CN112384501B - 作为用于治疗炎性疾病的nlrx1配体的1,3,5-三(6-甲基吡啶-2-基氧基)苯衍生物和相关化合物 - Google Patents

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    • C07D213/72—Nitrogen atoms
    • C07D213/73—Unsubstituted amino or imino radicals

Abstract

提供了靶向含有核苷酸结合性寡聚化结构域、富亮氨酸重复序列的XI(NLRX1)通路的1,3,5‑三(6‑甲基吡啶‑2‑基氧基)苯衍生物和相关化合物。所述化合物可以用于治疗多种病状，包含炎性、免疫介导的和/或慢性炎性胃肠疾病；全身性免疫介导的疾病；癌症；以及感染性疾病。

Description

作为用于治疗炎性疾病的NLRX1配体的1,3,5-三(6-甲基吡 啶-2-基氧基)苯衍生物和相关化合物
技术领域
本发明涉及NLRX1的配体和其用途，如以下的治疗和预防：癌症；细菌、真菌和病毒来源的感染性疾病；炎性、免疫介导的或慢性胃肠疾病，如炎性肠病和全身性免疫介导的疾病。
背景技术
含有核苷酸结合性寡聚化结构域、富亮氨酸重复序列的X1(NLRX1)(也被称为“NOD样受体X1”或“NLR家族成员X1”或“NOD9”)是在免疫细胞、胃肠道和皮肤、肺部、肌肉、内分泌和生殖组织中表达的信号传导通路蛋白[1]。NLRX1分子具有三个不同的结构域，并且定位到线粒体中[2]。已公布的结果表明，在炎性肠病模型中[4-6]NLRX1的丧失会加剧疾病的严重程度并且改变免疫细胞的代谢[3]。NLRX1蛋白也已经牵扯到病毒应答[7-14]、细菌感染[15]、真菌感染[16]、癌症[17-21]、肝脂肪变性[22，23]、2型糖尿病[24]、脑损伤[25]、心肌缺血[26]、慢性阻塞性肺病[27]和自身免疫性脑脊髓炎[28]的模型中。
对于牵扯NLRX1的疾病的安全、有效治疗的临床需求显然未得到满足。这些疾病包含自身免疫性疾病、慢性和炎性胃肠疾病，如炎性肠病、癌症和感染性疾病。由于功效低且安全性差，当前的自身免疫性治疗需要经常监测、变换治疗范例和复杂的递送方法。因此，需要能够口服给药以用于长期管理疾病的新治疗。在感染性疾病中，各种微生物中的高突变率使得开发不必使用抗菌剂、抗真菌剂和抗病毒剂的新型非抗菌治疗方法成为必需。进一步地，新的菌株和流行性感染会在病原体的出现与微生物特异性干预措施的可获得性之间产生迟滞期，从而产生对新型宿主靶向的疗法的需求。总体考虑到感染性疾病和自身免疫性疾病的流行，NLRX1通路有可能显著影响数百万患者。
已将病毒核酸[29]和膳食脂质标识为NLRX1的天然配体[5]。需要开发NLRX1通路的新型配体，以允许专门针对单独疾病定制治疗，并且潜在地最大化其功效。
本发明提供了化合物，所述化合物与NLRX1蛋白结合并且因此诱导各种疾病病状中的有益反应，所述疾病病状包含但不限于炎性、免疫介导的或慢性胃肠疾病，如炎性肠病；全身性免疫介导的疾病；癌症；以及细菌、真菌和病毒来源的感染性疾病。
发明内容
本发明提供了式Z化合物或其盐，所述化合物具有A环、B环、C环和D环，其中：
Z为：
Figure BDA0002884376860000021
在每种情况下，X独立地选自由N和CR6组成的组；
在每种情况下，Y独立地选自由NR6、O、S、C(R6)2和CR7组成的组；
在每种情况下，A1、A2、A3、A4和A5独立地选自由N和C组成的组；
在每种情况下，R1、R2、R3、R4、R5和R6在存在时独立地选自：由氢、羟基、乙酰基、卤基和羧基组成的组；经过取代的或未经取代的部分，所述经过取代的或未经取代的部分选自由氨基、烷基、烷氧基、羧基烷基、酰基、酰氨基芳基、芳基烷基、杂烷基、杂烷氧基、杂羧基烷基、杂酰基、杂酰氨基、杂芳基和杂芳基烷基组成的组；以及前述的任何组合，条件是当给定环上的A1、A2、A3、A4和/或A5分别为N时，所述给定环上的R1、R2、R3、R4和/或R5中的任何一个均不存在；并且
在每种情况下，R7独立地选自由＝O、＝S和＝NR6组成的组。
本文提供的式Z化合物为NLRX1的配体。
图1A-1T中示出了本发明的示例性化合物。
本发明还提供了用如本文所描述的化合物治疗动物的病状的方法。所述方法包括向所述动物施用有效量的所述化合物。所述病状可以选自由以下组成的组：炎性、免疫介导的或慢性胃肠疾病；全身性免疫介导的疾病；癌症；以及感染性疾病。在一些型式中，所述病状包括炎性肠病。在一些型式中，所述炎性肠病包括溃疡性结肠炎。在一些型式中，所述炎性肠病包括克罗恩氏病(Crohn's disease)。在一些型式中，所述病状包括肠易激综合征。在一些型式中，所述病状选自由类风湿性关节炎、多发性硬化症、全身性红斑狼疮、1型糖尿病和牛皮癣组成的组。在一些型式中，所述病状包括1型糖尿病。在一些型式中，所述病状包括结肠直肠癌。在一些型式中，所述病状包括选自由病毒感染和细菌感染组成的组的感染。在一些型式中，所述病状包括流感感染。在一些型式中，所述病状包括艰难梭菌(C.difficile)感染。
本发明的目的和优点将通过本发明的优选实施例的结合附图做出的以下详细说明而变得更加充分明显。
附图说明
图1A-1T.本发明的示例性化合物：NX-5(图1A)、NX-8(图1B)、NX-9(图1C)、NX-10(图1D)、NX-13(图1E)；NX-35(图1F)；NX-37(图1G)；NX-38(图1H)；NX-41(图1I)；NX-43(图1J)；NX-44(图1K)；NX-45(图1L)；NX-46(图1M)；NX-48(图1N)；NX-49(图1O)；NX-50(图1P)；NX-53(图1Q)；NX-54(图1R)；NX-55(图1S)；和NX-56(图1T)。
图2A-2E.以kcal/mol计的所选化合物与NLRX1的结合的计算机预测。
图3.由所选化合物利用表面等离子共振(SPR)进行的NLRX1结合的实验验证。呈现的结果是以微摩尔计的根据1:1结合模型拟合计算的稳态解离常数(KD)。
图4A和4B.CD4+脾细胞中NX-13活性的免疫学验证。在用浓度为0.1微摩尔、1微摩尔和10微摩尔的NX-13对细胞进行体外处理之后，通过流式细胞术测量了IFNγ+(图4A)和TNFα+(图4B)CD4+T细胞的百分比。统计显著性(p<0.05)以星号标记。
图5A-5D.CD4+脾细胞中NX-45和NX-50活性的免疫学验证。在用浓度为10纳摩尔、50纳摩尔和100纳摩尔(NX-45)或0.1微摩尔、1微摩尔和10微摩尔(NX-50)的NX-45(图5A和5B)或NX-50(图5C和5D)对细胞进行体外处理之后，通过流式细胞术测量了IFNγ+(图5A和5C)和TNFα+(图5B和5D)CD4+T细胞的百分比。统计显著性(p<0.05)以星号标记。
图6A-6J.CD4+脾细胞中NX-37、NX-43、NX-44以及NX-53、NX-54、NX-55和NX-56活性的免疫学验证。在用浓度为0.1微摩尔、1微摩尔和10微摩尔的NX-37(图6A和6B)、NX-43(图6C和6D)、NX-44(图6E和6F)、NX-53(图6G)、NX-54(图6H)、NX-55(图6I)或NX-56(图6J)对细胞进行体外处理之后，通过流式细胞术测量了IFNγ+(图6A、6C、6E、6G、6H、6I和6J)和TNFα+(图6B、6D和6F)CD4+T细胞的百分比。统计显著性(p<0.05)以星号标记。
图7A-7C.结肠炎的DSS模型中NX-13功效的体内验证。在每天利用媒剂或NX-13通过口服强饲治疗的小鼠的第7天，对整个7天的DSS激发(图7A)的疾病活性评分和结肠固有层内的嗜中性粒细胞(图7B)和Th1(图7C)群的流式细胞术测量结果。统计显著性(p<0.05)以星号标记。
图8A-8D.NX-13治疗后的结肠基因表达。通过来自利用DSS激发7天并且每天利用媒剂或NX-13通过口服强饲治疗的小鼠的整个结肠RNA的定量实时PCR对Ifng(图8A)、Il10(图8B)、Tnf(图8C)和Il17(图8D)的测量。数据归一化为β-肌动蛋白。统计显著性(p<0.05)以星号标记。
图9.结肠炎的MDR1a-/-模型中NX-13功效的体内验证。每天利用媒剂或NX-13通过口服强饲治疗MDR1a-/-的六周治疗期的过程中的每周疾病活性评分。统计显著性(p<0.05)以星号标记。
图10A和10B.来自利用媒剂(图10A)或NX-13(图10B)治疗六周之后的MDR1a-/-小鼠的H&E染色的结肠切片的代表性显微照片。
图11A-11C.利用媒剂或NX-13治疗六周之后的MDR1a-/-小鼠的结肠固有层的用于检测Th1(图11A)、嗜中性粒细胞(图11B)和Treg(图11C)细胞群的流式细胞术。统计显著性(p<0.05)以星号标记。
图12A和12B.溃疡性结肠炎患者的外周血单个核细胞(PBMC)中NX-13功效的离体翻译验证。利用1nM、10nM、50nM和100nM的NX-13离体处理之后的TNFα+(图12A)和IFNγ+(图12B)细胞的流式细胞术检测，呈现为CD45+细胞的百分比。统计显著性(p<0.05)以星号标记。
图13A-13D.克罗恩氏病患者的外周血单个核细胞(PBMC)中NX-13功效的离体翻译验证。利用1nM、10nM、50nM和100nM的NX-13离体处理之后的TNFα+(图13A)、IL4+(图13B)、IL10+(图13C)和IFNγ+(图13D)细胞的流式细胞术检测，呈现为CD45+细胞的百分比。统计显著性(p<0.05)以星号标记。
图14A和14B.NX-43在CT26注射的实体瘤模型中的功效。在CT26细胞注射后9天开始，利用NX-43(40mg/kg)治疗之后按直径(图14A)和质量(图14B)计的肿瘤大小。统计显著性(p<0.05)以星号标记。
图15A和15B.NX-43在结肠直肠癌的APCmin/+模型中的功效。用NX-43(40mg/kg，口服)治疗四周之后结肠息肉的数量(图15A)和结肠重量(图15B)。统计显著性(p<0.05)以星号标记。
具体实施方式
一般定义
除非另有说明，否则贯穿本申请使用以下定义：
方差分析(ANOVA)：用于基于变异源将数据集中的整体变异划分为具体组分的算术过程。所述算数过程已用于确定治疗组之间的数值差异是否是统计学显著的。
共轭二烯：含有被单键分离的两个双键的分子。
对映异构体：光学异构体；基于分子使偏振的面顺时针(+)或逆时针(-)旋转的能力对分子的化学分类。
基本上纯的：纯度为至少90重量％，优选地至少95重量％，如至少98重量％、99重量％或约100重量％。
IBD：炎性肠病(IBD)涉及消化道的全部或部分的慢性炎症。IBD主要包含溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn's disease)。两者通常都涉及严重的腹泻、疼痛、疲劳和体重减轻。IBD可以使人衰弱，并且有时会导致危及生命的并发症。
溃疡性结肠炎(UC)：UC是会在大肠(结肠)和直肠的最内的内衬中引起持久的炎症和疮(溃疡)的IBD。
克罗恩氏病：克罗恩氏病是会引起消化道内衬的炎症的IBD。在克罗恩氏病中，炎症通常会蔓延深入到受感染组织中。炎症可以涉及消化道的不同区域—大肠、小肠或两者。
IL-10：白介素10(IL-10)，也被称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，是抗炎细胞因子。在人体内，IL-10由IL10基因编码。
FOXP3：FOXP3(叉头框P3)，也被称为scurfin，是涉及免疫系统反应的蛋白质。作为FOX蛋白家族的成员，FOXP3在调节性T细胞的发育和功能中似乎起着主调节子(转录因子)的作用。
TNF-α：肿瘤坏死因子(TNF、恶病质或恶病质素并且以前被称为肿瘤坏死因子α或TNFα)是涉及全身性炎症的细胞因子，并且是刺激急性期反应的一组细胞因子的成员。
MCP1：单核细胞趋化蛋白-1。CC细胞因子的较早术语，其发现于内皮细胞、巨噬细胞中以及经历冠状动脉旁路手术的患者的血管平滑肌细胞中，对动脉粥样硬化病变的发展至关重要。正式优选的术语现在为趋化因子(C-C基序)配体2。
干扰素γ：干扰素γ是促炎性二聚化可溶性细胞因子，是II型干扰素类别的唯一成员。
白细胞浸润：白细胞浸润是指将白细胞移动或浸润到受损伤组织中以开始修复过程的过程。
化学定义
除非另有说明，否则术语“烷基”，其本身或作为另一个取代基的一部分，意指具有指定碳原子数量(例如，C-C10包含性地意指一到十个碳原子)的完全饱和的直链烃基、支链烃基或环烃基，或其组合，并且可以包含二价基和多价基。烷基的实例包含但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)乙基、环丙基甲基、以及其同源物和异构体，例如正戊基、正己基、正庚基和正辛基等。除非另有注释，否则术语“烷基”包含环烷基。
术语“烯基”意指如上所定义的除了其含有一个或多个双键之外的烷基。烯基的实例包含乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)等以及更高级的同源物和异构体。
术语“炔基”意指如上所定义的除了其含有一个或多个三键之外的烷基或烯基。炔基的实例包含乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基等，包含更高级的同源物和异构体。
术语“亚烷基”、“亚烯基”和“亚炔基”，单独或作为另一个基团的一部分，分别意指衍生自烷基、烯基或炔基的二价基，如—CH2CH2CH2CH2—所例示的。
通常，烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基和亚炔基将具有1到24个碳原子。本发明中优选具有10个或更少碳原子的那些基团。术语“低级”当应用于这些基团中的任何基团时，如在“低级烷基”或“低级亚烷基”中，指定具有10个或更少碳原子的基团。烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基和亚炔基的实例包含C1-C10、C1-C8或C1-C6烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基或亚炔基。
术语“酰基”是通式—C(O)R的基团，其中R是烷基。
术语“烷氧基”是与氧单结合的烷基：–O–R，其中R是烷基。实例包含甲氧基、乙氧基等。
术语“芳基”在本文中用于指代芳香族基团，所述芳香族基团可以是单个芳香族环或稠合在一起、共价连接或连接到如重氮、亚甲基或乙烯部分等常见基团的多个芳香族环。所述常见连接基团还可以是如二苯酮中的羰基。一个或多个芳香族环可以包含例如苯基、萘基、联苯、二苯甲基和二苯酮等。术语“芳基”涵盖“经过取代的芳基”。对于苯基，芳基环可以是单取代的、二取代的、三取代的、四取代的或五取代的。较大的环可以是未经取代的或可以承载一个或多个取代基。
术语“芳基烷基”在本文中用于指代包括芳基和烷基的基团。
术语“羧基烷基”在本文中用于指代包括烷基和羧基的基团(例如，-C(O)O(C1到C6)烷基)。
术语“卤素”或“卤基”在本文中用于指代氟原子、溴原子、氯原子和碘原子。
附加在本文描述的任何部分的名称上的术语“杂”是指其中部分中的非碳原子替代碳原子的基团。本文描述的任何部分都可以以杂形式提供。示例性杂原子包含氮、氧、硫、磷、氯、溴和碘等。
术语“羟基”在本文中用于指代基团—OH。
术语“氨基”用于指定NRR'，其中R和R'独立地为H、烷基、烯基、炔基、芳基或其经过取代的类似物。“氨基”涵盖“烷基氨基”和“二烷基氨基”，表示仲胺和叔胺。二烷基氨基上的每个烷基可以独立地选择。其中R和R'为H的氨基被称为“未经取代的氨基”。其中R和R'是除了H之外的部分的氨基被称为“经过取代的氨基”。
术语“酰氨基”在本文中用于描述基团RC(O)NR'-，其中R为酰基，并且R'独立地为H、烷基、烯基、炔基、芳基或其经过取代的类似物。
“经过取代的”是指如本文描述的进一步包含一个或多个取代基的化学基团，如低级烷基、芳基、酰基、卤素(例如，卤基烷基，如CF3)、羟基、氨基、烷氧基、烷基氨基、酰氨基、硫代氨基、酰氧基、芳氧基、芳氧基烷基、巯基、硫杂、氮杂、氧代、饱和环烃和不饱和环烃两者、杂环等。这些基团可以附接到烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基或本文描述的其它部分的任何碳或取代基上。
对于如羧酸等酸性部分，酸自身的命名明确地涵盖酸、其共轭碱以及其盐和酯。
