3')。与异补骨脂素核磁信息一致。HPLC色谱图如图3所示，与异补骨脂素对照品具有一致的色谱保留行为，纯度99.5％。色谱条件同上。

5、讨论

中国科学院化学研究所唐亚林课题组采用高速逆流色谱技术，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7:3:5:5)作为两相溶剂体系，经一步逆流分离可以从补骨脂粗提物中分离得到补骨脂素和异补骨脂素，二者纯度分别达到99.4％、99.1％(白鸽等，高速逆流色谱法对补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的分离纯化研究，世界科学技术-中医药现代化，2009年06期)。研究人员一开始尝试了该文献使用的溶剂体系组成，并不断调整四种溶剂的比例，补骨脂素、异补骨脂素的纯度从未高于50％，这两种目标成分总是与墨旱莲粗提物中的其他色谱保留行为接近的化合物共同出峰，很难经一步逆流分离得到高纯度补骨脂素、异补骨脂素。很显然，由于补骨脂粗提物与墨旱莲粗提物成分不同，不能随意套用文献中的溶剂体系，能将补骨脂粗提物中补骨脂素与异补骨脂素分开且能将补骨脂素或异补骨脂素与补骨脂粗提物中其他成分分开的溶剂体系未必能将补骨脂素或异补骨脂素与墨旱莲粗提物中其他成分分开。

随后，尝试了若干种不同组成、不同比例的两相溶剂体系，均难以经一步逆流分离得到高纯度补骨脂素、异补骨脂素，其中最好的体系是6:4:4:6的正己烷-氯仿-正丁醇-水，补骨脂素的纯度尚可，达到约90％，但异补骨脂素纯度只能达到约40％，原因是有一个非目标化合物色谱峰总是与异补骨脂素色谱峰共同出峰，色谱图如图1中a所示。

就在研究人员怀疑HSCCC是否适用于墨旱莲粗提物中补骨脂素、异补骨脂素一步分离时，无意发现在溶剂体系中加了0.5份四氢呋喃，即以体积比为6:4:4:6:0.5的正己烷-氯仿-正丁醇-水-四氢呋喃为溶剂体系时，将之前与异补骨脂素色谱峰共同出峰的非目标化合物从异补骨脂素色谱峰中分离了出来，即图1里b中的色谱峰Ⅲ，异补骨脂素纯度达到约99％。

虽然HSCCC有不可逆吸附低的优点，但是一直无法像柱色谱那样在化合物分离领域得到重视，最主要的原因就是普适性差，很多目标化合物很难通过HSCCC分离得到，更不用说不借助于其他分离手段一步分离得到。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims

1.一种同时制备补骨脂素和异补骨脂素的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)粗提物的制备

(2)溶剂体系的配制

(3)样品溶液的配制

取粗提物用溶剂体系的下相溶解配制成浓度为50mg/mL的溶液。

(4)HSCCC分离过程

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：无水乙醇提取3次，每次2h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：氯仿等体积萃取3次。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：静置24h分层。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：样品溶液的浓度为50mg/mL。