对于如氨基等碱性部分，碱基自身的命名明确地涵盖碱基、其共轭酸以及其盐和季铵化型式。
所提出的没有指出立体化学的结构包含呈任何比例的其所有立体异构体(即对映异构体和非对映异构体、其外消旋混合物或任何对映异构体/非对映异构体过量的任何混合物)。
“盐”是任何酸或碱加成盐。本文的盐优选地为药学上合适的盐。“药学上合适的盐”是在盐的药物剂量中其反离子对患者(包含兽医患者)无毒，使得游离碱或游离酸中固有的有益药理作用不会受到归结于反离子的副作用的损害的任何酸或碱加成盐。许多药学上合适的盐的宿主是本领域众所周知的。对于碱性活性成分，所有酸加成盐均可用作游离碱形式的源，即使期望特定的盐本身仅呈中间产物形式，例如当仅出于纯化或标识的目的而形成盐时，或当在通过离子交换程序制备药学上合适的盐中将其用作制中间体时也是如此。药学上合适的盐包含但不限于衍生自矿物酸和有机酸的那些盐，所述盐明确地包含氢卤化物，例如盐酸盐和氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、草酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、亚甲基双-b-羟萘酸盐、龙胆酸盐、羟乙基磺酸盐、二对甲苯甲酰基酒石酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐、奎尼酸盐等。碱加成盐包含衍生自碱或碱土金属碱或常规有机碱的那些盐，如三乙胺、吡啶、哌啶、吗啉、N-甲基吗啉等。术语“药学上可接受的”和“药学上合适的”在本文可互换使用。
除非明确相反地指出，否则对本文的“化合物”或本文所定义的化合物结构的任何提及均涵盖盐和非盐形式两者。
化合物
本发明的化合物包含式Z化合物或其盐，所述化合物具有A环、B环、C环和D环，其中：
Z为：
Figure BDA0002884376860000111
在每种情况下，X独立地选自由N和CR6组成的组；
在每种情况下，Y独立地选自由NR6、O、S、C(R6)2和CR7组成的组；
在每种情况下，A1、A2、A3、A4和A5独立地选自由N和C组成的组；
在每种情况下，R1、R2、R3、R4、R5和R6在存在时独立地选自：由氢、羟基、乙酰基、卤基和羧基组成的组；经过取代的或未经取代的部分，所述经过取代的或未经取代的部分选自由氨基、烷基、烷氧基、羧基烷基、酰基、酰氨基芳基、芳基烷基、杂烷基、杂烷氧基、杂羧基烷基、杂酰基、杂酰氨基、杂芳基和杂芳基烷基组成的组；以及前述的任何组合，条件是当给定环上的A1、A2、A3、A4和/或A5分别为N时，所述给定环上的R1、R2、R3、R4和/或R5中的任何一个均不存在；并且
在每种情况下，R7独立地选自由＝O、＝S和＝NR6组成的组。
在一些型式中，D环中的至少一个X为CR6。在一些型式中，D环中的X中的至少两个为CR6。在一些型式中，D环中的每一个X为CR6。
在一些型式中，D环中的至少一个X为N。在一些型式中，D环中的X中的至少两个为N。在一些型式中，D环中的每一个X为N。
在一些型式中，D环中的至少一个X为CR6，并且D环中的至少一个X为N。在一些型式中，D环中的X中的两个为CR6，并且D环中的一个X为N。在一些型式中，D环中的一个X为CR6，并且D环中的X中的两个为N。
在一些型式中，连接D环和A环的Y为NR6。在一些型式中，连接D环和A环的Y以及连接D环和B环的Y各自为NR6。在一些型式中，每个Y为NR6。
在一些型式中，连接D环和A环的Y为O。在一些型式中，连接D环和A环的Y以及连接D环和B环的Y各自为O。在一些型式中，每个Y为O。
在一些型式中，连接D环和A环的Y为S。在一些型式中，连接D环和A环的Y以及连接D环和B环的Y各自为S。在一些型式中，每个Y为S。
在一些型式中，连接D环和A环的Y为C(R6)2。在一些型式中，连接D环和A环的Y以及连接D环和B环的Y各自为C(R6)2。在一些型式中，每个Y为C(R6)2。
在一些型式中，连接D环和A环的Y为CR7。在一些型式中，连接D环和A环的Y以及连接D环和B环的Y各自为CR7。在一些型式中，每个Y为CR7。
在一些型式中，A环上的A1、A2、A3、A4和A5中的至少一个为C。在一些型式中，A环上的A1、A2、A3、A4和A5中的至少一个为N。在一些型式中，A环上的A1、A2、A3、A4和A5中的至少一个为C，并且A环上的A1、A2、A3、A4和A5中的至少一个为N。
在一些型式中，A环上的A1为N。在一些型式中，A环上的A2为N。在一些型式中，A环上的A3为N。在一些型式中，A环上的A4为N。在一些型式中，A环上的A5为N。在一些型式中，A环上的A1和A5为N。
在一些型式中，A环上的A1为N，并且A环上的A2、A3、A4和A5为C。在一些型式中，A环上的A2为N，并且A环上的A1、A3、A4和A5为C。在一些型式中，A环上的A3为N，并且A环上的A1、A2、A4和A5为C。在一些型式中，A环上的A4为N，并且A环上的A1、A2、A3和A5为C。在一些型式中，A环上的A5为N，并且A环上的A1、A2、A3和A4为C。在一些型式中，A环上的A1和A5为N，并且A环上的A2、A3和A4为C。
在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A1为N。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A2为N。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A3为N。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A4为N。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A5为N。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A1和A5为N。
在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A1为N，并且A环和B环中的每一个上的A2、A3、A4和A5为C。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A2为N，并且A环和B环中的每一个上的A1、A3、A4和A5为C。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A3为N，并且A环和B环中的每一个上的A1、A2、A4和A5为C。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A4为N，并且A环和B环中的每一个上的A1、A2、A3和A5为C。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A5为N，并且A环和B环中的每一个上的A1、A2、A3和A4为C。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的A1和A5各自为N，并且A环和B环中的每一个上的A2、A3和A4为C。
在一些型式中，每个A1为N。在一些型式中，每个A2为N。在一些型式中，每个A3为N。在一些型式中，每个A4为N。在一些型式中，每个A5为N。在一些型式中，每个A1和A5为N。在一些型式中，每个A1为N，并且每个A2、A3、A4和A5为C。在一些型式中，每个A2为N，并且每个A1、A3、A4和A5为C。在一些型式中，每个A3为N，并且每个A1、A2、A4和A5为C。在一些型式中，每个A4为N，并且每个A1、A2、A3和A5为C。在一些型式中，每个A5为N，并且每个A1、A2、A3和A4为C。在一些型式中，每个A1和A5为N，并且每个A2、A3和A4为C。
在一些型式中，A环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个为氢。在一些型式中，A环和B环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个为氢。
在一些型式中，A环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少两个为氢。在一些型式中，A环和B环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少两个为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少两个为氢。
在一些型式中，A环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少三个为氢。在一些型式中，A环和B环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少三个为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少三个为氢。
在一些型式中，A环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少四个为氢。在一些型式中，A环和B环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少四个为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少四个为氢。
在一些型式中，A环上的R1、R2、R3、R4和R5中的每一个(如果存在的话)均为氢。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R1、R2、R3、R4和R5中的每一个(如果存在的话)均为氢。在一些型式中，每个R1、R2、R3、R4和R5(如果存在的话)均为氢。
在一些型式中，A环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个不为氢。在一些型式中，A环和B环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个不为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个不为氢。
在一些型式中，A环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少两个不为氢。在一些型式中，A环和B环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少两个不为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少两个不为氢。
在一些型式中，A环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少三个不为氢。在一些型式中，A环和B环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少三个不为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少三个不为氢。
在一些型式中，A环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少四个不为氢。在一些型式中，A环和B环上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少四个不为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1、R2、R3、R4和R5中的至少四个不为氢。
在一些型式中，A环上的R1、R2、R3、R4和R5中的每一个(如果存在的话)不为氢。在一些型式中，A环和B环上的R1、R2、R3、R4和R5中的每一个(如果存在的话)不为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1、R2、R3、R4和R5中的每一个(如果存在的话)不为氢。
在一些型式中，A环上的R1不为氢。在一些型式中，A环上的R1不为氢，并且A环上的R2、R3、R4和R5(如果存在的话)为氢。
在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R1不为氢。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R1不为氢，并且A环和B环中的每一个上的R2、R3、R4和R5(如果存在的话)为氢。
在一些型式中，每个R1不为氢。在一些型式中，每个R1不为氢，并且每个R2、R3、R4和R5(如果存在的话)为氢。
在一些型式中，A环上的R4不为氢。在一些型式中，A环上的R4不为氢，并且A环上的R1、R2、R3和R5(如果存在的话)为氢。
在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R4不为氢。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R4不为氢，并且A环和B环中的每一个上的R1、R2、R3和R5(如果存在的话)为氢。
在一些型式中，每个R4不为氢。在一些型式中，每个R4不为氢，并且每个R1、R2、R3和R5(如果存在的话)为氢。
在一些型式中，A环上的R1或R4中的至少一个不为氢，并且A环上的R3和R4中的至少一个不为氢。在一些型式中，A环上的R1或R4中的至少一个不为氢，A环上的R3和R4中的至少一个不为氢，并且A环上的不为氢的R1、R2、R3、R4和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R1或R4中的至少一个不为氢，并且A环和B环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R1或R4中的至少一个不为氢，A环和B环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢，并且A环和B环中的每一个上的不为氢的R1、R2、R3、R4和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1或R4中的至少一个不为氢，并且A环和B环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R1或R4中的至少一个不为氢，A环和B环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢，并且A环和B环中的每一个上的不为氢的R1、R2、R3、R4和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，A环上的R1或R4中的一个不为氢，并且A环上的R3和R4中的一个不为氢。在一些型式中，A环上的R1或R4中的一个不为氢，A环上的R3和R4中的一个不为氢，并且A环上的不为氢的R1、R2、R3、R4和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R1或R4中的一个不为氢，并且A环和B环中的每一个上的R3和R4中的一个不为氢。在一些型式中，在A环和B环中的每一个上的R1或R4中不为氢，A环和B环中的每一个上的R3和R4中的一个不为氢，并且A环和B环中的每一个上的不为氢的R1、R2、R3、R4和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1或R4中的一个不为氢，并且A环、B环和C环中的每一个上的R3和R4中的一个不为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1或R4中的一个不为氢，A环、B环和C环中的每一个上的R3和R4中的一个不为氢，并且A环、B环和C环中的每一个上的不为氢的R1、R2、R3、R4和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，A环上的R1不为氢，并且A环上的R3和R4中的至少一个不为氢。在一些型式中，A环上的R1不为氢，A环上的R3和R4中的至少一个不为氢，并且A环上的不为氢的R2、R3、R4和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R1不为氢，并且A环和B环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R1不为氢，A环和B环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢，并且A环和B环中的每一个上的不为氢的R2、R3、R4和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1不为氢，并且A环、B环和C环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R1不为氢，A环、B环和C环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢，并且A环、B环和C环中的每一个上的不为氢的R2、R3、R4和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，A环上的R4不为氢，并且A环上的R3和R4中的至少一个不为氢。在一些型式中，A环上的R4不为氢，A环上的R3和R4中的至少一个不为氢，并且A环上的不为氢的R1、R2、R3和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R4不为氢，并且A环和B环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢。在一些型式中，A环和B环中的每一个上的R4不为氢，A环和B环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢，并且A环和B环中的每一个上的不为氢的R1、R2、R3和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R4不为氢，并且A环、B环和C环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢。在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个上的R4不为氢，A环、B环和C环中的每一个上的R3和R4中的至少一个不为氢，并且A环、B环和C环中的每一个上的不为氢的R1、R2、R3和R5(如果存在的话)中的每一个为氢。
在一些型式中，R1、R2、R3、R4、R5和R6(在存在时)中的任何一个或多个独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、卤基、未经取代的氨基、经过取代的氨基、未经取代的烷基、经过取代的烷基以及前述的任何组合。在一些型式中，R1、R2、R3、R4、R5和R6(在存在时)中的任何一个或多个独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、卤基、经过取代的或未经取代的氨基和经过取代的或未经取代的烷基。在一些型式中，R1、R2、R3、R4、R5和R6(在存在时)中的任何一个或多个独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、卤基、未经取代的氨基和未经取代的烷基。
在其中任何R基团(例如，R1、R2、R3、R4、R5和/或R6)被指定为“不为氢”的型式中，R基团独立地选自由以下组成的组：羟基、乙酰基、卤基和羧基；经过取代的或未经取代的部分，所述经过取代的或未经取代的部分选自由氨基、烷基、烷氧基、羧基烷基、酰基、酰氨基芳基、芳基烷基、杂烷基、杂烷氧基、杂羧基烷基、杂酰基、杂酰氨基、杂芳基和杂芳基烷基组成的组；以及前述的任何组合。在一些型式中，被指定为“不为氢”的每个R基团独立地选自由以下组成的组：羟基、卤基、未经取代的氨基、经过取代的氨基、未经取代的烷基、经过取代的烷基以及前述的任何组合。在一些型式中，被指定为“不为氢”的每个R基团独立地选自由以下组成的组：羟基、卤基、经过取代的或未经取代的氨基和经过取代的或未经取代的烷基。在一些型式中，被指定为“不为氢”的每个R基团独立地选自由以下组成的组：羟基、卤基、未经取代的氨基和未经取代的烷基。
在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个中的A1是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的A2是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的A3是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的A4是相同的；并且A环、B环和C环中的每一个中的A5是相同的。
在一些型式中，A环、B环和C环中的每一个中的R1是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的R2是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的R3是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的R4是相同的；并且A环、B环和C环中的每一个中的R5是相同的。
在一些型式中，D环与A环、B环和C环中的每一个之间的Y是相同的。
在一些型式中，化合物是对称的。这意味着A环、B环和C环中的每一个中的A1是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的A2是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的A3是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的A4是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的A5是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的R1是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的R2是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的R3是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的R4是相同的；A环、B环和C环中的每一个中的R5是相同的；并且每个Y是相同的。
在一些型式中，化合物是不对称的。这意味着A环、B环和C环中的至少一个中的A1、A2、A3、A4、A5、R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个分别与A环、B环和C环中的至少另一个中的对应的A1、A2、A3、A4、A5、R1、R2、R3、R4和R5不同；和/或至少一个Y与至少另一个Y不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的A1、A2、A3、A4和A5中的至少一个分别与A环、B环和C环中的至少另一个中的对应的A1、A2、A3、A4和A5不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个分别与A环、B环和C环中的至少另一个中的对应的R1、R2、R3、R4和R5不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的A1与A环、B环和C环中的至少另一个中的A1不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的A2与A环、B环和C环中的至少另一个中的A2不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的A3与A环、B环和C环中的至少另一个中的A3不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的A4与A环、B环和C环中的至少另一个中的A4不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的A5与A环、B环和C环中的至少另一个中的A5不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的R1与A环、B环和C环中的至少另一个中的R1不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的R2与A环、B环和C环中的至少另一个中的R2不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的R3与A环、B环和C环中的至少另一个中的R3不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的R4与A环、B环和C环中的至少另一个中的R4不同。在一些型式中，A环、B环和C环中的至少一个中的R5与A环、B环和C环中的至少另一个中的R5不同。在一些型式中，D环与A环之间的Y与D环与B环和C环中的至少一个之间的Y不同。在一些型式中，D环与B环之间的Y与D环与A环和C环中的至少一个之间的Y不同。在一些型式中，D环与C环之间的Y与D环与A环和B环中的至少一个之间的Y不同。
X之间的差异并不指示化合物是对称的还是不对称的，如本文所定义的。因此，在一个或多个X中具有差异的化合物可以是对称的或不对称的，这取决于如以上所概述的A1、A2、A3、A4、A5、R1、R2、R3、R4、R5和Y中的每一个的标识。
在以上文概述的方式指定对称化合物的上下文中，术语“相同”是指由呈相同结构配置的相同原子组成的部分。在以上文概述的方式指定不对称化合物的上下文中，术语“不同”是指由呈不同结构配置的不相同原子或相同原子组成的部分。术语“相同”和“不同”的以上定义具备在定义中不考虑环之间的酸、碱、离子或盐的任何潜在的差异形成的条件。因此，-CO2H、-CO2 -和-CO2Na部分在本文中被视为是“相同”的。如-CH3、-CH2CH3和-CH2CH2CH3等部分在本文中被视为是“不同”的。
在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的所述Y为O；并且所述A环上的A1、A2、A3、A4和A5为C。在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的所述Y为O；所述D环与所述B环之间的Y为O；并且所述A环和所述B环中的每一个上的A1、A2、A3、A4和A5为C。在一些型式中，每个X为CR6；每个Y为O；并且每个A1、A2、A3、A4和A5为C。含有这些特征的式Z化合物为NLRX1的配体。
在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的所述Y为O；所述A环上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环上的A5为N。在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的所述Y为O；所述D环与所述B环之间的Y为O；所述A环和所述B环中的每一个上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环和所述B环中的每一个上的A5为N。在一些型式中，每个X为CR6；每个Y为O；每个A1、A2、A3和A4为C；并且每个A5为N。含有这些特征的式Z化合物为NLRX1的配体。
在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的所述Y为O；所述A环上的A1、A2、A3和A5为C；并且所述A环上的A4为N。在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的所述Y为O；所述D环与所述B环之间的Y为O；所述A环和所述B环中的每一个上的A1、A2、A3和A5为C；并且所述A环和所述B环中的每一个上的A4为N。在一些型式中，每个X为CR6；每个Y为O；每个A1、A2、A3和A5为C；并且每个A4为N。含有这些特征的式Z化合物为NLRX1的配体。
在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的所述Y为O；所述A环上的A1、A2、A4和A5为C；并且所述A环上的A3为N。在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的所述Y为O；所述D环与所述B环之间的Y为O；所述A环和所述B环中的每一个上的A1、A2、A4和A5为C；并且所述A环和所述B环中的每一个上的A3为N。在一些型式中，每个X为CR6；每个Y为O；每个A1、A2、A4和A5为C；并且每个A3为N。含有这些特征的式Z化合物为NLRX1的配体。
在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的所述Y为O；A环上的A2、A3和A4为C；并且所述A环上的A1和A5为N。在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的所述Y为O；所述D环与所述B环之间的Y为O；所述A环和所述B环中的每一个上的A2、A3和A4为C；并且所述A环和所述B环中的每一个上的A1和A5为N。在一些型式中，每个X为CR6；每个Y为O；每个A2、A3和A4为C；并且每个A1和A5为N。含有这些特征的式Z化合物为NLRX1的配体。
在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的Y为NR6；所述A环上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环上的A5为N。在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的Y为S；所述A环上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环上的A5为N。在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的Y为C(R6)2；所述A环上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环上的A5为N。在一些型式中，每个X为CR6；所述D环与所述A环之间的Y为CR7；所述A环上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环上的A5为N。含有这些特征的式Z化合物为NLRX1的配体。
在一些型式中，X中的任何一个、任何两个或所有三个均为N；所述D环与所述A环之间的Y为NR6；所述A环上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环上的A5为N。在一些型式中，X中的任何一个、任何两个或所有三个均为N；所述D环与所述A环之间的Y为S；所述A环上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环上的A5为N。在一些型式中，X中的任何一个、任何两个或所有三个均为N；所述D环与所述A环之间的Y为C(R6)2；所述A环上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环上的A5为N。在一些型式中，X中的任何一个、任何两个或所有三个均为N；所述D环与所述A环之间的Y为CR7；所述A环上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环上的A5为N。含有这些特征的式Z化合物为NLRX1的配体。
在一些型式中，至少一个X为C；所述D环与所述A环之间的所述Y选自由O、S、C(R6)2和CR7组成的组；所述A环上的A1和A3中的至少一个为C；所述A环上的A2为C；并且所述A环上的A5为N。在一些此类型式中，每个X任选地为C；所述D环与所述A环之间的Y任选地为O；所述A环上的A1、A2、A3和A4任选地为C；所述A环上的R1、R2、R3和R4中的至少一个任选地不为氢；和/或所述A环上的R1和R4中的至少一个任选地不为氢。
在一些型式中，每个X为C；所述D环与所述A环之间的所述Y为O；所述A环上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环上的A5为N。在一些此类型式中，所述A环上的R1和R4中的至少一个不为氢。
在一些型式中，每个X为C；每个Y为O；所述A环和所述B环中的每一个上的A1、A2、A3和A4为C；并且所述A环和所述B环中的每一个上的A5为N。在一些此类型式中，所述A环上的R1和R4中的至少一个和所述B环上的R1和R4中的至少一个任选地不为氢。
在一些型式中，至少一个X为C；所述D环与所述A环之间的所述Y选自由O、S、C(R6)2和CR7组成的组；所述A环上的A2和A3为C；并且所述A环上的A5为N。
在一些型式中，至少一个X为C；所述A环上的A1和A3中的至少一个为C；所述A环上的A2为C；所述A环上的A5为N；并且所述A环上的R1、R2、R3和R4中的至少一个不为氢。
在一些型式中，所述A环上的A5为N，所述A环上的R1不为氢。
除非组合明显不一致，否则本文中所描述的化合物的任何型式可以与本文中所描述的化合物的任何其它型式组合。
施用
在本发明的方法的过程中，治疗有效量的本发明化合物可以以多种方式向包含哺乳动物和人的动物施用。虽然在优选实施例中，本发明的化合物是口服或胃肠外施用的，但也设想了其它形式的(如通过医用化合物或气溶胶)施用。
对于口服施用，有效量的化合物可以以例如固态、半固态、液态或气态形式施用。具体实例包含片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂。然而，所述化合物并不限于这些形式。
为了将本发明的化合物调配成片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂或悬浮剂，优选将化合物与粘合剂、崩解剂和/或润滑剂混合。如果需要，则可以使用已知方法将所得到的组合物与稀释剂、缓冲剂、浸润剂、防腐剂和/或香料混合。粘合剂的实例包含结晶纤维素、纤维素衍生物、玉米淀粉、环糊精和明胶。崩解剂的实例包含玉米淀粉、马铃薯淀粉和羧甲基纤维素钠。润滑剂的实例包含滑石粉和硬脂酸镁。进一步地，也可以使用已经被常规使用的添加剂，如乳糖和甘露醇。
对于肠胃外施用，本发明的化合物可以经直肠或通过注射施用。对于直肠施用，可以使用栓剂。栓剂可以通过将本发明的化合物与在体温下融化但在室温下仍为固体的药学上合适的赋形剂混合来制备。实例包含但不限于可可脂、碳蜡和聚乙二醇。所得到的组合物可以使用本领域已知的方法塑造成任何期望的形式。
对于通过注射的施用，本发明的化合物可以皮下注射、皮内注射、静脉注射或肌内注射。用于此类注射的药物可以借助于通过已知方法将本发明的化合物溶解、悬浮或乳化成如植物油、合成树脂酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇等水性或非水性溶剂中来制备。如果期望的话，还可以添加已经被常规使用的添加剂，如增溶剂、渗透调节剂、乳化剂、稳定剂或防腐剂。虽然没有要求，但优选的是组合物为无菌的或灭菌的。
为了将本发明的化合物调配成悬浮剂、糖浆剂或酏剂，可以使用药学上合适的溶剂。所述溶剂中包含水的非限制性实例。
本发明的化合物也可以与具有其它药学上合适的活性的另外的化合物一起使用，以制备医用药物。在有需要的受试者的治疗中可以使用含有本发明的呈单独化合物或呈组合物的一部分的形式的化合物的药物。
本发明的化合物也可以以气溶胶或吸入剂的形式施用，所述气溶胶或吸入剂通过将所述化合物以液体或细粉末的形式与气体或液体喷雾剂和(如果需要的话)已知的助剂(如发泡剂)一起装入到未加压的容器(如气溶胶容器或雾化器)中制备。例如二氯氟甲烷、丙烷或氮的加压气体可以作为喷雾剂使用。
本发明的化合物可以以药物组合物，如片剂、胶囊剂、溶液剂或乳剂的形式施用给有需要的动物包含哺乳动物和人。本发明还设想了以单剂量或多剂量施用本发明中描述的其它形式的化合物，包含但不限于其酯、其药学上合适的盐、其代谢物、其结构相关的化合物、其类似物和其组合。
本发明的化合物还可以以营养添加剂，以食物或营养保健补充剂的形式施用给有需要的动物。
本文使用的术语“预防”、“治疗”或“改善”以及类似术语包含防治和完全或部分治疗。术语还可以包含减轻症状、改善症状、降低症状的严重性、降低疾病的发生率或患者病状中改善治疗结果的任何其它改变。
本发明所描述的化合物优选地以组合物的形式使用和/或施用。合适的组合物优选地为药物组合物、食品或食物补充剂。这些组合物提供了递送化合物的方便形式。本发明的组合物可以包括有效量的用于提高化合物相对于氧化的稳定性或溶解度的抗氧化剂。
在本发明的方法中施用的或用于在本发明的使用中施用的化合物的量为任何合适的量。所述量优选地为1ng/kg体重到20g/kg体重，更优选地在1μg/kg体重到1g/kg体重的范围内，如每天1mg/kg体重到100mg/kg体重的化合物。因此可以调配合适的组合物。生物活性剂给药领域中的技术人员将能够基于已知和众所周知的参数开发针对各种受试者的特定给药方案。
根据本发明的优选组合物为如呈片剂、丸剂、胶囊剂、囊片、多粒子剂(包含颗粒剂、珠粒、小丸和微囊化粒子)、粉剂、酏剂、糖浆剂、悬浮剂和溶液剂形式的药物组合物。药物组合物通常将包括药学上可接受的稀释剂或载体。药物组合物优选地适于胃肠外或口服施用。可口服施用的组合物可以呈固体或液体形式并且可以采取片剂、粉剂、悬浮剂和糖浆剂等形式。任选地，组合物包括一种或多种调味剂和/或着色剂。通常，治疗组合物和营养组合物可以包括不显著干扰化合物对受试者的作用的任何物质。
适用于在此类组合物中使用的药学上可接受的载体在药学领域中是众所周知的。本发明的组合物可以含有0.01-99重量％的本发明的化合物。本发明的组合物通常以单位剂型制备。优选地，本发明中描述的化合物的单位剂量为0.1mg到2000mg，更优选地50mg到1000mg。这些组合物的制备中使用的赋形剂为本领域中已知的赋形剂。
产品形式的组合物的另外的实例为食品补充剂，如呈包括包封材料的软凝胶或硬胶囊形式，所述包封材料选自由以下组成的组：明胶、淀粉、变性淀粉、淀粉衍生物(如葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖)。包封材料可以任选地含有交联剂或聚合剂、稳定剂、抗氧化剂、用于保护光敏填料的光吸收剂、防腐剂等。优选地，本发明中描述的化合物的单位剂量为0.1mg到2000mg，更优选地50mg到1000mg。
通常，术语载体在整个本申请中可以用于表示所描述的化合物可以与其混合的组合物，其可以是药物载体、食品、营养补充剂或膳食助剂。出于本发明的目的，上述材料可以被视为载体。在本发明的某些实施例中，载体对本发明的化合物具有很少的生物活性或不具有生物活性。
剂量：本发明的方法可以包括向有需要的动物施用治疗有效量的化合物。化合物的有效量取决于所施用的化合物的形式、施用的持续时间、施用的途径(例如，口服或肠胃外)、动物的年龄以及动物(包含哺乳动物和人)的病状。
例如，对治疗或预防溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、胃肠炎症、艰难梭菌感染、结肠直肠癌或本文所描述的动物中的任何其它病状有效的化合物的量的范围可以为1ng/kg/天到20g/kg/天。化合物的优选有效量为50μg/kg/天到5g/kg/天，更优选的剂量为1mg/kg/天到100mg/kg/天。在治疗或预防动物的通常炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、胃肠炎症、艰难梭菌感染或结肠直肠癌中，化合物的有效量在向动物施用范围为约1天到1000天的时间段，优选地7到300天的时间段，以及最优选地30到90天的时间段时是最有效的，其中最有效被定义为有益反应的诱导的标识。化合物的有效量可以超出这些时间段继续，以维持慢性疾病中的有益反应。
在预防免疫系统过度活跃中最有效的化合物的量的范围可以为1ng/kg/天到20g/kg/天，优选剂量为1mg/kg/天到100mg/kg/天。
当有效量的本发明化合物以营养、治疗、医学或兽医组合物形式施用时，食品或营养保健产品的优选剂量的范围为约0.01wt/wt％到2.0wt/wt％。
在某些其它实施例中，本发明提供了NLRX1结合性化合物以及还有结构相关的化合物，如选自组成以下的组的化合物在治疗和预防IBD和胃肠(GI)道炎症中的用途：化合物、其酯、其药学上合适的盐、其代谢物、其结构相关的化合物或其组合。
另外，通常，本发明涉及对GI道中的炎症的抑制或激活，其中相关组分包含食道、胃、小肠、盲肠、大肠和直肠。所述作用是由化合物暴露于身体中的各种细胞类型而产生的，所述暴露诱导生物作用。细胞可以包含来自GI道组织的那些、免疫细胞(即巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞)或上皮细胞。在某些实施例中，本发明提供了用本发明的例如呈膳食补充剂形式的化合物治疗受试者以减轻或预防与炎性肠病、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎有关的炎症。本发明还设想了将本发明的化合物施用于GI道，以抑制肠道中细胞粘附和化学引诱物分子的表达。
在实践时，本发明的方法可以是借助于使用如上述的任何可接受的形式通过任何可接受的施用途径向受试者施用化合物，并且允许受试者的身体通过自然过程将化合物分布到靶细胞。如上所述，施用同样可以通过直接注射到含有靶细胞(即，待治疗的细胞)的部位(例如，器官、组织)。
此外，施用可以遵循任何数量的方案。因此，施用可以包括实验化合物的单剂量或单次给药，或在一定时间段内的多剂量或多次给药。因此，治疗可以包括重复施用步骤一次或多次，直到达到期望的结果为止。在某些实施例中，治疗可以继续延长的时间段，如数周、数月或数年。给药方案优选地可以需要施用化合物每天6次到每周一次，更优选的方案是每天三次到每天一次。本领域的技术人员完全能够基于本领域已知的参数容易地开发针对个体的合适的给药方案。本发明化合物的给药量可以用于本发明的这些实施例的方法中。为了治疗IBD、GI道炎症或抑制肠道中的细胞粘附分子的表达，优选的是以约100ng/天到10g/天的量施用化合物。
要施用的量将根据受试者、疾病或病症的阶段、受试者的年龄、受试者的一般健康以及医学领域的技术人员已知和常规考虑的各种其它参数而变化。一般而言，将施用充足量的化合物以使GI道中的炎症的量发生可检测的变化，而对于IBD的量通常与个体正在经历的疼痛的量有关。对于目前未经历IBD症状的患者，可能寻求的变化可以涉及免疫细胞参数，如血液中的TNFα或C反应蛋白水平、血液中的调节性T细胞的百分比或粪便中的钙卫蛋白的浓度。本文公开了合适的量，并且另外合适的量可以由本领域的技术人员在没有过度或过多实验的情况下基于本文所公开的量而标识。
在一方面，本发明提供了一种治疗患有IBD的受试者，或以其它方式预防可能具有克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的遗传易感性的健康个体发展IBD的方法。所述方法还可以涉及治疗患有缓解形式的IBD的患者。根据本发明，术语“患有IBD的受试者”用于指患有显示出IBD典型的一种或多种临床迹象的疾病或病症的受试者(例如，动物、人)。通常，根据本发明的此方面的治疗或预防的方法包括向受试者施用一定量的化合物疗法，所述一定量的化合物疗法在治疗或预防IBD的一种或多种症状或临床表现中或在预防一种或多种此类症状或一种或多种表现的发展中是有效的。
因此，根据本发明的方法，本发明可以提供治疗IBD、与肠内感染相关联的炎症和与自身免疫性疾病相关联的炎症的方法。治疗的方法可以是防治性方法。在某些实施例中，所述方法是治疗IBD、与肠内感染相关联的炎症和与自身免疫性疾病相关联的炎症的方法。在其它实施例中，所述方法是预防IBD的方法。在实施例中，所述方法是预防缓解形式的IBD变得活跃的方法。在仍其它实施例中，所述方法是改善患有IBD、与肠内感染相关联的炎症和与自身免疫性疾病相关联的炎症的受试者的健康状态的方法。引起胃肠感染的微生物包含但不限于：大肠杆菌、志贺氏杆菌、沙门氏菌、致病性弧菌、艰难梭菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersina enterocolitica)、刚地弓形虫、溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)和蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)。因此，在某些实施例中，本发明提供了一种保护患有IBD、与肠内感染相关联的炎症和与自身免疫性疾病相关联的炎症，或有风险发展IBD、与肠内感染相关联的炎症和与自身免疫性疾病相关联的炎症的受试者的健康、器官和/或组织的方法。
在本发明的一个实施例中，治疗IBD的方法包括在不造成目前可获得的IBD治疗(即皮质类固醇、肿瘤坏死因子α抑制剂)中常见的可辨别的副作用，如显著的体重增加、全身免疫抑制、库欣样外观、骨质减少/骨质疏松症或胰腺炎的情况下治疗IBD。也就是说，已经发现，与未接受治疗的其它类似受试者相比，根据本发明的通过至少部分地影响NLRX1在一些细胞中的表达和/或激活而提供治疗作用的治疗的方法提供了有益作用，不会通过例如流体滞留在正在治疗的受试者中造成显著的体重增加。
如此，本发明的方法可以提供减轻炎症的方法。所述方法可以减轻全身性(即，整个受试者的身体内)或局部(例如，施用部位或炎性细胞部位，包含但不限于T细胞和巨噬细胞)炎症。在根据本发明的方法治疗或预防炎症中，可以看到的一个作用是浸润肠的血液单核细胞或巨噬细胞和淋巴细胞的数量减少。另一个作用可以是调节性免疫细胞群，如CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞的增加，或淋巴细胞或巨噬细胞的调节特性的增加(例如，IL-10增加或TNF-α和IL-6减少)。另一个作用可以是炎性基因和/或粘附分子的存在减少。因此，所述方法还可以被视为影响或改变化合物疗法所施用的受试者的免疫反应的方法。受试者可能患有炎性肠病或T细胞的免疫调节或细胞粘附分子的下调是期望结果的另一种病状。
本发明提供了用本文所描述的化合物治疗炎性、免疫介导的或慢性胃肠疾病的方法。炎性、免疫介导的或慢性胃肠疾病的非限制性实例包含炎性肠病(IBD)、嗜酸性胃肠疾病、乳糜泻病、坏死性小肠结肠炎、原发性硬化性胆管炎、慢性糜烂性胃炎、肠易激综合征、小肠淀粉样变性、缺血性结肠炎、放射性结肠炎、憩室炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎等。
本发明提供了用本文所描述的化合物治疗全身性免疫介导的疾病的方法。全身性免疫介导的疾病的非限制性实例包含类风湿性关节炎、多发性硬化症、全身性红斑狼疮、1型糖尿病和牛皮癣。
适用于减轻炎症和效应子免疫反应，治疗炎性、免疫介导的或慢性胃肠疾病或治疗全身性免疫介导的疾病的化合物包含NLRX1的激动剂。NLRX1的激动剂包含对称的式Z化合物和其盐。NLRX1的激动剂还包含不对称的式Z化合物和其盐，其中不对称性是由以下中的一种且仅一种引起的：(1)A环、B环或C环中的一个上的一种或多种成分(即，A1、A2、A3、A4或A5中的一个或多个)相对于A环、B环或C环中的另一个上的对应成分(即，分别为A1、A2、A3、A4或A5中的一个或多个)的C到N或N到C的变化；或(2)A环、B环或C环中的一个上的一种或多种成分(即，R1、R2、R3、R4或R5中的一个或多个)相对于A环、B环或C环中的另一个上的对应成分(即，分别为R1、R2、R3、R4或R5中的一个或多个)的给定部分到相邻同源物的变化。出于本文的目的，R1、R2、R3、R4和/或R5的包含氢任何定义的部分均被视为构成其所存在的环的取代基。如本文所用，“相邻同源物”是指仅通过单个亚甲基(-CH2-)的存在或不存在而不同的两个部分。因此，相邻同源物的非限制性实例包含：氢(-H)和甲基(-CH3)；甲基(-CH3)和乙基(-CH2CH3)；-OH和-CH2OH；-COOH和-COOCH3；以及-COOCH3和-CH2COOCH3。明确地，被定义为氢的R基团和被定义为甲基的R基团在本文中被视为相邻同源物。相反，不是相邻同源物的分子的实例包含：氢(-H)和乙基(-CH2CH3)、-OH、-CH2OH、-COOH、-COOCH3和-CH2COOCH3中的任一个；甲基(-CH3)和丙基(-CH2CH2CH3)；以及-COOH和-CH2COOCH3。
激动剂也适用于例如通过促进细菌共生菌株的生长的激动剂治疗病原菌的胃肠感染，并且由此通过竞争性抑制来控制病原菌株。
本发明的方法可以提供增加炎症的方法。所述方法可以增加全身性(即，整个受试者的身体内)或局部(例如，施用部位或炎性细胞部位，包含但不限于T细胞和巨噬细胞)炎症。在根据本发明的方法治疗或预防炎症中，可以看到的一个作用是如CD4+Tbet+T辅助1细胞或中性粒细胞等免疫细胞群的增加，或如TNF-α或IFN-γ等炎性细胞因子产生的增加。因此，所述方法还可以被视为支持化合物疗法所施用的受试者的免疫反应的方法。受试者可能患有其中在治疗疾病中免疫系统的激活是有益的感染或癌症。
本发明还提供了用本文所描述的化合物治疗感染性疾病的方法。此类感染性疾病的非限制性实例包含病毒感染、细菌感染和真菌感染。
病毒感染的非限制性实例包含：来自腺病毒科属中的病毒，如腺病毒的感染；疱疹病毒科属中的病毒，如单纯疱疹、1型、单纯疱疹、2型、水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus)、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus)、人巨细胞病毒(humancytomegalovirus)、人疱疹病毒(human herpesvirus)和8型；乳头瘤病毒科属中的病毒，如人乳头瘤病毒；多瘤病毒科属中的病毒，如BK病毒和JC病毒；痘病毒科属中的病毒，如天花；肝病毒科属中的病毒，如乙型肝炎病毒；细小病毒科属中的病毒，如人博卡病毒(humanbocavirus)和细小病毒B19；星状病毒科属中的病毒，如人星状病毒(human astrovirus)；杯状病毒科属中的病毒，如诺沃克病毒(norwalk virus)；微小核糖核酸病毒科属中的病毒，如柯萨奇病毒(coxsackievirus)、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)和鼻病毒(rhinovirus)；冠状病毒科属中的病毒，如急性呼吸综合征病毒；黄病毒科属中的病毒，如丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)、黄热病病毒(yellow fevervirus)、登革热病毒(dengue virus)和西尼罗病毒(West Nile virus)，披膜病毒科属中的病毒，如风疹病毒；肝炎病毒科属中的病毒，如戊型肝炎病毒(hepatitis E virus)；逆转录病毒科属中的病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)；正粘病毒科属中的病毒，如流感病毒；砂粒病毒科属中的病毒，如瓜纳瑞托病毒(guanarito virus)、胡宁病毒(junin virus)、拉沙病毒(lassa virus)、马丘波病毒(machupo virus)和萨比亚病毒(sabiávirus)；布尼雅病毒科属中的病毒，如克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)；丝状病毒科属中的病毒，如埃博拉病毒(ebola virus)和马尔堡病毒(marburg virus)；副粘病毒科属中的病毒，如麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、人偏肺病毒(human metapneumovirus)、亨德拉病毒(hendra virus)和尼帕病毒(nipah virus)；弹状病毒科属中的病毒，如狂犬病病毒；未分类的病毒，如丁型肝炎病毒(hepatitis D virus)；以及呼肠孤病毒科属中的病毒，如轮状病毒、环状病毒、钶钽铁矿石病毒(coltivirus)和版纳病毒(banna virus)等。
细菌感染的非限制性实例包含以上所描述的除了以下之外的细菌的感染：炭疽杆菌、蜡样芽孢杆菌、百日咳博代氏杆菌、伯氏疏螺旋体、牛布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌空肠弯曲菌(Brucella suis Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、绿脓杆菌、立氏立克次氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、梅毒螺旋体、惠普尔养障体(Tropheryma whippelii)和/或产生的惠普尔病(Whipple's disease)、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)以及来自上述微生物属的其它物种。
真菌感染的非限制性实例包含以下的感染：引起曲霉病的曲霉属的真菌，如烟曲霉菌；引起芽生菌病的芽生菌属的真菌，如皮肤芽生菌；引起念珠菌病的念珠菌属的真菌，如白色念珠菌；引起球孢子菌病(溪谷热)的球孢子菌属的真菌；引起隐球菌病的隐球菌属的真菌，如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和格特隐球菌(Cryptococcusgattii)；引起癣菌病的皮癬菌真菌；引起真菌性角膜炎的真菌，如镰刀菌(Fusarium)物种、曲霉菌(Aspergillus)物种和念珠菌(Candida)物种；引起组织胞浆菌病的组织胞浆菌属的真菌，如荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)；引起毛霉菌病的毛霉目的真菌；酵母属的真菌，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；引起肺囊虫肺炎的肺囊虫属的真菌，如耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii)；以及引起孢子丝菌病的孢子丝菌属的真菌，如申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)。
本发明还提供了用本文所描述的化合物治疗癌症的方法。癌症的非限制性实例包含结肠直肠癌、喉癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞白血病、肝细胞癌、胃肠间质瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓增生性病症等。
适用于增加炎症反应和效应子免疫反应或治疗感染性疾病或癌症的化合物包含NLRX1的拮抗剂。NLRX1的拮抗剂包含不属于以上提供的激动剂定义的不对称的式Z化合物。NLRX1的示例性拮抗剂包含不对称的式Z化合物和其盐，其中不对称性是由以下引起的：(1a)A环、B环或C环中的一个上的一种或多种成分(即，A1、A2、A3、A4或A5中的一个或多个)相对于A环、B环或C环中的另一个上的对应成分(即，分别为A1、A2、A3、A4或A5中的一个或多个)的C到N或从N到C的变化；或(1b)A环、B环或C环中的一个上的一种或多种成分(即，R1、R2、R3、R4或R5中的一个或多个)相对于A环、B环或C环中的另一个上的对应成分(即，分别为R1、R2、R3、R4或R5中的一个或多个)的给定部分到相邻同源物的变化；或(2)A环、B环或C环中的一个上的一种或多种成分(即，R1、R2、R3、R4或R5中的一个或多个)相对于A环、B环或C环中的另一个上的对应成分(即，分别为R1、R2、R3、R4或R5中的一个或多个)的给定部分到除了相邻同源物以外的部分的变化。
鉴于以上方法，显而易见的是，本发明提供了用于在接触细胞，如在治疗受试者的细胞中使用的NLRX1结合性化合物疗法。以上讨论集中于将本发明的化合物用作组合物的一部分以供在通常被视为药物或医疗环境中使用。
本发明中描述的用于治疗IBD、GI道炎症和所描述的其它病状的化合物可以被调配为药物、营养组合物、功能性食品组合物或膳食助剂。
作为NLRX1的配体，本文所描述的化合物可以在测试与NLRX1的结合的测定中用作阳性对照。此类测定包含如实例中所描述的表面等离子共振测定或其它方法。
无论是否明确描述，本文所描述的要素和方法步骤可以以任何组合使用。
除非由所引用的组合的上下文另有说明或明确暗示相反，否则如本文所使用的方法步骤的所有组合可以以任何顺序执行。
如本文所使用的，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”、和“所述(the)”包含复数指示物。
如本文所使用的数字范围旨在包含所述范围内所含有的每个数字和数字子集，无论是否具体公开。进一步地，这些数值范围应被解释为对涉及所述范围内的任何数字或数字子集的权利要求提供支持。例如，从1到10的公开内容应被解释为支持2到8、3到7、5到6、1到9、3.6到4.6、3.5到9.9等范围。
本文引用的所有专利、专利出版物和同行评审出版物(即，“参考文献”)以相同的程度通过引用明确并入本文，其程度如同具体且独立地指示每个独立的参考值通过引用并入。在本公开与并入的参考文献之间存在冲突的情况下，应以本公开为准。
应当理解，本发明不限于本文展示和描述的部件的特定构造和布置，而是包含落入权利要求范围内的其如此修改的形式。
实例
分子建模
实例1.NLRX1配体的分子建模
使用先前描述的NLRX1的配体，包含病毒RNA和膳食脂质(石榴酸和二十二碳六烯酸)，确定了NLRX1蛋白上存在两个高电位结合性位点[5]。这些配体被对接到NLRX1(pdb：3UN9)的C末端的所公开结构上，以建立重要的结合残基。
方法
虚拟筛选.为了提供对初步支架的另外的洞察力，在两个位点的每个位点处使用AutoDock Vina将配体数据库对接到NLRX1上，使用一定大小的长方体搜索网格(58×40×40埃)以提供配体的预测的结合亲和力和构象。将结合亲和力归一化为配体的分子量。选择顶部配体以进一步检查结合姿势。
化合物生成.根据所标识的残基和预测的生化相互作用，生成针对高亲和力NLRX1配体的结构。使用WebMo生成结构并对结构进行化学优化。以.pdb格式生成结构文件，并且借助于Gasteiger方法通过计算电荷来将结构文件转化为.pdbqt格式。使用AutoDock Vina对接结构以确认结合亲和力。
分析.通过最小化总分子间能、总内能和扭转自由能，按照被归一化为分子量的表示最有利的结合姿势的最低所预测结合亲和力对化合物进行初步排名。然后基于与NLRX1上的关键结合残基的有利距离使化合物优先化。
结果
根据对新化学实体(NCE)的虚拟筛选和优化，本文公开的具有120°旋转对称性的化合物和式Z的类似假对称衍生物被标识为对NLRX1具有强的结合亲和力。参见图1A-1P。这些NCE包含具有通过单连接子原子连接到三个外环结构的中心苯或氮杂苯环的化合物。所选择的家族成员的结合亲和力在图2A-2D中提供。相应最低能量结合性配置中的预测的结合亲和力的范围为-8.9kcal/mol到-11.7kcal/mol。所有提出的化合物的预测的结合亲和力均高于低亲和力NLRX1配体、石榴酸的结合亲和力，所述石榴酸的已公布的结合亲和力为-6.2kcal/mol。观察到此等级的NCE中的高亲和力结合性化合物为2,2'-(5-苯氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(3-甲基吡啶)，其被称为NX-43。观察到高亲和力结合性、完全对称的化合物为-10.6kcal/mol的1,3,5-三(6-甲基吡啶-2-基氧基)苯，其被称为NX-13。用亚甲基(NX-38)、羰基(NX-46)或硫(NX-48)替代NX-13的氧连接子略微降低了预测的结合，但结合仍高于预测的配体阈值。基于结合结果和预测的理化性质，从此等级中选择化合物以用于合成和功能测试。
药物化学
实例2.NX-13
将碳酸钾添加到苯-1,3,5-三醇和2-溴-6-甲基吡啶于二甲基甲酰胺中的溶液中，并且用微波在200℃下将反应混合物辐照4小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得1,3,5-三(6-甲基吡啶-2-基氧基)苯。HNMR(400MHz,DMSO-d6):7.767-7.728(t,J＝8.0Hz,3H),7.042-7.024(d,J＝7.2Hz,3H),6.849-6.829(d,J＝8.0Hz,3H),6.667(s,3H),2.352(s,9H).
实例3.NX-37
2-(3,5-双(6-甲基吡啶-2-基氧基)苯氧基)-4,6-二甲基嘧啶(NX-37)的合成为五步骤过程，如下所详述的。
将碳酸钾添加到5-溴苯-1,3-二醇和6-氟-2-甲基吡啶于二甲基甲酰胺中的溶液中，并且用微波在200℃下将反应混合物辐照4小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得6,6'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(2-甲基吡啶)。
将碳酸铯添加到6,6'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(2-甲基吡啶)于乙二醇中的溶液中，并且在120℃下将反应混合物加热16小时。用水稀释反应混合物，并用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2-(3,5-双(6-甲基吡啶-2-基氧基)苯氧基)乙醇。
将氢氧化钾添加到2-(3,5-双(6-甲基吡啶-2-基氧基)苯氧基)乙醇于二甲亚砜中的溶液中，并且在100℃下加热3小时。用水稀释反应混合物，并用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得3,5-双(6-甲基吡啶-2-基氧基)苯酚。
在0℃下将三氯化磷添加到4,6-二甲基嘧啶-2-醇中，并且在110℃下加热16小时。将溶剂从反应混合物中蒸发。用冰冷的水淬灭反应，并且用乙酸乙酯萃取反应。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2-氯-4,6-二甲基嘧啶。
将碳酸钾添加到含3,5-双(6-甲基吡啶-2-基氧基)苯酚和2-氯-4,6-二甲基嘧啶的二甲基甲酰胺中，并且用微波在200℃下将反应混合物辐照3小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2-(3,5-双(6-甲基吡啶-2-基氧基)苯氧基)-4,6-二甲基嘧啶。HNMR(400MHz,CDCl3-d6):7.56(t,J＝7.6Hz,2H),6.89(d,J＝7.2Hz,2H),6.83(d,J＝2.4Hz,2H),6.78-6.77(m,2H),6.72(d,J＝8.0Hz,2H),2.46(s,6H),2.40(s,6H).
实例4.NX-43
2,2'-(5-苯氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(3-甲基吡啶)(NX-43)的合成为五步骤过程，如下所详述的。
将碳酸钾添加到5-溴苯-1,3-二醇和2-氟-3-甲基吡啶于二甲基甲酰胺中的溶液中。用微波在200℃下将反应混合物辐照4小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(3-甲基吡啶)。
将碳酸铯添加到2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(3-甲基吡啶)、苯酚、催化碘化铜和二甲基甘氨酸于DMF中的溶液中，并且用微波在150℃下将反应混合物辐照3小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-苯氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(3-甲基吡啶)。H NMR(400MHz,CDCl3-d6):8.02(d,J＝3.6Hz,2H),7.50(d,J＝7.2Hz,2H),7.35-7.31(m,2H),7.12-7.10(m,3H),6.93-6.90(m,2H),6.61-6.60(m,1H),6.566-6.56(t,J＝2.4Hz,2H),2.29(S,6H).
实例5.NX-44
6,6'-(5-苯氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(5-甲基-3-吡啶醇)(NX-44)的合成为四步骤过程，如下所详述的。
将碳酸钾添加到5-溴苯-1,3-二醇和2-氟-3-甲基-5-硝基吡啶的溶液中并且在室温下搅动16小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(3-甲基-5-硝基吡啶)。
将碳酸铯添加到2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(3-甲基-5-硝基吡啶)、苯酚、催化碘化铜和二甲基甘氨酸于DMF中的溶液中，并且用微波在150℃下将反应混合物辐照3小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-苯氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(3-甲基-5-硝基吡啶)。
将PtO2添加到搅动的2,2'-(5-苯氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(3-甲基-5-硝基吡啶)于甲醇中的搅拌溶液中。在室温下在氢气气氛下将反应混合物搅动2小时。通过LCMS监测反应。通过硅藻土床过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，以获得6,6'-(5-苯氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(5-甲基吡啶-3-胺)。
在80℃下将亚硝酸钠添加到搅动的6,6'-(5-苯氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(5-甲基吡啶-3-胺)的水性硫酸溶液中，持续1小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得6,6'-(5-苯氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(5-甲基-3-吡啶醇)。
实例6.NX-45
6,6',6”-(苯-1,3,5-三基三(氧基))三(5-甲基吡啶-3-胺)(NX-45)的合成为两步骤过程，如下所详述的。
将碳酸钾添加到苯-1,3,5-三醇和2-氟-3,6-二甲基-5-硝基吡啶于二甲基形式胺中的溶液中，并且在室温下搅动反应混合物，持续16小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得1,3,5-三(3-甲基-5-硝基吡啶-2-基氧基)苯。
将PtO2添加到搅动的1,3,5-三(3-甲基-5-硝基吡啶-2-基氧基)苯于甲醇中的溶液中。在室温下在氢气气氛下将反应混合物搅动2小时。通过LCMS监测反应。通过硅藻土床过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，以获得6,6',6”-(苯-1,3,5-三基三(氧基))三(5-甲基吡啶-3-胺)。H NMR(400MHz,DMSO-d6):7.390(d,J＝2.4Hz,3H),6.91(d,J＝2.4Hz,3H),6.019(s,3H),5.130(br s,6H),2.051(s,9H).
实例7.NX-50
在2小时的时间段内，向搅动的苯-1,3,5-三醇于DMSO中的溶液中分批添加NaH。之后，逐滴添加2-溴-3-甲基吡啶，并且允许其在150℃下搅动过夜。监测反应进程。在起始原料转化之后，用冰冷的水稀释反应混合物并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得1,3,5-三(3-甲基吡啶-2-基氧基)苯。
实例8.NX-53
2,2'-(5-苯氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)(NX-53)的合成为五步骤过程，如下所详述的。
将碳酸钾添加到5-溴苯-1,3-二醇和2-氟-6-甲基吡啶于二甲基甲酰胺中的溶液中。用微波在200℃下将反应混合物辐照4小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
将碳酸铯添加到2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)、苯酚、催化碘化铜和二甲基甘氨酸于DMF中的溶液中，并且用微波在150℃下将反应混合物辐照3小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-苯氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
实例9.NX-54
2,2'-(5-吡啶-2-基氧基)-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)(NX-54)的合成为四步骤过程，如下所详述的。
将碳酸钾添加到5-溴苯-1,3-二醇和2-氟-6-甲基吡啶于二甲基甲酰胺中的溶液中。用微波在200℃下将反应混合物辐照4小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
将碳酸铯添加到2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)和乙二醇的溶液中，并且将反应混合物在130℃下用微波辐照6小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-乙醇氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
将氢氧化钾添加到2,2'-(5-乙醇氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)于二甲亚砜中的溶液中，并且在120℃下搅动反应混合物。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(1,3-苯-5-醇)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
将碳酸钾添加到2,2'-(1,3-苯-5-醇)双(氧基)双(6-甲基吡啶)和6-氯吡啶于二甲基甲酰胺中的溶液中。用微波在200℃下将反应混合物辐照4小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-(吡啶-2-基氧基)-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
实例10.NX-55
2,2'-(5-(6-甲基苯氧基)-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)(NX-55)的合成为两步骤过程，如下所详述的。
将碳酸钾添加到5-溴苯-1,3-二醇和2-氟-6-甲基吡啶于二甲基甲酰胺中的溶液中。用微波在200℃下将反应混合物辐照4小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
将碳酸铯添加到2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)、6--甲基苯酚、催化碘化铜和二甲基甘氨酸于DMF中的溶液中，并且用微波在150℃下将反应混合物辐照3小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-(6-甲基苯氧基)-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
实例11.NX-56
2,2'-(5-苯-6-醇)氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)(NX-56)的合成为四步骤过程，如下所详述的。
将碳酸钾添加到5-溴苯-1,3-二醇和2-氟-6-甲基吡啶于二甲基甲酰胺中的溶液中。用微波在200℃下将反应混合物辐照4小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
将碳酸铯添加到2,2'-(5-溴-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)和乙二醇的溶液中，并且将反应混合物在130℃下用微波辐照6小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-乙醇氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
将氢氧化钾添加到2,2'-(5-乙醇氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)于二甲亚砜中的溶液中，并且在120℃下搅动反应混合物。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(1,3-苯-5-醇)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
将碳酸钾添加到2,2'-(1,3-苯-5-醇)双(氧基)双(6-甲基吡啶)和6-氯吡啶-2-醇于二甲基甲酰胺中的溶液中。用微波在200℃下将反应混合物辐照4小时。用冰冷的水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取反应混合物。用硫酸钠对经过组合的有机层进行干燥，并且在减压下蒸发，以获得2,2'-(5-(苯-6-醇)氧基-1,3-亚苯基)双(氧基)双(6-甲基吡啶)。
受体结合
实例12.与NLRX1的表面等离子共振结合
介绍
当针对治疗靶标设计新的小分子配体时，虚拟筛选和计算机中实验是用于标识所关注的支架并对其进行优先化的有价值的手段。为了验证这些发现，存在许多体外方法来确定小分子对所关注的蛋白质的亲和力。一种特定方法是表面等离子共振，所述表面等离子共振能够通过使配体的悬浮液在固定化的纯化蛋白之上流动来评估稳态结合。此方法用于评价前瞻性NLRX1配体。
方法
NLRX1的产生和纯化.将人NLRX1(www.uniprot.org；UniProtKB-Q86UT6(NLRX1_HUMAN))克隆到大肠杆菌中，在毕赤酵母(Pichia pastoris)中扩增和转染。将毕赤酵母铺板到腺嘌呤选择性培养基上。选择稳定的经过转染的菌落，并且使其在YPD肉汤中在30℃下在240RPM摇动下生长24小时。使用了起始培养物来接种含有生物素并且用磷酸钾缓冲的基础培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1％山梨糖醇、2％酵母氮基)。在30℃下、在240RPM下，将接种的基础培养基温育48小时。然后通过离心使毕赤酵母沉淀，并且重悬于含有生物素并且用磷酸钾缓冲的表达培养基(1％山梨糖醇、2％酵母氮基)中。每天通过添加甲醇来诱导培养物以用于蛋白质产生，并且在28℃下、在240RPM下温育，持续总共4天。温育之后，通过离心使细胞沉淀，并且通过超声使其裂解。通过使用固定的金属亲和力色谱的快速蛋白液相色谱(AktaPrime)对重组NLRX1蛋白进行纯化。以1mL等分试样对蛋白质的级分进行洗脱，并且针对NLRX1含量进行评价。使用类似的方法生成经过突变的NLRX1蛋白，以通过改变丙氨酸的四个残基(D677A、F680A、F681A和E684A)来破坏预测的结合位点内的结合。
表面等离子共振.使用了Biacore T200评价与NLRX1蛋白的结合。使用了NLRX1-WT和NLRX1突变体作为固定在CM5传感器芯片上的蛋白质。在pH 4.0的10mM乙酸钠缓冲液中对NLRX1-WT进行稀释，并且使用标准胺偶联化学法将其固定到流动池上，达到约3700RU的水平。在pH 4.0的10mM乙酸钠缓冲液中对NLRX1突变体进行稀释，并且使用标准胺偶联化学法将其固定到流动池上，达到约3100RU的水平。使用20mM MOPS、150mM NaCl、5mM乙酸钠、1mMEDTA、0.05％Tween-20、pH 8.0缓冲液(运行缓冲液)作为固定运行缓冲液。基于固定的反应值，计算理论Rmax值。Rmax值假定1:1的相互作用机理。对结合到固定蛋白上的所有分析物执行过夜动力学。在运行缓冲液+1％DMSO的存在下执行动力学实验。将所有溶液的流速维持在50μL/分钟。分析物浓度为0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM和40μM。
结果
表面等离子共振验证了NX-13、NX-37和NX-43与NLRX1的预测的结合(图3)。具体地，NX-13、NX-37和NX-43被标识为以不同亲和力和理化性质与NLRX1结合的小分子。与经过突变的NLRX1蛋白的结合的丧失(图3)验证了预测的结合是这些配体的结合的主要位点。NX-13以30.2μM的KD与NLRX1蛋白结合(图3)。
实验研究
实例13.体外免疫学筛选
介绍
许多自身免疫性疾病的发病机制的中心是CD4+T辅助细胞的功能障碍[3]。这些细胞在维持个体的健康、放大免疫反应和促进体内平衡中是重要的。然而，在自身免疫性和炎性疾病的情况下，CD4+T辅助细胞可能变得过度活跃，在不存在刺激的情况下被激活或无法解决炎症。在这些场景下，可以减轻或预防炎症的疗法为用于疾病管理的有价值的治疗。为此，验证了此细胞类型中的抗炎NLRX1配体的功能性治疗潜力。
与自身免疫性疾病相反，某些感染性疾病和癌症需要增加炎性反应以有效控制或消除疾病的起因[30]。因此，治疗剂可以影响CD4+T辅助细胞中的反应，从而增强免疫反应并驱动炎症。在这些情况下，效应细胞类型此T辅助1细胞和T辅助17细胞的增加可以通过增加IFNγ、TNFα、IL-17和IL-6的产生而使个体受益。如癌症模型中的NLRX1的已发布的结果所证明的[17，18，21]，NLRX1通路的调节可以产生这些反应。
方法
细胞培养.从C57BL/6小鼠中切除脾脏。在显微镜载玻片的磨砂端之间压碎脾脏并过滤，以提供细胞悬浮液。通过低渗裂解对红细胞进行裂解。将其余细胞洗涤并过滤。基于阴性选择使用磁性分选，将CD4+T细胞富集在悬浮液中。收集细胞并将其铺板在涂覆有抗CD3的96孔板中，并在以下存在的情况下培养：0、0.1、1或10微摩尔的NX-13、NX-37、NX-43、NX-44或NX-50；0、0.1或1微摩尔的NX-53、NX-54、NX-55或NX-56；或10、50或100纳摩的NX-45，持续48小时。在培养的最后6小时期间，用佛波醇12-肉豆蔻酸脂-13-乙酸酯(PMA)和离子霉素刺激细胞。
免疫学分析.从96孔板收集细胞，并用抗体的混合物对细胞染色，以用于通过流式细胞术进行免疫表型。收集培养物上清液，并针对细胞因子浓度通过细胞术微珠阵列对其进行测定。在BD FACS Celesta上捕获数据，并使用FacsDiva对数据进行分析。
结果
NX-13降低了野生型细胞培养物内IFNγ产生和TNFα产生的CD4+T细胞的比例(图4A和4B)。在不存在NLRX1的情况下，这些作用消失了(图4A和4B)。
在体外以10、50和100纳摩尔测试了NX-45(图5A和5B)。在CD4+T细胞中，NX-45会减少TNFα+(图5B)和IFNγ+(图5A)细胞。TNFα+细胞的显著减少发生在10nM和更高的浓度下，而IFNγ+细胞的显著减少发生在50nM和更高的浓度下。在更高的浓度下，NX-50还减少了IFNγ+和TNFα+细胞(图5C和5D)。NX-55在IFNγ产生的细胞中仅提供了小的减少(图6I)，并且NX-54在高浓度下提供了最小作用(图6H)。
根据炎性细胞因子的下调，这些结果表明NX-13、NX-45和NX-50是NLRX1的激活子。鉴于NLRX1缺陷细胞中的活性的丧失，分子的家族通过NLRX1通路起作用。与计算机内和体外结合的结果组合，通过NLRX1通路的作用是与NLRX1直接结合的结果。
NX-37、NX-43、NX-44在增加具有明显特征的炎性反应(图6A-6F)中均是有效的。在两种情况下，NX-37(图6A和6B)、NX-43(图6C和6D)、NX-44(图6E和6F)都增加了TNFα(图6B、6D、6F)和IFNγ(图6A、6C、6E)产生细胞的比例，如通过流式细胞术所测量的。NX-53和NX-56较弱地增加了IFNγ产生细胞(图6G和6J)。观察到NX-43与NX-37相比对TNFα产生细胞和IFNγ产生细胞具有更大的作用，而NX-37呈现了在所测试的范围内的剂量依赖性作用。任一种小分子均未引发IL-10产生细胞的变化。
基于所描述的结果和所发布的关于NLRX1通路的知识，NX-37、NX-43和NX-44通过直接结合起到NLRX1的特异性抑制剂的作用。观察到的利用这些抑制剂治疗的炎性反应的增加与NLRX1的缺乏导致更大的炎症的观察一致。
实例14.NX-13在IBD急性模型中的用途
介绍
炎性肠病是多因素疾病，其许多疾病过程都是由上皮屏障的作用或功能障碍引起的[31]。所述疾病的突出且接受的动物模型是通过在小鼠的饮用水中施用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的。DSS的摄取起到破坏并损害远端胃肠道中，特别是结肠中的上皮屏障的作用。上皮屏障的破坏允许结肠粘膜中的微生物组的浸润以及随后的免疫细胞的募集和激活。此模型允许在肠炎症的受控系统中评估新疗法。
先前，已经使用了DSS模型来确定与表达NLRX1的野生型小鼠相比，缺乏NLRX1的小鼠的疾病严重程度已经加重[3,4]。另外，当在整个DSS时间过程中评估NLRX1在野生型小鼠中的表达时，NLRX1在高炎症时期被抑制，这表明所述分子的药理激活可以保护免于此降低的表达并诱导有益的抗炎作用。
方法
DSS模型.给予小鼠含8％(w/v)DSS的饮用水七天，以诱导上皮层的破坏。在项目启动时，小鼠为8周龄，并且在8％的DSS上放置24小时之后开始给药。每天对小鼠称重并针对疾病的症状(腹泻、直肠出血、直肠炎症、整体行为)进行评分。
治疗施用.在0.5％甲基纤维素(12-15cP)溶液中制备NX-13。使用的剂量为20mg/kg，每天一次递送。每周对小鼠称重以更新剂量调配物。根据每个性别的平均体重计算剂量。通过口胃强饲0.2mL体积的剂量递送口服剂量。
流式细胞术.将结肠收集到含有胶原酶(300U/mL)和DNase(50U/mL)的RPMI/FBS缓冲液中，以用于消化。在37℃下在搅动下将组织消化，持续60分钟。通过100μm过滤器将所得细胞悬浮液过滤、离心(300×g，8分钟)，并在新鲜的RPMI中洗涤。在过滤所产生的单个细胞悬浮液之后，由覆盖到70％Percoll溶液上的Percoll梯度的含细胞的40％Percoll对免疫细胞进行纯化。离心之后，收集中间相并洗涤以获得富集的结肠固有层细胞级分。在96孔板中，在连续的活的染色中，用细胞外抗体(CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、NK1.1、CD25、F4/80、CD11b、Gr1、CX3CR1、CD64)和细胞内抗体(Tbet、RORγT、FOXP3、IFNγ、IL17、IL10)的混合物对细胞进行标记。使用具有FACSDiva软件的FACS Celesta流式细胞仪获取数据。
基因表达.使用Qiagen RNeasy微型试剂盒生成来自结肠和细胞的总RNA。使用BioRad iScript cDNA合成试剂盒生成cDNA。通过用Taq DNA聚合酶对来自标准PCR反应的经过纯化的产物进行系列稀释，然后使用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化来生成标准曲线。用BioRad CFX96热循环仪上的SybrGreen supermix从定量实时PCR中获得表达水平，然后对β-肌动蛋白的表达进行归一化。
结果
口服NX-13治疗降低了受到DSS激发的野生型小鼠的疾病活性。此结肠炎模型中的疾病活性是体重减轻、直肠出血的存在和严重度、粪便稠度、疼痛症状和小鼠的总体行为的汇总评分。NX-13在整个激发过程中降低了疾病活性，在第6天时观察到最大降低了50％(图7A)。
在DSS模型内，疾病是在上皮处引起的，但通过结肠固有层内免疫细胞的存在和丰度调节。此模型中的炎症和组织损伤的主要驱动因子为T辅助1细胞和中性粒细胞。口服NX-13治疗显著减少了结肠固有层中的Th1细胞和中性白细胞的数量，如通过流式细胞术所测量的。在DSS激发的第7天，中性粒细胞(图7B)和Th1细胞(图7C)两者均减少了多于50％。然而，NX-13并未减少FOXP3+调节性CD4+T细胞的数量，所述FOXP3+调节性CD4+T细胞是结肠中负责组织稳态的主要细胞类型。
在DSS激发的第7天，从媒剂和经过NX-13治疗的小鼠的整个结肠中分离出RNA。使用了RNA来测量炎性和抗炎细胞因子的基因表达(图8A-D)。NX-13治疗减少了整个结肠中Ifng(图8A)、Tnfa(图8C)和Il17(图8D)的表达，同时增加了Il10的表达(图8B)。重要的是，IFNγ和TNFα是IBD中的炎症的两个主要驱动因子。用NX-13口服治疗之后的这些细胞因子在结肠水平下的减少是功效的关键标志。
实例15.NX-13在IBD的慢性模型中的用途
介绍
克罗恩氏病和溃疡性结肠炎是慢性疾病，伴有零星时期的未解决的炎性耀斑，导致对肠粘膜的进行性损伤[32，33]。小鼠中的Mdr1a的丧失会损害上皮细胞正确处理和排出废物的能力，从而导致自发性结肠炎[34]。这些小鼠的结肠炎是慢性的，并渗透在肠的整个层中。[35]Mdr1a-/-模型因此由于其对免疫活性动物的用途、上皮细胞机制的内在功能障碍、突出的炎性反应以及作为人IBD中的新兴风险等位基因的MDR1基因的翻译相关性而成为用于测试用于诱导和维持降低的疾病严重度的疗法的慢性施用的理想模型[36]。
方法
MDR1a-/-模型.缺乏MDR1a的小鼠自发发展了结肠炎。MDR1a-/-在4周龄时开始接受NX-13治疗(口服，20mg/kg)，并且继续治疗，直到10周龄为止。每周对小鼠称重并评分。
治疗施用.在0.5％甲基纤维素(12-15cP)溶液中制备NX-13。使用的剂量为20mg/kg，每天一次递送。每周对小鼠称重以更新剂量调配物。根据每个性别的平均体重计算剂量。通过口胃强饲0.2mL体积的剂量递送口服剂量。
流式细胞术.将结肠收集到含有胶原酶(300U/mL)和DNase(50U/mL)的RPMI/FBS缓冲液中，以用于消化。在37℃下在搅动下将组织消化，持续60分钟。通过100μm过滤器将所得细胞悬浮液过滤、离心(300×g，8分钟)，并在新鲜的RPMI中洗涤。在过滤所产生的单个细胞悬浮液之后，由覆盖到70％Percoll溶液上的Percoll梯度的含细胞的40％Percoll对免疫细胞进行纯化。离心之后，收集中间相并洗涤以获得富集的结肠固有层细胞级分。在96孔板中，在连续的活的染色中，用细胞外抗体(CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、NK1.1、CD25、F4/80、CD11b、Gr1、CX3CR1、CD64)和细胞内抗体(Tbet、RORγT、FOXP3、IFNγ、IL17、IL10)的混合物对细胞进行标记。使用具有FACSDiva软件的FACS Celesta流式细胞仪获取数据。
组织病理学.从收集到10％经过缓冲的福尔马林中并包埋在石蜡中的结肠部分中制备经过H&E染色的结肠切片。由经过委员会认证的兽医病理学家通过Olympus显微镜检查载玻片，并用Image-Pro软件收集图像。针对白细胞浸润、上皮糜烂和粘膜增厚，对样品进行评分(0-4)。
结果
口服NX-13治疗会降低Mdr1a-/-小鼠的疾病活性。此结肠炎模型中的疾病活性是体重减轻、直肠出血的存在和严重度、粪便稠度、疼痛症状和小鼠的总体行为的汇总评分。NX-13在整个激发过程中降低了疾病活性，在第六周治疗时观察到最大降低了70％(图9)。
在MDR1a-/-小鼠中，口服NX-13极大降低了结肠病理学(图10A和10B)。在六周的治疗之后，NX-13防止白细胞聚集体的发展和粘膜增厚。进一步地，NX-13减少了总体白细胞浸润和上皮糜烂。
口服NX-13显著改变了结肠固有层内的免疫细胞的比例(图11A和10B)。具体地，NX-13降低了细胞中负责结肠粘膜中的炎症的两个主要亚群Th1(图11A)和中性粒细胞(图11B)的比例。进一步地，F4/80hi巨噬细胞以及IL-17和IFNγ产生T细胞的数量利用NX-13治疗极大减少了。结肠中调节性CD4+T(Treg)细胞(图11C)的比例也增加了。这些发现表明，NX-13能够恢复结肠炎小鼠的结肠中的炎性反应与抗炎反应之间的平衡。
实例16.NX-13在人外周血单核细胞中的功效
介绍
患有克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的人呈现出免疫细胞过度活跃，在胃肠道内局部地并且在血液内全身性地具有炎性亚群的高流行性。因此，从IBD患者的外周血中分离出的单个核细胞(PBMC)通常表现出在GI粘膜中观察到的许多稳健的炎性反应，所述稳健的炎性反应是由于其所暴露的环境以及个体的所有细胞内存在的遗传异常所致。在溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者的PBMC中测试了NX-13的翻译应用，以确定NX-13治疗在人细胞中的抗炎益处。
方法
PBMC分离.从临床上被分类为患有中度至重度疾病的男性和女性供体中获得样品。年龄和当前用药不用作排除标准。将全血收集到肝素化的真空管中。用无菌磷酸盐缓冲盐水将全血以1:3体积稀释。通过添加淋巴细胞分离培养基，然后以最大速度离心15秒而制备LeucoSep(Greiner)。将经过稀释的全血添加到LeucoSep管中。在离心(2000×g，20分钟)之后，用巴斯德移液管(Pasteur pipette)从中间相中收集PBMC。通过低渗裂解来裂解其余红细胞，并通过100μM细胞过滤器过滤悬浮液。将PBMC洗涤并重悬于无菌细胞培养基中，其中RPMI含有10％胎牛血清、2.5％Hepes溶液、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、1％丙酮酸钠和1％必需氨基酸(完整RPMI)。
细胞培养.在37℃下在完整RPMI培养基中，将靶细胞温育24小时。在浓度范围为1nM到100nM的NX-13存在下温育细胞。在二甲基亚砜(DMSO)中以100mM制备NX-13储备溶液，并在培养基中稀释到期望浓度。跨所有剂量和媒剂治疗中，将DMSO浓度调整为相等。在测定前六个小时，用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素刺激细胞以刺激细胞激活。在24小时时针对期望数据分析细胞。
流式细胞术.在收集之前，将细胞温育BD GolgiStop(2μL GolgiStop到3mL的总培养基)，以允许细胞因子的细胞内积累。以顺序方式用细胞外(CD45、CD3、CD4、CD8、CD11b)和细胞内(FOXP3、IL-10、IL-4、IFNγ、TNFα)对细胞进行活染色。在BD FACs Celesta上获取数据，并使用FACSDiva进行分析。从分析中排除了非活细胞和非单峰细胞。数据呈现为CD45+细胞的百分比或活的单峰％。
结果
在溃疡性结肠炎样品中，NX-13降低了TNFα(图12A)和IFNγ(图12B)产生CD4+T细胞的百分比，其中在两个群体中，在10nM或更高浓度下，均观察到显著降低。尽管在1nM下在TNF中未观察到显著降低，但降低的趋势与在较高浓度下观察到的趋势一致(图12A)。相反，甚至在1nM时也观察到IFNγ中的显著降低(图12B)。另外，NX-13减少了存在于每个细胞中的TNFα的量，如通过平均荧光强度以剂量依赖性方式所测量的。
与UC测试类似，在来自克罗恩氏病患者的PBMC中，NX-13在低至10nM的浓度下有力地减少了TNFα和IL-4产生CD4+T细胞(图13A和13B)。进一步地，在50nM和更高的浓度下NX-13治疗增加了IL10+CD4+T细胞的百分比(图13C)，这表明NX-13除了对效应CD4+T细胞的直接抗炎作用外，还能够以前调节方式起作用。在高于50nM NX-13的IFNγ+细胞中观察到剂量依赖性减少(图13D)。
这些结果表明，NX-13是用于激活人细胞中的NLRX1并且用于抑制炎性反应的活的小分子。
实例17.NX-43在腺癌小鼠模型中的功效
介绍
结肠直肠癌病例的百分之九十五为腺癌。腺瘤或息肉如果未在常规结肠镜检查中标识出，就可能会从上皮扩散到肠壁，并最终在运输到血液或淋巴后转移。根据美国癌症协会(American Cancer Society)，除了通常可以通过切除息肉或患病区域来治疗的1期结肠癌外，五年存活率很低，范围为2期癌的63-87％到4期癌的11％。明确证据表明，在癌症的发展中，还需要除了遗传不稳定性、无限增殖和凋亡抗性之外的其它促成因素。这些因素，如局部血管生成、代谢改变和免疫逃避，已引来了能够改善中、晚期中的预后的新一代癌症疗法。作为在肠道的免疫细胞和上皮细胞中都具有重要功能的免疫调节子，NLRX1可以作为用于治疗结肠直肠癌的有效靶标。
方法
小鼠模型.在后侧向成年BALB/c小鼠皮下注射5×106CT26癌细胞。从第9天开始，每天用NX-43通过强饲以40mg/kg对小鼠进行治疗。每天对小鼠称重，并且每3天测量肿瘤直径，直至第21天。尸体剖检时，收集肿瘤并称重。使用第二小鼠模型。在5周龄开始时，向APCmin/+小鼠施用含DSS的饮用水。在返回标准饮用水之前，用DSS对小鼠进行激发，持续总共5天。在DSS之后，用NX-43(40mg/kg)通过口服强饲对小鼠进行治疗，持续四周。四周之后，切除结肠并洗涤。对息肉的数量进行计数，并获得结肠重量。
基因表达.可以使用Qiagen RNeasy微型试剂盒生成来自肿瘤和淋巴结的总RNA。可以使用BioRad iScript cDNA合成试剂盒生成cDNA。可以通过用Taq DNA聚合酶对来自标准PCR反应的经过纯化的产物进行系列稀释，然后使用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化来生成标准曲线。可以用BioRad CFX96热循环仪上的SybrGreen supermix从定量实时PCR中获得表达水平，然后对β-肌动蛋白的表达进行归一化。可以针对标记免疫激活(如炎性细胞因子或表面受体)、免疫抑制(如CTLA-4、PD-1或ARG-1)以及肿瘤生长和转移的基因，测量基因表达。
组织病理学.可以由收集到10％经过缓冲的福尔马林中并包埋在石蜡中的组织制备经过H&E染色的肿瘤和淋巴结切片。可以由经过委员会认证的兽医病理学家通过Olympus显微镜检查载玻片，并用Image-Pro软件收集图像。可以针对肿瘤浸润白细胞的存在、坏死区域和增殖肿瘤细胞的比例对样品进行评分和评价。
流式细胞术.可以将肿瘤和淋巴结收集到含有胶原酶(300U/mL)和DNase(50U/mL)的RPMI/FBS缓冲液中，以用于消化。可以在37℃下在搅动下将组织消化，持续60分钟。可以通过100μm过滤器将所得细胞悬浮液过滤、离心(300×g，8分钟)，并在新鲜的RPMI中洗涤。在过滤所产生的单个细胞悬浮液之后，可以由覆盖到70％Percoll溶液上的Percoll梯度的含细胞的40％Percoll对免疫细胞进行纯化。离心之后，可以收集中间相并洗涤以获得富集的免疫细胞级分。在96孔板中，在连续的活的染色中，可以用细胞外抗体(CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、NK1.1、CD25、F4/80、CD11b、Gr1、CX3CR1、CD64、CD40、CTLA4)和细胞内抗体(Tbet、RORγT、FOXP3、IFNγ、IL17、IL10、颗粒酶B、iNOS)的混合物对细胞进行标记。可以使用具有FACSDiva软件的FACS Celesta流式细胞仪获取数据。
结果
CT26实体瘤模型是高免疫原性癌模型，使其成为新型疗法的评价中有价值的模型。相对于未经治疗的对照，NLRX1抑制剂(如NX-43)，减小了肿瘤的大小(图14A和14B)。显著地，在开始NX-43治疗后不到10天观察到肿瘤直径的减小。同时，在治疗12天之后，观察到整体肿瘤质量减少了70％以上。在结肠直肠癌的APCmin/+模型中(图15A和15B)，用NX-43进行的炎症后治疗减少了结肠息肉的数量和整体肿瘤负担(如结肠重量所证明的)。从组织学上讲，这些作用预期与肿瘤浸润白细胞的比例增加有关。免疫激活基因的表达预期将增加，而抑制性基因预期将下调。通过流式细胞术，预测抑制性细胞类型(如Treg或髓源性抑制细胞)的数量会减少，并且预测激活的细胞毒性T细胞和颗粒酶B+细胞的数量会增加。
实例18.NX-43在模型病毒感染中的功效
介绍
作为病毒核酸的传感器以及MAVS和STING通路的调节剂，NLRX1对病毒的反应至关重要。事实上，在流感、丙型肝炎、HIV和疱疹病毒的模型中已经标识了NLRX1在天然病毒应答中的重要性[7，9，12，14]。尽管病毒之间，整体免疫反应的复杂性有所不同，但是显然，NLRX1介导的机制存在于对I型干扰素的表达和病毒清除具有下游作用的每种病毒中。在此情况下，由特异性抑制剂抑制NLRX1预测会激活免疫反应，防止宿主逃避和免疫抑制，并启动病毒清除的通路。为了验证NX-43的功效，可以使用流感病毒感染的小鼠模型。
方法
小鼠模型.可以通过异氟烷吸入对八至十周龄的野生型C57BL/6小鼠进行麻醉。可以以350pfu/小鼠的激发滴度向小鼠鼻内注射A型流感(H1N1)[37]。可以每天通过强饲口服地或通过尾静脉注射静脉地利用NX-43以10、20和40mg/kg剂量对小鼠进行治疗。可以在14天内每天对小鼠进行称重并评分。可以在第3天、第7天、第11天和第14天对小鼠实施安乐死，以通过基因表达和流式细胞术测量肺部内病毒的滴度和免疫反应的产生。
病毒滴度.可以由未经治疗的和经过NX-43治疗的小鼠制备肺匀浆。MDCK细胞可以在六孔板内生长至汇合。暴露前可以从含有血清的培养基中洗涤细胞。病毒样品的系列稀释液可以在含有级分V BSA的无血清生长培养基中制备。可以将细胞在37℃下与1mL的病毒稀释液一起温育1小时。可以去除上清液，并且可以洗涤细胞。细胞可以用MEM琼脂混合物覆盖，并温育72小时。可以去除覆盖，并且可以用结晶紫对细胞染色。可以对具有至少50个噬菌斑的最低稀释液进行计数。
基因表达.可以使用Qiagen RNeasy微型试剂盒生成来自肺部的总RNA。可以使用BioRad iScript cDNA合成试剂盒生成cDNA。可以通过用Taq DNA聚合酶对来自标准PCR反应的经过纯化的产物进行系列稀释，然后使用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化来生成标准曲线。可以用BioRad CFX96热循环仪上的SybrGreen supermix从定量实时PCR中获得表达水平，然后对β-肌动蛋白的表达进行归一化。可以测量IL-6、干扰素α、干扰素β、Stat2、Oas1a、RIG-I和MAVS的基因表达。
流式细胞术.可以将肺部切成小块，并收集到含有胶原酶(300U/mL)和DNase(50U/mL)的RPMI/FBS/CaCl2缓冲液中，以用于消化。可以在37℃下在搅动下将组织消化60到90分钟。可以通过100μm过滤器将所得细胞悬浮液过滤、离心(300×g，8分钟)，并在新鲜的RPMI中洗涤。可以通过低渗裂解对红细胞进行裂解并通过过滤去除。可以洗涤细胞并将其铺板，以用于流式细胞术染色。在96孔板中，在连续的活的染色中，可以用细胞外抗体(CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、NK1.1、CD25、F4/80、CD11b、CD11c、Gr1、CX3CR1、CD64、SiglecF、Ly6C)和细胞内抗体(Tbet、RORγT、FOXP3、IFNγ、IL6、IL10、IFNb)的混合物对细胞进行标记。可以使用具有FACSDiva软件的FACS Celesta流式细胞仪获取数据。
结果
NX-43在此A型流感感染模型中的主要功效可以是对病毒滴度的评价。利用NLRX1的抑制，预计到更大的免疫激活和干扰素反应，所述更大的免疫激活和干扰素反应预测会降低肺部中病毒的水平，并提供比未经治疗的小鼠早的清除。如前所述，此清除预测通过增加1型干扰素和炎性细胞因子(如IL-6)的表达来实现。促进的病毒清除预测会引起在感染的初始阶段之后更快的体重恢复。激活的免疫反应预测会引起感染期间肺部中的更高百分比的炎性T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。
实例19.NX-13在作为模型细菌感染的艰难梭菌感染中的功效
介绍
艰难梭菌感染是难以治疗的肠内感染，这是由于与抗生素的使用、耐抗生素菌株的出现和高复发率相关联。艰难梭菌可以通过由天然共生细菌菌株促进的竞争性抑制来控制。为了促进这些细菌在抗生素之后再生长，NLRX1的激活预测将调节朝致耐受性环境的免疫反应。为了验证NX-13的功效，可以使用艰难梭菌感染的小鼠模型。
方法
小鼠模型.可以通过强饲口服地使野生型C57Bl/6小鼠感染艰难梭菌。可以每天通过强饲口服地或通过尾静脉注射静脉地利用NX-13以10、20和40mg/kg剂量对小鼠进行治疗。可以在12天内每天对小鼠进行称重并评分。可以在第4天、第8天和第12天对小鼠实施安乐死，以通过基因表达和流式细胞术测量测量肠道内的艰难梭菌计数和免疫反应的产生。
艰难梭菌计数.可以由未经治疗的和经过NX-43治疗的小鼠制备粪便匀浆，并且可以使用标准方法确定艰难梭菌的计数。
基因表达.可以使用Qiagen RNeasy微型试剂盒生成来自肠道的总RNA。可以使用BioRad iScript cDNA合成试剂盒生成cDNA。可以通过用Taq DNA聚合酶对来自标准PCR反应的经过纯化的产物进行系列稀释，然后使用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化来生成标准曲线。可以用BioRad CFX96热循环仪上的SybrGreen supermix从定量实时PCR中获得表达水平，然后对β-肌动蛋白的表达进行归一化。可以测量IL10、IL6、S100A8、S100A9和DefB1的基因表达。
流式细胞术.可以将肠道切成小块，并收集到含有胶原酶(300U/mL)和DNase(50U/mL)的RPMI/FBS/Hepes缓冲液中，以用于消化。可以在37℃下在搅动下将组织消化，持续60分钟。可以通过100μm过滤器将所得细胞悬浮液过滤、离心(300×g，8分钟)，并在新鲜的RPMI中洗涤。可以通过低渗裂解对红细胞进行裂解并通过过滤去除。可以洗涤细胞并将其铺板，以用于流式细胞术染色。在96孔板中，在连续的活的染色中，可以用细胞外抗体(CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、NK1.1、CD25、F4/80、CD11b、CD11c、Gr1、CX3CR1、CD64、SiglecF、Ly6C)和细胞内抗体(Tbet、RORγT、FOXP3、IFNγ、IL6、IL10、IL17)的混合物对细胞进行标记。可以使用具有FACSDiva软件的FACS Celesta流式细胞仪获取数据。
结果
NX-13在此艰难梭菌感染模型中的主要功效可以是对肠道中的细菌计数的评价。随着NLRX1的激活，预期更高的免疫耐受性和IL-10反应，这会通过增强共生菌株的再生长来降低肠道中的病原菌的水平。通过此增强的耐受性，预期由于相对于经过治疗的小鼠的结肠中的Th17细胞的增强的Treg反应而引起较低水平的组织损伤。随着Th17的减少，预期更低的结肠中性粒细胞和抗菌肽的表达。NX-13诱导的免疫学和微生物变化预期将减少体重减轻和疾病活性评分，从而允许减轻疾病的严重度并加速恢复。
实例20：用于治疗1型糖尿病(T1D)的NX-13的用途
介绍
NX-13和NLRX1的其它激动剂预测可有效治疗1型糖尿病。
方法
小鼠.可以从杰克逊实验室(Jackson Laboratory)购买NOD小鼠，并在无特异性病原体的条件下圈养在通风的架子中。可以将小鼠维持在动物设施中。所有实验方案将由机构动物护理和使用委员会批准，并将达到或超过国家卫生研究院实验动物福利办公室(National Institutes of Health Office of Laboratory Animal Welfare)和公共卫生局(Public Health Service)政策的指导方针。
体重和葡萄糖耐受性的评估。在开始研究之前，可以确定所有小鼠为血糖正常的(空腹血糖水平低于250mg/dl)并且体重相似(20±1.5g)。可以每周对小鼠称重并由不知情的观察者检查疾病的临床征象。标准的12小时禁食之后，可以使用
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血糖仪(印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN))测量葡萄糖。可以通过侧尾静脉收集血液并将血液放置在毛细血管血液收集管上。
组织病理学.可以将小鼠中的来自NOD研究的胰腺切片固定在10％缓冲中性福尔马林中，之后包埋在石蜡中，并且然后切片(5μm)，并用H&E染色进行染色，以用于组织学检查。切片可以根据淋巴细胞浸润、细胞损伤和组织糜烂而以0-4的评分进行评级，并且可以将数据作为归一化的复合评分进行分析。
统计分析.参数数据可以使用ANOVA，然后使用雪费多重比较方法(Scheffe'smultiple comparison method)来分析。非参数数据可以通过使用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney's U test)，然后使用杜恩多重比较检验(Dunn's multiple comparisons test)进行分析。ANOVA可以通过使用SAS，6.0.3版(SAS研究所(SAS Institute))的一般线性模型程序执行。统计学上的显著性可以评估为P≤0.05。
结果
NX-13预测可在1型糖尿病的小鼠模型中降低空腹血糖水平，并增加胰岛素。
为了确定NX-13在调节T1D小鼠模型中的血糖水平中的作用，可以在研究开始后的第0周、第1周、第3周、第4周、第5周、第10周和第11周执行空腹血糖测试。结果预期会显示，禁食12小时的时间段之后，用NX-13治疗的小鼠的血液中的葡萄糖水平如何降低。并行地，可以在第5周评估胰岛素水平，并且结果预期会显示用NX-13治疗的小鼠的血浆中的胰岛素水平如何显著增加。
NX-13预期可改善小鼠NOD模型中的临床组织病理学胰腺病变和炎症。为了评估T1D的小鼠模型中的组织病理学病变，可以收集胰腺并用10％福尔马林固定胰腺。然后可以用H&E对胰腺切片染色并在显微镜下观察。结果预期会显示，与经过媒剂治疗的小鼠相比，用NX-13的治疗可如何显著减少小鼠的胰腺中的临床组织病理学病变。
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Claims (23)

1.一种式Z化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物具有A环、B环、C环和D环，其中：
Z为：
Figure FDA0003540886950000011
在每种情况下，X独立地为CH；
在每种情况下，Y独立地选自由NH、O、S、CH2和C(O)组成的组，条件是D环和A环之间的Y是O；
在每种情况下，A1、A2、A3和A4是C；
在每种情况下，A5为N；
R1、R3和R4各自独立地选自：由氢、羟基、卤基、氨基和C1-6烷基组成的组，条件是R1和R4中的至少一个不为氢，每个R1是相同的，每个R3是相同的以及每个R4是相同的；
在每种情况下，R2为氢；并且
在每种情况下，R5不存在。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R4不为氢。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中R4是C1-C6烷基。
4.根据权利要求2所述的化合物，其中R4为甲基。
5.根据权利要求2所述的化合物，其中R1和R3为氢。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中R4为C1-C6烷基。
7.根据权利要求5所述的化合物，其中R4为甲基。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中每个Y为O。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中R4不为氢。
10.根据权利要求9所述的化合物，其中R4为C1-C6烷基。
11.根据权利要求9所述的化合物，其中R4是甲基。
12.根据权利要求9所述的化合物，其中R1和R3为氢。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中R4为C1-C6烷基。
14.根据权利要求12所述的化合物，其中R4为甲基。
15.化合物，所述化合物选自：
Figure FDA0003540886950000021
16.权利要求1-15所述的化合物在制造用于治疗病状的药物组合物的用途，其中所述病状选自由以下组成的组：炎性、免疫介导的或慢性胃肠疾病；糖尿病；和细菌感染，其中炎性、免疫介导的或慢性胃肠疾病选自由炎性肠病和肠易激综合征所组成的组。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述病状为炎性肠病。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述炎性肠病为溃疡性结肠炎。
19.根据权利要求17所述的用途，其中所述炎性肠病为克罗恩氏病。
20.根据权利要求16所述的用途，其中所述病状为肠易激综合征。
21.根据权利要求16所述的用途，其中所述病状为1型糖尿病。
22.根据权利要求16所述的用途，其中所述病状为细菌感染。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述细菌感染为艰难梭菌感染。
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